大肠菌群的检验方法

GB/T 4789.3-2003 食品微生物学检验大肠菌群计数

方法确认试验

按照GB/T 4789.3-2003 食品微生物学检验 大肠菌群计数方法要求对检验方法进行了确认试验。

一、仪器试剂

仪器：高压灭菌器 培养箱

培养基：青岛日水（）

二、样品来源

阳性样品：（市所提供滴加菌悬液桶装饮用水）

阴性样品：（市所提供灭菌水）

三、试验步骤

取25mL样品加到225ml磷酸盐缓冲液或灭菌生理盐水中，振摇混匀，制成1：10样品匀液，以灭菌生理盐水按10倍递增稀释。取前3个连续稀释度，每个稀释度接种3管，分别接种至乳糖胆盐发酵管培养，观察产气情况，未产气者为大肠菌群阴性。于产气管中取1环转种至伊红美兰琼脂平板，取可疑菌落做革兰氏染色，并同时接种乳糖发酵管培养，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告大肠菌群阳性。根据阳性管数，检索MPN表，报告结果。

结果如下：

培养时间： 日 时 ～ 日 时 培养温度： 36℃

接种量（ml） 接种

管数 乳糖胆盐发酵管 乳糖发酵管

产气（＋）产气（－） 产气（＋）产气（－）

1 3 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋

1 3 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋

1 3 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋

四、方法学确认结果

按照GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定检验方法的实验步骤，阳性样品均检出大肠菌群，阴性样品均未检出。

大肠菌群检测方法

进入无菌室步骤

1． 进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。

2． 关灯后0•5小时后放可进入。

3． 进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套

实验步骤

1， 进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）

2， 准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。

3， 直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）

4， 再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）

5， 再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）

6， 再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液

7， 更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）

8， 再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）

9， 再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。）

10， 把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）

11， 梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成

－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成

－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样

12， 如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）

13， 取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中 ，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。

大肠杆菌的检验方法

样品制备：

以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000

r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。

稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。

LST和EC初步筛选：

对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于36±1℃培养48±2h。

观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。

EMB平板：

取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。

检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。

生化试验：

将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。

1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。

2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。

将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。

大肠菌群检验方法及操作方法

1、 什么是大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。

2、大肠菌群的组成：大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。

3、大肠菌群的测定意义

 粪便污染的指标菌：大肠菌群或粪大肠菌群

 以大肠菌群作为粪便指标菌原因：

1) 在粪便中数量最大；

2) 在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；

3) 检测方法简便容易。

 大肠菌群的测定意义：

1) 判断食品中否受到粪便污染。

2) 有利于控制肠道传染病的发生和流行。

3) 有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。 4、大肠菌群的生物学特性

1 形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。

2 发酵乳糖产酸产气

3 培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；

4 在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。

5、大肠菌群检验方法及操作方法

 国家标准：

 三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)

 行业标准：

 两步法：推测试验→证实试验

表1 大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征

MPN法简介 Most Probable Number Method最大可能数

• 对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。

• MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。 6、粪大肠菌群的检验

• 粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

• 于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃

24h产气的一群细菌；在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群。