大肠菌群的检测方法

大肠菌群检测原始记录

LFJZ-002

样品名称 样品编号

样品状态 生产日期

检验依据 GB4789.3-2010 检验日期

仪器名称 电子天平（型号：TD20001）

生化培养箱（型号：303）

样品制备 固体和半固体样品：无菌称取25g，加入225ml生理盐水，进行均质处理。

初发酵（月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，37℃，48h） 稀释度 接种量(ml) 接种管数(支) 产气管数(支) 复发酵(煌绿乳糖胆盐肉汤，37℃，,48h)产气管数(支)

1:10 10 3

1:10 1 3

1:100 1 3

报出值(MPN/100g)

检验人： 审核人： 日期：

4．1 在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100mL。

4．2 在10支装有5mL三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10mL。

4．3 轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。

4．4 观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。

5 证实试验

5．1 平板分离

自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。

5．2 复发酵试验

挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36±1℃培养箱中，培养24h。

5．3 凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，为大肠菌群阳性。记下证实实验的阳性管数，查最大可能数（MPN）检索表得出1000mL水样中总大肠菌群的MPN值。

总大肠菌群（MPN）检索表

二、大肠菌群膜法测定

1 定义

大肠菌群（coliform bacteria）为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，将带菌滤膜贴在含乳糖的选择性培养基上，经37℃培养24小时后，呈现深暗红色带金属光泽的菌落。

2 仪器

2．1 滤器

2．2 滤膜，孔径0．45μm。直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和27mm两种。

2．3 抽滤设备

2．4 无齿镊子

2．5 其它仪器见《GB/T ××××－××公共场所茶具微生物检验方法，大肠菌群测定》中第3章。

3 培养基

3．1 品红亚硫酸钠培养基

3．1．1 成分：蛋白胨 10g

酵母浸膏 5g

牛肉膏 5g

乳糖 10g

琼脂 10～20g

磷酸氢二钾 3．5g 无水亚硫酸钠 5g

5％碱性品红乙醇溶液 20mL

蒸馏水 1000mL

3．1．2 储备培养基的制备

将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900mL蒸馏水的烧杯中，溶解后调pH值到7．2～7．4，加入琼脂加热溶解，用蒸馏水补足至1000mL，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，115℃高压灭菌20min，置冷暗处备用。

粪大肠菌群的测定

1 卫生学意义

粪大肠菌群测定的卫生学意义：一、与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染；二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性；三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标 。

2 检验方法

2.1 术语与定义

一群在44.5℃培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

卫生学概念，又称为耐热大肠菌群，主要是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属等。

2.2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

（1）恒温培养箱：36℃±1℃。

（2）冰箱：2℃～5℃。

（3）恒温水浴箱：46℃±1℃。

（4）天平：感量0.1g。

（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

（6）无菌锥形瓶：容量500mL。

（7）无菌培养皿：直径90mm。

（8）pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

2.3 培养基和试剂

（1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：

1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0g；氯化钠：5.0g；乳糖：5.0g；磷酸氢二钾（K2HPO4）：2.75g；磷酸二氢钾（KH2PO4）：2.75g；月桂基硫酸钠：0.1g；蒸馏水：1000mL；pH：6.8±0.2

2）制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。

（2）EC肉汤（E.coli，BGLB）：

1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0 g；3号胆盐或混合胆盐：1.5 g；乳糖：5.0g；磷酸氢二钾（K2HPO4）：4.0g；磷酸二氢钾（KH2PO4）：1.5g；氯化钠：5.0g；蒸馏水：1000mL；pH：6.9±0.1。

大肠菌群及检验

一、大肠菌群介绍

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。

大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 二、大肠菌群检验方法：

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。

目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。

（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。

乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。