精制冠心颗粒提取工艺的研究

基金项目:陕西省社发攻关资助项目(2008K16-04) 1精制冠心颗粒提取工艺的研究　李巧如，郭萍，宋文惠，　赵波　（陕西省人民医院药剂科，西安市　７１００６８）　［摘要］　目的：优选精制冠心颗粒的提取工艺。方法：采用粉碎提取法和回流提取法，以丹参酮ⅡＡ、丹酚酸Ｂ　、芍药苷、阿魏酸、羟基红花黄色素Ａ含量及出膏率为指标，优选精制冠心颗粒的最佳提取工艺。结果：最优提取工艺为取精制冠心方药材粗粉，第一次加６倍量９５％乙醇，粉碎提取１０ｍｉｎ，第二次加６倍量６０％乙醇，粉碎提取１０ｍｉｎ，第三次加６倍量２０％乙醇，粉碎提取１０ｍｉｎ。结论：精制冠心颗粒湿法粉碎提取工艺，各成分提出量比原工艺明显提高，节约时间、操作简单。　［关键词］　湿法粉碎提取；工艺研究　精制冠心颗粒是２００５版药典收载品种，由丹参、赤芍、川芎、红花、降香五味药材组成，主要功能为行气活血，化瘀通脉。颗粒剂提取工艺是水煎煮提取，主要提取水溶性成分。但其行气活血、化瘀通脉的主要有效成分包括有以丹参酮ⅡＡ为代表的脂溶性成分和以阿魏酸、羟基红花黄色素Ａ等为代表的水溶性成分。因此，本研究采用粉碎提取［１］、乙醇回流提取与原工艺进行比较，以得到制剂的最佳提取工艺。　１ 材料 岛津１０Ａ－ｖｐ高效液相色谱仪：包括ＳＰＤ－Ｍ１０Ａｖｐ二极管阵列检测器、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＣＬＡＳＳ　ＶＰ色谱工作站。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ　Ｃ１８色谱柱（　１５０　ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）（日本株式会社）。高速组织捣碎机（上海标本模型厂）。　丹参、川芎、赤芍（均系陕西产）、红花（浙江产）、降香（云南产），以上药材均购自陕西省药材公司。 对照品 丹参酮ⅡＡ（　批号：１１０７６６－２００４１６），丹酚酸Ｂ（批号：１１５６２－２００６０５），芍药苷（０７３６－２０００１４　），阿魏酸（批号：１１０７１５－２００２１２）　羟基红花黄色素Ａ（批号：１１１６３７－２００５０３），由中国药品生物制品检定所提供。乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。　２ 方法与结果　２．１ 提取方法 称取２％处方量药材，即：丹参９．１２ｇ、　赤芍４．５６ｇ、　川芎４．５６ｇ、　红花４．５６ｇ、降香３．０４ｇ，共２５．８４ｇ。５份。分别按下述方法提取三次。第一次加６倍量９５％乙醇，第二次加６倍量６０％乙醇，第三次加６倍量２０％乙醇（均匀设计优选的最佳工艺条件，另文发表）。提取液于　５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，每次提取液用相应溶剂定容于２００ｍｌ量瓶中，用于丹参酮ⅡＡ、丹酚酸Ｂ、芍药苷、阿魏酸、羟基红花黄色素Ａ及出膏率的测定。　基金项目:陕西省社发攻关资助项目(2008K16-04) 2湿法粉碎提取法：取药材粗粉，加不同浓度乙醇进行粉碎（１万ｒ／ｍｉｎ）提取，每次１０ｍｉｎ。　回流提取法：取３份药材，分别加不同浓度乙醇进行提取。第一份每次提取１．５ｈ；　第二份每次提取２．０ｈ；　第三份每次提取２．５ｈ。　原工艺：取处方中除红花外的四味药材，加６倍量水煎煮三次，第一次２ｈ，第二次１．５ｈ，第三次１ｈ，滤过，合并滤液。红花加６倍量水８０℃温浸二次，第一次２ｈ，第二次１ｈ，滤过，滤液与上述滤液合并，定容于５００ｍＬ量瓶中，同前方法，测定各成分含量。　２．２ 各成分含量测定　参考中国药典２００５版一部各药材项下方法，将各提取液以相应溶剂配制成相应浓度，以丹参酮ⅡＡ、丹酚酸Ｂ、芍药苷、阿魏酸、羟基红花黄色素Ａ为对照品，用高效液相色谱法测定。　２．２．１ 色谱条件 Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ　Ｃ１８色谱柱；丹参酮ⅡＡ流动相乙腈－水（７２：２８），检测波长２７０ｎｍ；丹酚酸Ｂ流动相乙腈－０．２％甲酸溶液（３０：７０），检测波长２８６ｎｍ；芍药苷流动相乙腈－水（１５：８５），检测波长２３０ｎｍ；阿魏酸流动相乙腈－０．１％磷酸溶液（２３：７７），检测波长３１６ｎｍ；羟基红花黄色素Ａ流动相甲醇－乙腈－０．７％磷酸溶液（２６：２：７２），检测波长４０３ｎｍ；　柱温均２５℃；流速１ｍＬ・ｍｉｎ－１．　。　２．２．２ 对照品溶液的制备 精密称取干燥的丹参酮ⅡＡ对照品适量，加甲醇制成２０μｇ・ｍＬ　－１的溶液，即得；芍药苷对照品适量，加甲醇制成３９．９μｇ・ｍＬ　－１的溶液，即得；丹酚酸Ｂ对照品适量，加７５％甲醇制成５５μｇ・ｍＬ　－１的溶液，即得；阿魏酸对照品适量，加７０％甲醇制成１０．６μｇ・ｍＬ　－１的溶液，即得；羟基红花黄色素Ａ加２５％甲醇制成２０μｇ・ｍＬ　－１的溶液，即得。　２．２．３线性关系考察 丹参酮ⅡＡ 精密吸取各浓度丹参酮ⅡＡ对照品溶液１０μＬ注入液相色谱仪（丹参酮ⅡＡ含量为０．０２５、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４μｇ），记录色谱峰面积，以丹参酮ⅡＡ的量（Ｙ）为纵坐标，　峰面积（Ｘ）为横坐标，进行线性回归分析，得回归方程：Ｙ＝１Ｅ－０７Ｘ＋０．０１１８，ｒ＝０．９９９３。表明丹参酮ⅡＡ在０．０２５～０．４μｇ量之间，峰面积与进样量呈良好的线性关系。　丹酚酸Ｂ 精密吸取各浓度丹酚酸Ｂ对照品溶液１０μＬ注入液相色谱仪（丹酚酸Ｂ含量为０．１１、０．２２、０．４４、０．６６、０．８８、１．１μｇ），记录色谱峰面积，以丹酚酸Ｂ的量（Ｙ）为纵坐标，　峰面积（Ｘ）为横坐标，进行线性回归分析，得回归方程：Ｙ＝４Ｅ－０７Ｘ－０．００２１，ｒ＝０．９９９４。表明丹酚酸Ｂ在０．１１～１．１μｇ量之间，峰面积与进样量呈良好的线性关系。　芍药苷 精密吸取各浓度芍药苷对照品溶液１０μＬ注入液相色谱仪（芍药苷含量为０．１９９５、０．３９９、０．５９８５、０．７９８、０．９９７５、１．１９７μｇ），记录色谱峰面积，以芍药苷的量（Ｙ）为纵坐标，　峰面积（Ｘ）为横坐标，进行线性回归分析，得回归方程：　Ｙ＝６Ｅ－０７Ｘ＋０．００１６，ｒ＝１。表明芍药苷在０．１９９５～１．１９７μｇ量之间。　基金项目:陕西省社发攻关资助项目(2008K16-04) 3阿魏酸 精密吸取各浓度阿魏酸对照品溶液１０μＬ注入液相色谱仪（阿魏酸含量为０．０１５９、０．０３１８、０．０６３６、０．０９５４、０．１２７２、０．１５９μｇ），记录色谱峰面积，以阿魏酸的量（Ｙ）为纵坐标，　峰面积（Ｘ）为横坐标，进行线性回归分析，得回归方程：得回归方程：Ｙ＝２Ｅ－０７Ｘ－０．００１６，ｒ＝０．９９９４。表明阿魏酸在０．０１５９～０．１５９μｇ量之间，峰面积与进样量呈良好的线性关系。　羟基红花黄色素Ａ 精密吸取各浓度羟基红花黄色素Ａ对照品溶液１０μＬ注入液相色谱仪（羟基红花黄色素Ａ含量为０．０６、０．１２、０．１８、０．３６、０．４８、０．６μｇ），记录色谱峰面积，以羟基红花黄色素Ａ的量（Ｙ）为纵坐标，　峰面积（Ｘ）为横坐标，进行线性回归分析，得回归方程：　Ｙ＝２Ｅ－０７Ｘ－０．０１５６，ｒ＝０．９９９８。表明羟基红花黄色素Ａ在０．０６～０．６μｇ量之间，峰面积与进样量呈良好的线性关系。　２．２．４　供试品溶液的制备 精密吸取上述各提取液５ｍＬ置１０ｍＬ容量瓶中，加相应的溶剂至刻度，摇匀，用０．４５μｍ微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。同时取各药材按中国药典２００５版一部项下方法制备药材供试品溶液，依法测定各成分含量（其中川芎药材中阿魏酸含量测定参考当归药材项下方法）。　２．２．５ 测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液５～１０μＬ，注入高效液相色谱仪，测定，将所得值与药材含量相比，计算提取转移率（％），即得。结果见表１。　２．３ 出膏率测定　分别精密量取各提取液２０ｍＬ，置已恒重的干燥蒸发皿中，水浴蒸干，于１０５℃干燥３ｈ，取出，置于干燥器中放置３０ｍｉｎ，取出称重，计算。结果见表１。 基金项目:陕西省社发攻关资助项目(2008K16-04) 4表１ 提取工艺试验结果 评　价　指　标（％）　提取方法 丹参酮ⅡＡ 丹酚酸Ｂ 芍药苷 阿魏酸 羟基红花黄色素Ａ 出膏率 粉碎法 第１次 ６７．５０ １．６６ ７２．３０ ３９．７３ １１．０ 第２次 １３．９５ ７２．４２ ２９．４０ ５２．１５ ７６．８３ 第３次 ０ ６．９５ ４．８１ ５．８６ １７．１８ 合 计 ８１．４６ ８１．０４ １０６．５１ ９７．７３ １０５．０１ ３２．１１　回流１．５ｈ第１次 ６３．３６ １９．７６ ６７．９０ ５８．９８ １６．５７ 第２次 １５．４７ ４６．０６ ２８．８１ ３２．６９ ６０．３５ 第３次 ０ １３．５６ ７．５５ ６．６６ １８．６９ 合 计 ７８．８３ ７９．３９ １０４．２６ ９８．３３ ９５．６０ ３１．７６　回流２．０ｈ第１次 ６１．４５ １６．７７ ６９．４９ ５８．７８ １５．８６ 第２次 １５．６２ ４４．４８ ２９．２４ ３３．３３ ５８．１８ 第３次 ０ １５．９６ ７．３５ ６．８６ ２０．１２ 合 计 ７７．０７ ７７．２０ １０６．０８ ９８．９８ ９４．１６ ３２．３８　回流２．５ｈ第１次 ５９．９９ １４．７０ ７０．７４ ５７．９３ １６．１１ 第２次 １６．９８ ４３．１２ ３０．８６ ３１．３０ ５１．３６ 第３次 ０ １５．９１ ７．５１ ６．２１ １５．１７ 合 计 ７６．９７ ７３．７３ １０９．１２ ９５．４５ ８２．６４ ３３．２８　原工艺 ０ ３．６４ １１３．８６ ９２．４６ ９８．１６ ３３．６９ 试验结果显示，丹参酮ⅡＡ、丹酚酸Ｂ、阿魏酸和羟基红花黄色素Ａ均以粉碎提取法提取率最高；丹参酮ⅡＡ和丹酚酸Ｂ在原工艺几乎不被提出；阿魏酸在原工艺中提出量低于其它几种方法；芍药苷提取率以原工艺略高，但与其它方法间无显著性差异；出膏率以原工艺最高。因此，确定精制冠心颗粒最佳提取工艺为：第一次加６倍量９５％乙醇粉碎提取１０　ｍｉｎ，第二次加６倍量６０％乙醇粉碎提取１０ｍｉｎ，第三次加６倍量２０％乙醇粉碎提取１０ｍｉｎ，离心，取上清液，合并，即得。　３ 讨论　中药有效成分的提取效率与提取所用溶媒的性质、药材粒度、温度、压力等有关。药材粒度越小，基金项目:陕西省社发攻关资助项目(2008K16-04) 5比表面积越大，浸取速度越快；温度和压力升高，扩散速度加快，浸出速度也加快；固液相对运动速率越高，溶液的湍动越强烈，使边界层变薄，更新加快，提高浸出速度。湿法粉碎提取法系将药材粗粉在溶媒存在下高速粉碎，加速组织、细胞破碎，使渗透、溶解、扩散更容易。　本研究以丹参有效成分丹参酮ⅡＡ　及丹酚酸Ｂ　，赤芍有效成分芍药苷，川芎有效成分阿魏酸（因难以建立川芎嗪的色谱条件，所以只选阿魏酸），红花有效成分羟基红花黄色素Ａ及出膏率为考察指标，对精制冠心颗粒提取工艺进行研究。数据表明，其中丹参酮ⅡＡ、丹酚酸Ｂ、阿魏酸和羟基红花黄色素Ａ均以不同浓度乙醇粉碎提取法提取率最高，芍药苷提取率与原工艺差别不大。而丹参酮ⅡＡ和丹酚酸Ｂ在原工艺几乎不被提出。由于丹参酮ⅡＡ、丹酚酸Ｂ、阿魏酸和羟基红花黄色素均受热不稳定，所以，随着加热时间的延长，提取率逐渐降低。而湿法粉碎提取不需加热，避免了有效成分被破坏，与先前的单味药研究结论［１］相同，说明湿法粉碎提取可用于精制冠心颗粒中有效成分的提取。若要用于大生产，需研制相关的粉碎设备。目前可将工艺改为用６倍量不同浓度乙醇（９５％、６０％、２０％）回流提取三次，每次１．５ｈ，可充分提取出各类有效成分。　精制冠心颗粒原工艺中只有芍药苷提出量略高于其它几种方法。其有效成分与药效学的相关性值得进一步研究。 参考文献％　［１］　李巧如，宋文惠，廉江平，等．湿法粉碎提取３种中药有效成分的研究．中国中药杂志，２００８，３３（１２）：１３９３ Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｈａｔｔｅｒｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｊｉｎｇｚｈｉｇｕａｎｘｉｎ　ｗｉｔｈ　Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｍｅｔｈｏｄ　ＬＩ　Ｑｉａｏｒｕ　，　Ｇｕｏ　Ｐｉｎｇ　，Ｓｏｎｇ　Ｗｅｎｈｕｉ，Ｚｈａｏ　Ｂｏ（Ｄｅｐｔ．　ｏｆ　ｐｈａｒｍａｃｙ　，Ｓｈａｎｎｘｉ　Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｘｉ’ａｎ　７１００６８）　［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：　Ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｊｉｎｇｚｈｉｇｕａｎｘｉｎ．　Ｍｅｔｈｏｄ：Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｈａｔｔｅｒｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ａｎｄ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｈｅａｔｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｊｉｎｇｚｈｉｇｕａｎｘｉｎ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ　ⅡＡ，　ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　Ｂ，　ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ　，ｆｅｒｕｌａｔｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒ　ｙｅｌｌｏｗ　Ａ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｗａｓ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：　ａｄｄｉｎｇ　６　ｔｉｍｅｓ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　９５％ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｏｒ ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｔｉｍｅ，　ａｄｄｉｎｇ　６　ｔｉｍｅｓ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　６０％ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｏｒ ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｔｉｍｅ，　ａｄｄｉｎｇ　６　ｔｉｍｅｓ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　２０％ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｈｉｒｄ　ｔｉｍｅ，　ｓｈａｔｔｅｒｉｎｇ　ｆｏｒ　１０　ｍｉｎｕｔｅｓ　ｅｖｅｒｙ　ｔｉｍｅｓ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｉｓ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，　ｓａｖｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ．