04细菌病毒培养技术52页PPT

细胞培养方法悬浮培养通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞
动物增殖病毒技术 禽胚增殖病毒技术 细胞增殖病毒技术
一、动物增殖病毒技术
选择动物的标准：
①大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、 青壮年和健康(经临床检查、检疫)； ②对相应病毒易感，并十分敏感； ③经隔离饲养和观察检查证明健康； ④家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标 准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确， 并符合普通级实验动物标准； ⑤体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。
有些病毒不产生CPE。 病毒收获：CPE达80％时收获，反复冻融多次使病毒释放，
然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20℃保存。 病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA
疫苗制造工艺流程
病毒性细胞疫苗制造工艺流程
病毒性组织疫苗制造工艺流程
细菌疫苗和类毒素制造工艺流程
寄生虫疫苗制备的工艺流程
(1) 细菌污染 (2) 真菌污染：念珠菌或酵母菌。
培养液中可见黄白色小点状悬浮物 镜检时可见菌丝结构。 (3) 支原体污染：污染率为50％～60％ (4) 病毒污染 ①组织带毒 ②培养液带毒
5. 细胞培养病毒要素
（1）血清 ：维持液内犊牛血清含量一般不超过2％。 （2）温度：狂犬病病毒32℃，犬疱疹病毒36℃。 （3）pH： （4）病毒接种剂量：应以TCID50为依据
猴微肾载细 体 • 胞培量养为的血容30器万清为／特m替l制的代生物因反应子器，：有自激动化素装置和。 生长因子（如胰岛素、上皮生长因
应RP无M特I-1定64病0、原子1的99母）、源抗、体，结合蛋白（如转铁蛋白）、贴壁因子（如鱼精蛋白、

细菌培养与接种技术 课件
演讲人
01 细菌培养技术 02 细菌接种技术
03 细菌培养与接种的应用
目录
1 细菌培养技术
培养基的选择
01
02
营养成分：选 择含有丰富营 养成分的培养 基，如蛋白质、 碳水化合物、 维生素等
酸碱度：选择 适合细菌生长 的酸碱度，如 中性或弱碱性
03
渗透压：选择 与细菌细胞渗 透压相近的培 养基，以保持 细菌细胞的正 常生长
2
接种：将细菌接种到培养基上，如划线法、涂布法等
3
培养：将接种后的培养基放入培养箱中，设定合适的温度、湿度和时间
4
观察：定期观察细菌的生长情况，如菌落形态、颜色等
5
收获：当细菌生长到一定数量时，可进行收获，如离心、过滤等
6
保存：将收获的细菌进行冷冻保存，如-80℃冰箱保存
2 细菌接种技术
接种方法的选择
02
04
细菌培养与接 种在生物制药 中的其他应用
03
细菌培养与接 种在抗生素生 产中的作用
环境监测
细菌培养与接种技术
01
在环境监测中的应用
细菌培养与接种技术
04
在环境评估中的应用
细菌培养与接种技术在
02
环境污染检测中的应用
03
细菌培养与接种技术菌培养与接种 的应用
微生物检测
2019
检测方法：培 养法、PCR法、
免疫法等
2021
检测结果：指导 生产、质量控制、
风险评估等
01
02
03
04
应用领域：食品、 药品、环境、生
物技术等
2020
检测目的：确 定微生物种类、

20
目的要求
掌握从环境中分离培养细菌的方法，从 而获得若干种细菌纯培养技能。 掌握几种接种技术。
21
实验材料
无菌培养皿(直径90mm)10套、无菌移液管1mL2
支、10mL1支。
营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶， 无菌稀释水90mL1瓶、9mL5管。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。
22
c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放 在37℃恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。
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实验程序4
（培养基和玻璃器材的灭菌方法）
过滤除菌法： 不能用加热灭菌的 液体物质（如维生 素、血清），一般 可用细菌过滤器进 行除菌。
19
第二部分 细菌纯种分离、培养和接
种技术
目的要求 实验材料 实验程序
9
实 验 程 序2
（培养基的配制方法和步骤） 3. 调pH值：用10％ NaOH调pH至7.6，用精 密pH试纸对照。 4. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部 倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意 不要污染棉塞和瓶口。 5. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 6. 灭菌备用：培养基灭菌后必须在37℃下恒 温培养24h，确定无菌生长，方可使用。
实验二
细菌培养基的配制、灭 菌及接种、培养技术
1
第一部分 细菌培养基的制备、灭菌
目的要求 实验材料 实验程序
2
目的要求
熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 掌握培养基和无菌水的制备方法。 掌握高压蒸气灭菌技术。
3
实验材料
药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。
高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。 其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻 璃珠等。

一個菌落可由單個或許多個細胞繁殖而獲得，若是一個菌落 是經由單一細胞繁殖而來，則他就是一個純種細胞群或稱選殖 體(clone)。菌落已被廣泛地應用於菌種的分離、純化、選育 等方面，在基因工程中也普遍。
第十八页，共53页。
(五)微生物群體生長的規律
➢ 生長曲線(The growth curve)
微生物群體是只單一純培養微生物的群體(population)，而群 體生長常被用為研究一微生物培養的生長曲線(growth curve)之 分析研究，並採用分批培養(batch culture)或密閉系統來進行。
第九页，共53页。
1. 選擇培養基
選擇培養基有經由加入抑制非目的的微生物，但 不妨礙目的微生物的物質，已達到選擇的目的，常 用之抑制劑(物質)有抗生素和染料，例如分離真菌 用之培養基常加入抑制細菌生長的鏈黴素獲金黴素。 有時為培養的某種微生物，就在培養基中加入目的 微生物特別需要的營養物質，使培養基營養更優厚， 以達到選擇的目的，這種選擇培養基即已提過的優 厚或富集培養基。
穩定期穩定期stationphasestationphase一世代時間約為二十分鐘然而事實上這種情況並未發一世代時間約為二十分鐘然而事實上這種情況並未發生因在一個密閉的系統中的分批培養微生物的對數生因在一個密閉的系統中的分批培養微生物的對數低世代時間延長細胞活力衰退而進入穩定期低世代時間延長細胞活力衰退而進入穩定期stationphasestation殖的細胞數目與死亡的細胞數目相等總數量達最大值殖的細胞數目與死亡的細胞數目相等總數量達最大值由于在生長過程中隨著微生物細胞的生長和數目的由于在生長過程中隨著微生物細胞的生長和數目的增加營養物質不斷被消耗而不能晚族生長需求毒物增加營養物質不斷被消耗而不能晚族生長需求毒物的逐漸累積達到抑制生長的程度以及氧和的逐漸累積達到抑制生長的程度以及氧和phph等條件失去平衡使得生理旺盛的細胞轉為老化細胞代謝活力去平衡使得生理旺盛的細胞轉為老化細胞代謝活力鈍化細胞內核糖體減少rnarna和蛋白質合成也減緩和蛋白質合成也減緩因而細胞的生長變得不平衡細胞的形狀有的也發生改因而細胞的生長變得不平衡細胞的形狀有的也發生改變

（4）细胞生长状况的观察
• 原理： 应每日或隔日观察一次细胞，及时了
解细胞形态、数量及培养液pH值、污染与 否等情况，以便采取相应的措施处理。
肉眼观察 显微镜观察
（5）细胞的冻存
• 传代细胞应有充足的冻存储备。 • 一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的
绝种。 • 二则防止细胞因传的代次太多，造成细胞
• 5 12h后观察细胞病变，若无明显病变，则每隔3h 观察一次。当有70%细胞发生病变后，将细胞液 反复冻融3次，用吸管反复吹打数次，使病毒完全 从细胞中释放出来
正常形态的鸡胚成纤维细胞
接毒后发生病变的鸡胚成纤维细胞
（4）效价测定
某些病毒具有凝集某种哺乳动物红细胞 的特性，利用该特性而进行的试验称为病 毒的血凝试验。
病毒的细胞培养
• 一 基本原理 • 二 细胞培养的基本概念 • 三 主要优点 • 四 培养实验用品的前期处理 • 五 培养细胞的生长方式及类型 • 六 细胞培养的实验步骤 • 七 病毒的细胞培养
一 基本原理
• 通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体 取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。 模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增 值。
操作步骤
将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 用1-2ml营养液或PBS缓冲液，清洗培养瓶，倒出 加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，当看到培养瓶上含有 一两个小空斑，也可看到有灰白色浑浊时，将胰酶倒掉 加入培养液，用移液管吹洗贴有细胞的一面，将细 胞从培养瓶壁上吹下来
七 病毒的细胞培养
• 以禽流感感染鸡胚成纤维细胞为例。 • （1）病料的处理 • （2）病毒分离、繁殖 • （3）细胞病变的观察 • （4）效价测定 • （5）中和实验

5、一周后观察，记录实验结果。 请你根据生物学原理对六瓶中食品的
变化情况作一预测，并简述理由。
细菌培养的基本技术课件
32
答：A、B、F、肉汤不会腐败；因A瓶高浓 度盐抑制微生物的生长和繁殖；B瓶高浓度 的有机酸也能抑制微生物的生长和繁殖；F 低温抑制了微生物的生长和繁殖；
E肉汤在短时间内基本不会变质；但可 能有少许低温型微生物能生长繁殖；
细菌培养的基本技术课件
26
6、微生物接种时各项操作必须在___无__菌____条件 下进行.因此必须在___无__菌__箱____中操作.接种环境 在___酒__精__灯____上用灼烧去灭菌,双手用___7_5___%
的酒精消毒. 7、接种时将灭菌的接种环挑取少许___菌__体___,迅 速插入培养基试管里,在斜面上由_____里____向 ___外_____连连续划几道___蛇__形__细___线,然后将试管 口在火焰上灼烧,塞上____棉__塞_______.
下列有关①和②所用棉塞的特点及其作用的说法，
正确的是（
）D
A、二者用的都是脱脂棉，可以防止水分吸附
B、二者的都不是脱脂棉，有利于水分的吸附
C、②所用的棉塞应该比①更紧，以防杂菌污染
D、①所用的棉塞应该比②更紧，以防滤液蒸发
细菌培养的基本技术课件
9
6．包扎 每10支试管用线绳捆成一 捆，并且在管口外面包上一层牛皮 纸，然后，用线绳扎好。在每捆试 管外挂上标签，注明培养基名称、 配制日期和制作者姓名
细菌培养的基本技术课件
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二、灭菌 1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取 出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平 齐为宜。高压蒸汽灭菌锅的构造如右下图所 示。
细菌培养的基本技术课件

• 哥伦比亚血平板—营养要求高的细菌 • 巧克力平板—含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑
膜炎球菌和淋球菌用
• 中国蓝/麦康凯平板—G-杆菌用 • SS平板—沙门氏菌和志贺氏菌用 • M-H平板—细菌药敏用 • TCBS平板—弧菌科细菌用 • 沙包氏平板—真菌培养用
• 真菌显色平板—真菌培养用 • 罗氏培养基—分枝杆菌用
奈瑟氏菌属有11个种，临床就淋病奈 菌和脑膜炎奈瑟菌 最为重要
奈瑟氏菌属鉴定流程
菌落观察：灰色、湿润、透明或半透明、不溶血
涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状
氧化酶试验+ 触酶+
+
麦芽糖 --
脑膜炎奈瑟菌
淋病奈瑟菌
细菌的鉴定与药敏
卫生部重点监控的6种MDRO
MASA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 —判断标准：对苯唑西林耐药或头孢西丁诱导实验阳性 CRAB：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌 —判断标准：对亚胺培南或美罗培南耐药 VER：耐万古霉素肠球菌 —判断标准：对万古霉素耐药
菌
嗜血杆菌的鉴定途径
• 只能在营养条件高的巧克力平板上生长，菌落为中等大小、圆形、灰白色、 透明
• 革兰染色：G-小杆菌 • 卫星实验就可以帮助初步鉴定
嗜血杆菌
2021/6/16
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奈瑟氏菌属鉴定
• 在血平板和巧克力平板上生长，mac上不生长 • 血平板形成灰色、湿润、透明或半透明、不溶血的菌落 • 巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露滴状菌落 • 革兰染色： G-双球菌，呈肾形或咖啡豆形，凹面相对 • 氧化酶和触酶都均为阳性
革兰染色
甲菌
紫紫色色（（GG＋＋））
初染
媒染
脱色
复染
革结兰晶紫氏染碘色液 步骤乙醇示意图稀释复红

细菌的培养及鉴定
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。
初染
脱色
复染
冲洗
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’ 3%盐酸酒精30 ’’ ~1’
冲洗
干燥 油镜观察
细菌的培养及鉴定
美蓝复染1 ’
抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。
细菌培养及鉴定
细菌的培养及鉴定
标本采集原则
1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂 5.采样后立即送检 6.送检标本应注明细菌来的培源养及和鉴定检验目的
咳痰方法
病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液 无痰可用3％～5％NaCl 5ml雾吸约5min导痰 以清晨第二口痰为佳 标本采集后放置时间不超过2小时
细菌的培养及鉴定
清洁中段尿液
尽量取早晨第一次尿液 嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人 ➢收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水
冲洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 ➢翻转包皮，清洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿
采集标本后立即送检！
细菌的培养及鉴定
常用的培养基种类和用途
细菌的培养及鉴定
革兰染色步骤
涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘 得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。

培养观察：定期观察微生物的生长情况，记录生长曲线和 形态特征
微生物的培养物检测与鉴定
培养基的选择：根据微生物种类和生长需求选择合适的培养基 培养条件的控制：控制温度、湿度、光照等条件，保证微生物的生长 培养物的观察与记录：定期观察培养物的生长情况，记录生长状态和变化 培养物的鉴定：通过形态学、生理生化等方法对培养物进行鉴定，确定微生物种类和特性
在食品工业领域的应用
饮料：用于发酵饮料，如啤 酒、葡萄酒等
食品添加剂：用于生产食品 添加剂，如酵母、酶等
食品防腐：用于食品防腐， 如乳酸菌、醋酸菌等
乳制品：用于发酵乳制品， 如酸奶、奶酪等
食品加工：用于食品加工， 如发酵面团、发酵肉制品等
Part Seven
微生物培养技术的 发展趋势与展望
新技术的应用与融合
20世纪初，抗生素的发现 和应用，微生物培养技术 进入快速发展阶段
20世纪中叶，基因工程技 术的发展，微生物培养技 术进入分子生物学时代
21世纪初，微生物培养技 术在生物制药、环境保护 等领域得到广泛应用
微生物培养技术的应用领域
食品工业：用于发酵、酿造等食品 生产过程
环境保护：用于污水处理、土壤修 复等环境治理
微生物的生长曲线是指微生物在培养过程中，其数量随时 间变化的曲线
微生物的生长曲线可以分为四个阶段：迟缓期、对数生长 期、稳定期和衰亡期
迟缓期：微生物适应新环境，生长缓慢
对数生长期：微生物生长迅速，数量呈对数增长
稳定期：微生物数量达到最大，生长速度减慢
衰亡期：微生物数量开始减少，直至死亡
微生物的培养基
观察与鉴定：观察微 生物的生长情况，并
进行鉴定
纯化：通过筛选、分 离等方法进行纯化

等。 • ⑤各种生长因子 • ⑥转移蛋白 • ⑦不明成分
• 一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞 可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10 ％血清．
• 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明， 但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．
• 血清质量好坏是实验成败的关键。
• 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、 兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。
二 主要优点
• ㈠ 研究的对象是活的细胞。 • ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 • ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 • ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 • ㈤ 研究的范围比较广泛。 • ㈥ 研究的费用相对较经济。
三 分类
• 原代细胞培养 • 传代细胞培养
原代细胞培养
• 概念：从供体获取组织细胞后在体外进行 的首次培养。
概述
复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速 融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的 时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细 胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。
操作步骤
准备好培养瓶、培养液和离心管等放于超净工作台内。
从保存液氮或低温冰箱中冻存管（安瓶）的小袋或冻存盒内取出的 冻存管（安瓶）应直接投入37℃温水中，并轻轻摇动令其内容尽快融 化。
（4）分装、培养
• 将细胞悬液移入细胞培养瓶中，在细胞培 养瓶中加入到10ml DMEM，充分混匀，让 细胞呈单个形式存在，最后将其放入恒温 箱中培养。
2传代细胞的培养
• （1）细胞的复苏 • （2）细胞的传代 • （3）细胞的换液 • （4）细胞生长状况的观察 • （5）细胞的冻存
（1）细胞的复苏
然后进行传代
（3）细胞的换液
• 原理：

（4）分装、培养
• 将细胞悬液移入细胞培养瓶中，在细胞培 养瓶中加入到10ml DMEM，充分混匀，让 细胞呈单个形式存在，最后将其放入恒温 箱中培养。
2传代细胞的培养
• （1）细胞的复苏 • （2）细胞的传代 • （3）细胞的换液 • （4）细胞生长状况的观察 • （5）细胞的冻存
（1）细胞的复苏
概述
复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速 融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的 时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细 胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。
操作步骤
准备好培养瓶、培养液和离心管等放于超净工作台内。
从保存液氮或低温冰箱中冻存管（安瓶）的小袋或冻存盒内取出的 冻存管（安瓶）应直接投入37℃温水中，并轻轻摇动令其内容尽快融 化。
操作步骤
将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 用1-2ml营养液或PBS缓冲液，清洗培养瓶，倒出 加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，当看到培养瓶上含有 一两个小空斑，也可看到有灰白色浑浊时，将胰酶倒掉 加入培养液，用移液管吹洗贴有细胞的一面，将细 胞从培养瓶壁上吹下来
（1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。
（2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子 ， 可高压除菌。
（3）消化液 :
胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25％，pH值7.2左 右。需过滤除菌。 EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、 Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。
衰老或细胞发生变异。
细胞冻存方法
• （1）选取对数生长期的细胞，用常规传代的方法 将细胞制成悬液并计数，800-1000r/min离心5min， 弃上清。

液。
其是配方：
基础培养基 95％
血清 2％－5％
双抗 100u/ml
五 培养细胞的生长方式及类型
• ㈠ 贴附生长型细胞
必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大 体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难 以确定其稳定形态的细胞。
• ㈡ 悬浮生长型细胞
不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。
每代贴附生长细胞的生长过程
（2）细胞的传代
原理
在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和（细胞增值 达到一定密度后），为使细胞能继续生长，同时也将细胞 数量扩大，就必须进行传代（再养）。传代培养也是一种 将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各 种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁 细胞需经消化后才能分瓶。
• 在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上， 置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变 （CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反 复冻融3次，置-70℃保存备用。
细胞培养的基本概念
• 传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后， 被分开接种到新的培养器皿中。
• 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外 条件下生长的细胞在传代之前称为原代培 养。
然后进行传代
（3）细胞的换液
• 原理：
当细胞的量很少，未能铺满整个生长表 面，但细胞培养液的pH值已经发生很大变 化；或者是细胞形态很差等情况时，需要 给细胞换液。
• 操作步骤
（1）吸弃或倒掉培养瓶内的旧培 养液
（2）加入PBS溶液清洗细胞瓶五 面
（3）加入足量的细胞生长液，放 入37℃、5%CO2培养箱静置培养。
操作步骤
将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 用1-2ml营养液或PBS缓冲液，清洗培养瓶，倒出 加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，当看到培养瓶上含有 一两个小空斑，也可看到有灰白色浑浊时，将胰酶倒掉 加入培养液，用移液管吹洗贴有细胞的一面，将细 胞从培养瓶壁上吹下来