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《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》篇一一、引言随着生物医学的快速发展，细胞培养技术已成为研究细胞生物学、病理学、药理学等领域的重要手段。
其中，原代培养技术是获取特定组织或器官细胞并进行研究的关键步骤。
奶牛作为重要的畜牧业资源，其乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养与鉴定对于研究奶牛乳腺疾病、提高奶牛养殖效益具有重要意义。
本文旨在介绍奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养方法及鉴定技术，为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料（1）奶牛乳腺组织样本：采集自健康奶牛的乳腺组织。
（2）实验试剂与器材：包括胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM 培养基、离心管、培养瓶等。
2. 方法（1）原代培养a. 乳腺组织处理：将采集的乳腺组织清洗干净，剪成小块。
b. 酶消化法：用胰蛋白酶对组织进行消化，获得单细胞悬液。
c. 细胞接种与培养：将单细胞悬液接种于培养瓶中，加入适量培养基，置于培养箱中培养。
（2）细胞鉴定a. 形态学鉴定：通过倒置显微镜观察细胞形态。
b. 免疫组化鉴定：利用特异性抗体对细胞进行免疫组化染色，鉴定细胞类型。
c. 分子生物学鉴定：通过PCR、Western Blot等技术鉴定细胞基因及蛋白表达情况。
三、实验结果1. 原代培养结果（1）乳腺上皮细胞培养：培养一定时间后，可观察到细胞贴壁生长，形成单层上皮样结构。
（2）成纤维细胞培养：成纤维细胞生长迅速，呈梭形或多角形，排列紧密。
2. 细胞鉴定结果（1）形态学鉴定：乳腺上皮细胞呈圆形或卵圆形，成纤维细胞呈梭形或多角形。
（2）免疫组化鉴定：通过特异性抗体染色，可观察到乳腺上皮细胞和成纤维细胞的特征性表达。
（3）分子生物学鉴定：PCR、Western Blot等技术鉴定结果显示，乳腺上皮细胞和成纤维细胞的基因及蛋白表达情况与文献报道相符。
四、讨论本实验成功建立了奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养体系，并通过形态学、免疫组化及分子生物学等方法对培养的细胞进行了鉴定。
鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》篇一一、引言原代培养技术在细胞生物学及动物医学等领域应用广泛。
针对奶牛这一特殊的物种，了解其乳腺上皮细胞和成纤维细胞的特性和功能对于奶牛健康管理和乳制品产业具有重大意义。
本文旨在详细介绍奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养过程及其鉴定方法。
二、材料与方法1. 材料本实验所需的材料包括奶牛新鲜乳腺组织、组织消化液、细胞培养基、胰蛋白酶等。
2. 方法（1）原代培养a. 采集新鲜奶牛乳腺组织，进行清洗和消毒处理。
b. 将组织剪成小块，用组织消化液进行消化处理。
c. 将消化后的组织细胞悬液进行离心，去除上清液，加入细胞培养基进行培养。
（2）细胞鉴定a. 形态学观察：利用显微镜观察细胞的形态和生长情况。
b. 免疫组化染色：通过特异性抗体对细胞进行染色，鉴定细胞类型。
c. 分子生物学检测：通过PCR等技术检测细胞内特定基因的表达情况。
三、实验结果1. 原代培养结果（1）乳腺上皮细胞培养：在适宜的培养条件下，乳腺上皮细胞生长迅速，呈多边形或圆形，具有典型的上皮细胞形态特点。
（2）成纤维细胞培养：成纤维细胞生长较慢，呈梭形或星形，具有典型的成纤维细胞形态特点。
2. 细胞鉴定结果（1）形态学观察：通过显微镜观察，发现培养的细胞具有典型的乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态特点。
（2）免疫组化染色：通过特异性抗体染色，进一步证实了培养的细胞为乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
（3）分子生物学检测：通过PCR等技术检测，发现培养的细胞表达与乳腺上皮细胞和成纤维细胞相关的特定基因。
四、讨论通过对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养与鉴定，我们成功获得了这两种细胞，并对其进行了形态学、免疫组化和分子生物学等方面的鉴定。
这为进一步研究这两种细胞的生物学特性和功能奠定了基础。
同时，原代培养技术的运用也为我们提供了更为接近自然状态下细胞的模型，有助于我们更好地理解奶牛的生理过程和疾病发生机制。
甲状腺成纤维细胞的分离、培养和鉴定
材料和试剂：来源：SD大鼠
手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）、显微镊
清洗液：PBS
培养液：DMEM添加20%FBS200IU双抗
破红液：常规配方
具体操作：1、将300uL的3％戊巴比妥注入SD大鼠体内，待大鼠麻醉至昏厥状态时，将大鼠转入75%的酒精最浸泡5min。
2、在无菌条件下，将大鼠放置于泡沫板上，四肢用针头固定。
3、用左手持直头眼科镊子夹住大鼠腹部最下方的皮毛，右手拿手术剪将大鼠的皮剪开，沿着腹部下方一直剪至大鼠下颚，将下颚的皮毛去掉。
4、剪开大鼠的皮毛看见覆盖在气管上方的肌肉组织，左手换一个无菌的弯头眼科镊子，右手拿另一个无菌的手术剪，将肌肉组织剪开后即可发现气管，将气管周围的组织轻轻去除，即可看见气管及覆盖在气管周围的甲状腺组织，左手将气管下端轻轻固定，右手拿手术剪将甲状腺连着气管剪下来。
5、在无菌条件下，左手拿直头显微镊子将气管轻轻固定，右手拿弯头显微镊，除去连在气管及甲状腺外壁的结缔组织，然后用动脉剪将甲状腺从气管上剪下来，尽量不要剪刀气管，用预冷的PBS 清洗3次。
6、左手拿直头显微镊子将分离的甲状腺轻轻固定，右手用动脉剪剪成1mm³大小的组织块后，再用PBS清洗2-3次。
7、将组织块植入6孔板，组织块之间的间隙在3mm³左右，用枪头吸取多余的液体，将6孔板倒扣在培养箱中2小时，加入培养液1mL静置培养5天，5天即可观察到食管外膜成纤维细胞爬出，如图所示。
8、5天后移去组织块，待细胞长满6孔板后，用时差贴壁法纯化细胞，细胞纯度达90%以上后，可冻存保种。
图1.用Vimentin抗体鉴定甲状腺成纤维细胞
武汉云克隆诊断试剂研究所。
乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。
二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。
培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。
0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。
三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。
5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。
6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。
五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
成纤维细胞科技名词定义中文名称：成纤维细胞英文名称：fibroblast定义：普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。
分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片疏松结缔组织中的成纤维细胞成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。
成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。
根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。
成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。
目录细胞的功能活动状态划分来源特征创伤修复分离培养原代培养展望展开编辑本段细胞的功能活动状态划分根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。
此二型细胞可互相转化。
[1]编辑本段来源成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。
成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalphapolypeptidechain ），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen ）。
前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。
在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen ）。
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》篇一一、引言奶牛作为重要的经济动物，其乳腺细胞和成纤维细胞的研究对于奶牛疾病防治、育种及生理研究等方面具有重要意义。
本文将介绍奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养方法及鉴定过程，为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料（1）奶牛乳腺组织样本：从健康奶牛的乳腺中获取。
（2）培养基及试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等。
（3）实验器材：显微镜、离心机、细胞培养瓶等。
2. 方法（1）细胞原代培养：取新鲜奶牛乳腺组织，经处理后分别分离出乳腺上皮细胞和成纤维细胞，将其接种于培养瓶中，加入适量培养基进行培养。
（2）细胞鉴定：通过观察细胞的形态、生长特性及免疫组化等方法对细胞进行鉴定。
三、实验步骤1. 乳腺组织样本的获取与处理从健康奶牛的乳腺中获取组织样本，用无菌器械将其剪成小块，用PBS缓冲液清洗干净。
2. 乳腺上皮细胞和成纤维细胞的分离与培养（1）将清洗干净的乳腺组织块置于含有胰蛋白酶的离心管中，进行消化处理。
（2）将消化后的组织液离心，收集细胞沉淀，用培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中。
（3）将培养瓶置于恒温培养箱中，定期观察细胞生长情况，更换培养基。
3. 细胞鉴定（1）形态观察：在显微镜下观察细胞的形态、大小、生长状态等。
（2）免疫组化：利用特定抗体对细胞进行染色，观察细胞的特异性标志物。
四、结果与分析1. 细胞培养结果经过原代培养，成功获得了奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的单层生长。
细胞在培养基中生长良好，形态清晰，无污染。
2. 细胞鉴定结果（1）形态观察：乳腺上皮细胞呈扁平多边形，成纤维细胞呈长梭形，两者均具有典型的细胞特性。
（2）免疫组化：通过免疫组化染色，观察到乳腺上皮细胞和成纤维细胞的特异性标志物，证实了细胞的类型。
五、讨论本文介绍了奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养方法及鉴定过程。
在实验过程中，需要注意无菌操作、细胞分离与纯化、培养条件的控制等方面，以确保实验结果的准确性。
成纤维细胞的培养1前言成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。
根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。
在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。
不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。
通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。
成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。
由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。
成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。
2材料和方法2.1材料玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管塑料器材：细胞培养板橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜2.2试剂的配制水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、2.3方法2.3.1试剂配制（1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水（2) 组织冲洗液：无血清MEM（3）细胞生长液：含10％FCS MEM2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》篇一一、引言随着生物医学的快速发展，细胞培养技术已成为研究细胞生物学、病理学、药理学等领域的重要手段。
其中，原代培养的细胞因其更接近自然状态下的生理特性，对于研究细胞的功能、机制以及疾病的发生发展等具有重要意义。
本文以奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞为研究对象，对其原代培养及鉴定过程进行详细阐述。
二、材料与方法1. 材料实验所需材料包括：新鲜奶牛乳腺组织、成纤维细胞培养基、上皮细胞培养基、胰蛋白酶、EDTA等。
2. 方法（1）奶牛乳腺组织获取及处理：在无菌条件下获取新鲜奶牛乳腺组织，用含有双抗的PBS溶液清洗，去除血液及杂质。
（2）原代培养：将清洗后的乳腺组织剪成小块，用胰蛋白酶和EDTA消化，分别获得乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
将细胞接种于培养瓶中，加入相应培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
（3）细胞鉴定：通过观察细胞的形态、生长速度等，以及利用免疫荧光、PCR等技术对细胞进行鉴定。
三、实验结果1. 细胞形态观察通过显微镜观察，奶牛乳腺上皮细胞呈典型的多边形或梭形，排列紧密；成纤维细胞呈长梭形或星形，具有明显的纤维状突起。
两种细胞的生长速度均较快，且在培养基中生长良好。
2. 免疫荧光鉴定通过免疫荧光技术对细胞进行鉴定，结果显示奶牛乳腺上皮细胞表达上皮细胞特异性标志物E-cadherin，而成纤维细胞则表达成纤维细胞特异性标志物α-SMA。
证明所培养的细胞分别为乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
3. PCR鉴定利用PCR技术对细胞的基因进行扩增和鉴定，进一步证实了所培养的细胞类型。
PCR结果显示，奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的基因表达与文献报道相符。
四、讨论原代培养的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞在形态、生长速度等方面均表现出良好的生物学特性。
通过免疫荧光和PCR等技术对细胞进行鉴定，证实了所培养的细胞分别为乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
这些原代培养的细胞为研究奶牛乳腺生物学、乳腺疾病的发生发展以及新药研发等领域提供了重要的实验材料。
人成纤维细胞提取方法
人成纤维细胞的提取通常涉及以下几个步骤：
1. 组织取材：从健康的人体皮肤（通常是真皮层）中获取组织样本。
临床标本需要经过彻底清洗以避免污染，并且将真皮层尽可能剪碎，这有利于成纤维细胞的迁出。
2. 组织消化：使用适当的消化酶（如胶原酶）处理剪碎的组织，以帮助释放成纤维细胞。
新生儿真皮组织包含更多细胞和更少的细胞外基质，因此可以从新生儿组织中分离出细胞。
如果从成人皮肤中分离，可能需要使用更大量的起始组织并提高胶原酶浓度。
3. 细胞培养：将消化后释放出的细胞接种到培养皿中，并在适宜的培养条件下进行培养。
培养条件通常包括非动物源性或含血清的培养基，以及恒温恒湿的培养环境。
4. 细胞传代：当细胞达到一定的密度时，需要进行传代培养，以确保细胞的持续生长和扩增。
5. 细胞鉴定：通过形态学观察和特定的免疫化学标记来鉴定所提取的细胞是否为成纤维细胞。
成纤维细胞在形态上通常呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
总的来说，在进行人成纤维细胞的提取和培养时，需要在无菌条件下操作，使用二级生物安全柜，并采取适当的个人防护措施，如佩戴双层手套、护目镜和实验服。
同时，处理人体组织时应采取通用预防措施，并妥善处置受污染的材料。
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》篇一一、引言随着生物医学的快速发展，细胞培养技术已成为研究细胞生物学、病理学、药理学等领域的重要手段。
其中，原代培养技术是获取特定组织或器官细胞并进行研究的关键步骤。
奶牛作为重要的畜牧业资源，其乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养与鉴定对于研究奶牛乳腺疾病、乳腺生理功能以及药物筛选等方面具有重要意义。
本文旨在详细介绍奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养过程及其鉴定方法，以期为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料(1) 实验动物：健康成年奶牛。
(2) 试剂与耗材：胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、无菌器械等。
(3) 仪器设备：显微镜、离心机、培养箱、手术器械等。
2. 方法(1) 乳腺组织获取：从健康成年奶牛的乳腺中获取组织样本。
(2) 组织消化与细胞分离：将组织样本进行消化处理，分离出乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
(3) 细胞原代培养：将分离得到的细胞接种至培养皿中，加入培养基，置于培养箱中培养。
(4) 细胞鉴定：通过显微镜观察细胞形态，进行免疫组化染色等方法鉴定细胞类型。
三、实验过程1. 乳腺组织获取与处理首先，从健康成年奶牛的乳腺中获取组织样本。
然后，将组织样本进行清洗，去除血液和杂质。
接着，使用无菌器械将组织剪成小块，便于后续的消化和细胞分离。
2. 细胞分离与原代培养将处理好的组织样本放入含有胰蛋白酶的培养基中，进行消化处理。
消化完成后，通过离心、过滤等步骤分离出乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
将分离得到的细胞接种至培养皿中，加入含血清的DMEM培养基，置于培养箱中培养。
3. 细胞鉴定对培养的细胞进行显微镜观察，记录细胞的形态、生长情况等。
然后，通过免疫组化染色等方法鉴定细胞类型。
鉴定过程中需设置阳性对照组和阴性对照组，以确保结果的准确性。
四、结果与分析1. 细胞形态与生长情况通过显微镜观察，可见乳腺上皮细胞呈圆形或椭圆形，贴壁生长，形态规整；成纤维细胞呈梭形或星形，生长迅速，铺路石样排列。
人皮肤成纤维细胞库的构建
试剂: 胶原酶(Sigma)，优质胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Sigma)，中性蛋白酶(Sigma)，DMEM培养基(Sigma)，二甲基亚砜(Merck)。
配液 :成纤维细胞培养基配制:DMEM10g，NaHCO3 3．7g，HEPES 2．4g，优质胎牛血清100ml，青霉素100 000U，链霉素100 000U，超纯水加至1 000ml，用1N NaOH 调pH值至7-2～7．4，0．22pan孑L滤膜过滤除菌，9Om】／瓶分装，一2O℃贮存备用。
D—Hanks 平衡盐液：NaC1 8．0g，KC1 0．4g，Na2HPO4·12H：0 134．4mg，KH~PO4 0．06g，NaHCO3 0．35g，酚红O．O2g，青霉素100000U，链霉素100000U，超纯水加至1 o0Ornl，用1N NaOH调pH值至7．2-7A，0．22tun孔滤膜过滤除菌，90ml／瓶分装，一2O℃贮存备用。
方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D—Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0．3cmx2．0em大小的皮条，置于培养皿中，加0．25％胰蛋白酶浸没组织，4℃冰箱中消化14~16h，以用眼科镊能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。
吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镊轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0．1cmx0．1cmx0．1cm)，加入0．2％胶原酶浸没组织，37℃孵箱中消化1~4h，以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；加D-Hanks平衡盐液1 500#min离心5min，5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，加DMEM制成细胞混悬液，接种至50ml培养瓶中，置37℃、5％CO：、湿度95％的CO 孵箱中培养131。
24h后更换培养基，以后更换培养液1次／3d，大约7~9d左右长满后传代。
成纤维细胞的传代:倒掉培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入0．25％的胰蛋白酶2ml。
轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后倒掉消化液后再加入2ml新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。
消化约2—5min后把培养瓶放置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DMEM 2ml终止消化，用吸管反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。
按1：3传代至新的培养瓶中，置37℃、5％CO 、湿度95％的CO2孵箱中培养，约3~5d左右可再次传代。
成纤维细胞的冻存与复苏:用0．25％的胰蛋白酶2ml消化、分散接近长满单层的成纤维细胞，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DMEM 6ml终止消化，轻轻吹打细胞。
以使细胞游离，1 500r／min离心5min，去除胰蛋白酶及旧的培养液，将细胞重悬于配制好的含有10％无菌二甲基亚砜DMEM冻存液中，然后分装入无菌塑料冻存管中，每支冻存管加液1~2ml，封闭冻存管，标明细胞的名称、代数及冻存日期，先将冻存管置于4℃冰箱中保存2h，一20℃冰柜中保存2h，一80℃超低温冰柜中保存2h，即可迅速投入一196~C长期保存。
复苏时，将冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴中复温，加入8ml培养液，混合后1 O00r／min离心5min，倾去上清液，再加入10rnl培养混悬，重复低速离心5rain，以除去二甲基亚砜，用新鲜培养液重悬细胞，用培养液适当稀释，使细胞接种密度为1xllY／ml，接种培养瓶，置37℃、5％C0 、湿度95％的CO 培养箱内培养，待细胞贴壁后更换培养液。
最后，将成纤维细胞在倒置显微镜下直接观察其细胞形态，并摄相。
换液注意事项：
贴壁细胞换液的时候是从培养瓶的非细胞附着面加PBS（避免影响细胞贴壁），然后轻轻晃动瓶子，从非细胞附着面倒出PBS （也可以吸出来，以免弄湿瓶口），洗的次数以镜下视野比较干净为准（只要你加pbs不是太少，一般2次左右就洗干净了），一般不需要吹打，尤其是在你刚传了代或者细胞贴壁能力不是很好的情况下
细胞的换液
(1) 从培养箱中取出培养瓶，观察细胞。
内容有：①培养瓶中培养液的PH值。
②培养瓶中液体是否澄清。
③倒置显微镜下细胞的生长状态。
(2) 翻转培养瓶，使贴有细胞的一面瓶壁向上，并使培养瓶口斜向上倾斜约45°，开瓶盖，用酒精灯的外焰烧瓶口消毒。
玻璃瓶瓶口先有雾气生成，等瓶口再次透亮即可。
一次性使用的培养瓶只需将瓶口过火即可。
(3) 长滴管吸取培养液，放入废液缸中。
(4) 新吸管吸5ml培养液加入细胞瓶。
(5) 关瓶盖。
瓶盖拧紧后向回拧半圈，以利于CO2进入。
完成实验记录。
