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鸡胚成纤维细胞单层培养一、原理离体的器官、组织、细胞短时间并不死亡。
对机体的器官、组织、细胞提供适当的环境条件和营养物质，可使其在离体情况下继续生长和繁殖，这种技术方法分别称之为器官培养、组织培养、细胞培养，一般统称为组织培养，而在病毒学研究中通常指的是细胞培养。
原代细胞单层培养就是在无菌条件下，直接从机体取出器官和组织的全部或一部分，用机械方法或适当的组织分散剂（一般用胰蛋白酶）消化处理，使组织快分散成单个细胞悬液。
经洗涤和细胞计数，定量分装到一定的容器内，提供该细胞生长所必须的环境条件和营养物质，促使细胞贴壁并不断分裂生长繁殖，直至成均匀致密的细胞单成。
多种动物、植物、人的组织都可以用来进行细胞培养。
在实际工作中，对细胞来源的选择主要是根据细胞对病毒的易感性，细胞来源难易来决定的。
二、目的和要求了解细胞培养的一般原理，掌握原代细胞单成培养的操作技术。
三、实验材料1、孵育10日龄发育良好的鸡胚。
2、抗菌素溶液（每ml含青霉素10000单位、链霉素10000微克）；碳酸氢钠液。
3、洗涤液：Hank’s液（经碳酸氢钠液调节PH为7.0～7.2）；无钙、镁离子磷酸缓冲液（CMF－PBS）。
4、细胞分散剂：0.25%胰蛋白霉溶液。
5、营养液：0.5％水解乳蛋白－Hank’s液（LH液，也称乳汉液），加入1%抗菌素溶液，5％小牛血清，用碳酸氢钠调节PH为7.0～7.2。
6、实验器械：卵架、碘酒和酒精消毒棉球、酒精灯、镊子、血球计数板、显微镜、水浴锅、温箱、吸球、灭菌眼科镊和剪、培养瓶、橡皮塞、吸管、平皿、三角瓶、烧杯、带有过滤纱布（四层）的漏斗。
四、操作方法1、鸡胚的获得及处理：（1）去10日龄发育良好的鸡胚，照蛋标出气室。
气室向上直立于卵架上，依次用碘酒和酒精棉球由中央及四周涂抹卵壳除菌消毒。
无菌操作下，用镊子去除气室部卵壳；换无菌镊子去处壳膜，穿破绒毛尿囊膜夹住鸡胚胎颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
（2）除去鸡胚头、翅、肢体，清除内脏，用Hank’s液冲洗鸡胚三次。
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。
2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。
3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。
（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。
（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。
（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。
（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。
（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。
（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。
DMSO一定要配成10%。
收稿日期：2012-01-04修回日期：2012-02-20∗基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（NY ⁃CYTX-45-02）；浙江省农科院科技创新能力提升工程∗∗通讯作者，E-mail ：well-being365@鸭胚成纤维细胞培养鸭胚成纤维细胞培养、、传代及保存方法的研究∗许静1，2，李进军1∗∗，熊胜1，陈黎1，杨倩2，卢立志1（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州310021；2.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095）Culture ，Subculture and Cryopreservation of Embryo Fibroblast of Duck ∗XU Jing 1，2，LI Jinjun 1∗∗，XIONG Sheng 1，CHEN Li 1，YANG Qian 2，LU Lizhi 1（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine ，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences ，Hangzhou ，Zhejiang 310021；2.College of Veterinary Medicine ，Nanjing Agricultural University ，Nanjing ，Jiangsu 210095）Abstract ：Effective methods for isolation ，culture ，subculture and cryopreservation of duck embryo fibroblast in vitrowas established which would lay the foundation for culture of embryo or germ stem cells.The duck embryonal tissue was digested with trypsin-EDTA to obtain primary cells and passage cells ，which were cultured with 10%FBS+e the DMSO ，glycerin ，ethylene glycol as cryoprotectants to freeze F 1cells ，and observe the cell viability of anabiotic cells.The methods could be used for isolation and pure culture of duck embryo fibroblast in vitro ，and could be subcultured to the third generation.The results indicated that the cell viability in F 1and F 2came up to 90%，but no significant difference was observed.The cell viability of all anabiotic cells decreased （<80%）after cryostoraged by threedifferent cryoprotectants.DMSO was the most effective reagent for cryopreservation of duck embryo fibroblast.Key words ：duck embryo fibroblast ；culture in vitro ；cryopreservation ；cell viability我国是养鸭大国，饲养量居世界第一位。
实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
①材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。
②仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。
理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。
2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4℃保存。
（准备试剂瓶）灭菌方法：高压灭菌。
2）干粉培养基过滤除菌（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）认真阅读说明书。
说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。
这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。
配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。
2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基。
3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。
4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。
5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。
注意不要过分搅拌。
6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。
42生物技术世界BIOTECHWORLD细胞培养是病毒学研究的重要手段,是进行病毒性疾病诊断必不可少的工具。
泛地应用于病毒的分离、鉴定,人工感染的细胞培养物制成的弱毒疫苗和灭活疫苗以及筛选异源和同源的弱毒株都离不开细胞的培养工作。
[1]病毒能在易感的组织和单层细胞内增殖,并可产生细胞病变。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞,由胚胎时期的间充质细胞分化而来。
鸡成纤维细胞具有相对容易获得、增值能力强、适应性强、良好的耐受性、性状较稳定等特点,所以被广泛的应于在病毒培养等领域。
鸡胚成纤维细胞培养可分为原代细胞培养、传代细胞培养。
原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程,自供体体内取出组织分散单个成单个细胞接种于培养液中为初次培养,从初次培养到第一次传代培养为原代细胞培养。
由组织刚刚分离出来的细胞能够分裂增殖,形成单层细胞。
[2]1 所需材料:鸡胚:9-10日龄SPF 鸡胚消化液:含0.25％胰蛋白酶(预先置于37℃温箱中);培养基:用DMEM培养基,含10%胎牛血清;洗液:pH7.2的PBS洗液;器具与物品:无菌剪刀、镊子、平皿、细胞培养瓶;带两层纱布的无菌烧杯,CO2培养箱、超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、水浴箱、培养瓶、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉等。
2 操作[3]2.1 操作前的准备(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
(2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
(3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
(4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
(5)准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
2.2 成纤维细胞制备(1)取9-11日龄的鸡胚。
先用75%的酒精喷淋整个鸡胚,消毒后置于超净工作台内先后用碘酒和酒精对气室及周边进行擦拭消毒。
用无菌剪刀、镊子打开蛋皮,取出鸡胚,放入灭菌好的平皿中,去除鸡头、鸡翅、鸡爪、内脏。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养鸡胚成纤维细胞培养1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局:点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚:取9-10日龄鸡胚，(注:鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低)用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切:用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织:将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml(组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化:将其置入37?水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10,15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离:在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
(制法见微生物试验实习指导)，用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清(可以不离心吸掉上清)，加入适量含有血清的培养液。
10、计数:用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO调整。
生物技术通讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．21No．3May,2010 doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2010．03．027技术方法不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响陈志胜，王丙云，黄文静，陈胜锋，计慧琴佛山科学技术学院动物医学系，广东佛山528231［摘要］目的：为探索鸡胚胎干细胞培养的优化条件，比较不同饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养的效果。
方法：用传至第2代的鸡胚成纤维细胞与鸭胚成纤维细胞，经丝裂霉素处理后制作饲养层，比较这2种饲养层以及不用饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养效果的影响。
结果：在以鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞作为饲养层的培养体系中，鸡胚胎干细胞均可保持良好的生长状态，而且2种饲养层对鸡胚胎干细胞克隆形成的影响差异不显著（P＞0．05）。
结论：鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞均可作为较好的饲养层细胞用于鸡胚胎干细胞的离体培养。
［关键词］鸡胚胎干细胞；饲养层；鸡胚成纤维细胞；鸭胚成纤维细胞［中图分类号］Q813［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2010)03－0416－03Effects of Different Feeders on Cultured Chicken Embryonic Stem CellsCHEN Zhi－Sheng,WANG Bing－Yun,HUANG Wen－Jing,CHEN Sheng－Feng,JI Hui－Qin Department of Veterinary,Foshan University,Foshan528231,China［Abstract］Objective:To research the optimal culture condition of chicken embryonic stem cells,compare the effect of different feeders on cultured chicken embryonic stem cells in vitro．Methods:The second generation chicken embryonic fibroblast(CEF)and duck embryonic fibroblast(DEF)were used to make feeders after treated with mitomycin C．The state of chicken embryonic stem cells were observed and the number of cell clones was countedon the culture system with those two feeder layers or feeder layer free．Results:The results showed that chicken embryonic stem cells growth well both on the CEF and DEF feeder,and the number of cell clones was no distinct difference between CEF and DEF(P＞0．05)．Conclusion:The results indicated that both of CEF and DEF can be used as feeders to culture chicken embryonic stem cells．［Key words］chicken embryonic stem cells;feeder;chicken embryonic fibroblast;duck embryonic fibroblast胚胎干细胞离体培养技术的关键是在保证细胞具备无限增殖能力的同时维持其未分化状态，采用饲养层培养胚胎干细胞，是实现这一目标最有效的方法之一[1－2]。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
骨骼肌成纤维细胞分离培养
骨骼肌成纤维细胞（skeletal muscle fibroblasts）的分离和
培养是一种常用的实验技术，用于研究骨骼肌相关的生物学过程以及
肌肉疾病等。
以下是骨骼肌成纤维细胞分离培养的一般步骤：
1.准备离体骨骼肌组织。
从小鼠或人的骨骼肌中取出组织，最好是新鲜组织以确保细胞的活力。
2.组织消化。
将骨骼肌组织切成小块，用胶原酶或胰蛋白酶等消化酶进行消化，使细胞从组织中释放出来。
3.细胞筛选。
通过过筛网或离心的方式将消化后的细胞悬浮液筛选，去除大部分的纤维束和其他细胞类型。
4.细胞培养。
将筛选后的细胞悬浮液转移到培养皿中，添加含有合适培养基和补充物的培养液，将培养皿放置在适当的培养箱中。
5.培养条件。
骨骼肌成纤维细胞通常在37°C的孵育箱中，与5% CO2的空气保持湿润的环境中培养。
6.细胞生长和传代。
骨骼肌成纤维细胞会在培养皿中黏附并开始增殖。
当细胞达到一定密度时，可以进行传代，将细胞分离并分散到
新的培养皿中。
需要注意的是，分离和培养骨骼肌成纤维细胞需要一定的实验技巧和设备，以保证细胞的存活和生长。
同时，细胞的培养基选择和培
养条件的控制也对细胞的生长和功能有重要影响。
因此，在进行这项
技术时，需要按照具体实验要求和相关文献中的方法进行操作。
辽宁农业职业技术学院毕业论文系别：生物技术系专业名称：兽药生产与营销论文题目：鸡胚成纤维细胞传代学生姓名：郐永琳指导教师：***评阅人：成绩：二O一O年六月二十日评阅人评语：评阅人签字：年月日目录摘要 (1)关键词 (1)前言 (1)1材料 (1)1.1仪器 (1)1.2种蛋 (1)1.3犊牛血清 (1)1.4溶液 (1)2方法 (2)2.1鸡胚的选择与孵化 (2)2.2鸡胚原代细胞制备 (2)2.3细胞传代 (4)3结果与分析 (4)4讨论 (4)4.1温度 (4)4.2P H (5)4.3气体 (5)4.4细胞接种量 (5)4.5无菌条件 (5)5结论 (5)参考文献 (6)致谢 (6)鸡胚成纤维细胞传代摘要：采用10日龄SPF鸡胚，进行消化，制备原代细胞，当细胞长成良好单层时，按1:2比例进行细胞传代，找出鸡胚细胞传代方法和情况。
其结果是：按本实验室方法进行鸡胚传代，传至20代以上细胞形态没有发成变化，细胞生长良好。
细胞数量大大增加。
为病毒的研究和疫苗生产提供条件。
关键词：鸡胚；传代；生长特性前言细胞培养的方法是将机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
细胞在培养瓶长成致密单成后，已基本饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须传代（再培养）。
也是将细胞保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种操作的必经过程，在这个过程中可以掌握其操作过程又能观察到细胞的生长情况。
1 材料1.1 仪器培养箱、培养瓶、玻璃漏斗、吸管、移液管、纱布、水浴锅、手术剪、镊子、培养皿、烧杯、瓶塞、培养盘、蛋托、超净工作台、显微镜、三角烧杯、95%酒精、75%酒精棉、碘酒棉、废液缸等。
1.2 种蛋SPF种蛋，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。
1.3 犊牛血清多用胎牛或犊牛血清。
由颈动脉无菌放血。
采血前先向瓶内加些等渗盐溶液湿润瓶避，采血后置室温或37℃温箱内待血液完全凝固后，有灭菌玻棒将血块自瓶壁分离。
随后再置室温或4℃冰箱内一天，即可吸取血清，如有少量红细胞可离心沉淀除去。
经滤过除菌分装，置-20℃冻存，使用前56℃水浴中灭活30min。
1.4 溶液1.4.1 Hank，s液NaCl16g、Na2HPO40.304g、KCl 0.8g、KH2PO40.12g、MgSO40.4g、C6H12O60.28g、酚红2mL、水解乳蛋白10g、加蒸馏水至2000mL高压灭菌116℃30min。
2g、CaCl21.4.2 酚红苯酚红1g、NaOH0.12g加蒸馏水至200mL。
1.4.3 7.5%NaHCO3溶液NaHCO36g、加蒸馏水至80mL高压灭菌116℃30min。
1.4.4 EDTA胰蛋白分散液（滤过）NaCl8g、NaHCO30.5g、KCl0.4g、胰蛋白酶0.5g、C 6H12O61g、EDTA0.2g、1%酚红0.2mL加蒸馏水至1000mL。
1.4.5 消化鸡胚用胰酶液（滤过）NaCl 8g、KH2PO4 0.06g、KCl0.4g、胰酶2.5g、C6H12O61g、1%酚红2mL、Na2HCO30.152g加水至1000mL。
1.4.6 双抗（滤过）青霉素200万单位、链霉素200万单位加蒸馏水至200mL。
1.4.7 MEM液（滤过）MEM9.606g、NaHCO32.2g加蒸馏水至1000mL。
2 方法2.1 鸡胚的选择与孵化应选健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。
受精蛋最好不含有母源抗体，特别是针对培养病毒的抗体，为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好；蛋壳要干净，孵化前最好不洗。
卵必须新鲜用孵卵箱孵化，一般不宜保存过长时间，通常保存期不应超过10天，即5天以内最好，而且不宜在高温下保存，通常保存于4～20℃，以10℃条件下最好。
要特别注意温度、湿度和翻蛋。
孵化条件一般选择相对湿度为60%，最低湿度36%，一般37.5～39℃。
每日翻蛋最少3次，并注意空气流通，大头向上，注意鸡胚位置。
孵化3～4天，可用照蛋器在暗室观察，鸡胚发育正常时，可见清晰的血管及活的鸡胚，血管及其主要分支均明显，呈鲜红色，鸡胚一直在活动。
未受精和死胚胚体固定在一端不动，看不到血管或血管消散，应剔除。
2.2 鸡胚原代细胞制备2．2．1 营养液的配制在Hank，s液中加入青霉素、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL，再用7.5%NaHCO3调整PH至7.2～7.4；置4℃冰箱保存，将胰蛋白酶PH值调整为7.6，分装于小瓶中，置-20℃冰箱保存。
操作前将Hank，s液和胰蛋白液置37℃水浴锅中预热备用（注意，胰蛋白酶溶液不宜反复冻融）。
2.2.2 取胚及剪碎取10日龄鸡胚，在超净工作台内，将胚蛋气室端向上放置，在气室部用5%碘酊消毒后，75%酒精棉脱碘，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜、绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。
减去头部、翅、爪及内脏，用PBS或Hank，s液洗去体表血液，移入灭菌三角烧瓶中，用灭菌剪刀剪碎剩余鸡胚组织，使之成为1～2mm大小的碎块,加PBS或Hank，s液轻摇，静置1～2min，使之组织块下沉。
吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸完Hank，s液，组织碎片置三角瓶底。
2.2.3 消化置水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量5～6倍加入烧杯中（每个胚5～挥发及污染。
37℃水浴10～30min，由于胰酶作用，使10mL），三角瓶上加塞，以免CO2细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，此时再轻摇三角瓶，可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
消化完全后，加入培养液以终止胰酶消化作用。
2.2.4 细胞分散取出三角瓶后静置2min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用Hank，s液反复清洗3次，以洗去胰酶，尽量吸完上清液，留下组织块。
加2mL含血清的MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞冲散，此时可使营养液混浊即为细胞悬液，静置1min，使未冲散的组织块下沉后，上层细胞悬液通过带6～8层纱布的漏斗过滤一次；进行细胞计数，静置培养时将细胞悬液调成含100万～250万个细胞/mL。
2.2.5 细胞分装培养将集细胞瓶中的细胞摇匀，再加入适量的营养液，使每毫升含细胞50万～60万个左右，按细胞液总量10%加入犊牛血清、双抗100IU/mL，调节PH值为7.0～7.2，用正压方法将细胞分装到细胞培养瓶中，每瓶1000mL（细胞瓶容量1%）。
分装完毕，在火焰控制下，除去分液管道，将细胞培养瓶塞上各管管口换上一头塞有棉花的胶头开口折扎好，在瓶颈以上用40cm×40cm的牛皮纸将瓶口及胶塞包扎好送温室转瓶培养；细胞培养液的营养成分含量相对来说是固定的，它只能支持一定数量细胞生长与分裂，原代细胞培养细胞的数量不宜太多，否则细胞分裂后，营养液中的氨基酸含量因消耗而下降、营养液的营养水平难以维持，反过来还会限制细胞的生长。
2.2.6 细胞观察单层细胞培养，由于细胞具有停泊依赖性，细胞必须贴附在瓶壁上才能生长，让它悬浮在液体介质中（如悬浮在营养液或维持液中），细胞很快就会死亡。
原始的单层细胞培养液的工艺方法比较简便，只要培养容器和培养液能满足分裂繁殖需要，密封性好，完全可以达到培养的目的。
（1）细胞瓶置转瓶架上，要随时查看转动情况；在48h内严禁搬动，72～96h要逐瓶检查细胞生长情况，并记录生长情况和细胞密度。
培养细胞一般于24h左右开始分裂；（2）出使时细胞分裂形成若干个细胞岛，以后再连成片，培养24～96h后大都能形成致密单层；（3）判别细胞生长情况常以贴壁好坏作为标准，用下列符号对细胞生长情况进行评估；（-）：表示细胞不贴壁或贴壁不分裂；（+）：细胞贴壁伸展或形成孤立细胞岛，其覆盖面积占瓶壁的25%左右；（++）：细胞分裂成较大的岛状，覆盖面积占瓶壁50%或50%以上；（+++）：细胞覆盖面积达瓶壁75%以上，透明度好，立体感强；（++++）：细胞满瓶覆盖，形成致密单层，透明度好，立体感强，形态丰满。
2.3 细胞传代选取生长良好、以形成致密单层（++++）的细胞培养瓶；在无菌室中，于每瓶细胞中加入100mL左右的分散液（EDTA）。
加液后，轻而快地转动细胞瓶，使EDTA与瓶壁细胞充分接触，并随时注意观察瓶壁上细胞层的变化情况。
待瓶壁上细胞层开始出现轻微的龟裂（像干旱水田的干裂缝隙样）时，立即倒去EDTA，加入营养液（含牛血清10%，双抗0.5%PH6.8～7.0的乳汉液）充分摇动，使营养液沿瓶壁转动冲刷壁上细胞，直至细胞完全脱落为止。
然后按所需要量加入营养液，摇匀后分装。
分装率为1:2如为传代细胞系，其分装率可提高到1:3甚至1:4。
做好标记放37℃培养箱中培养。
3 结果与分析共消化7批细胞，01批细胞和06批细胞分别与消化后48小时、02批细胞传至第3代时，细胞形态发生变化，产生细胞病变，培养液发生混浊，确定为细菌污染。
03批细胞和04批细胞传至第5代时，细胞形态发生变化，产生细胞病变，但是培养液没有发生混浊，可能是病毒污染所致。
05批细胞传至第11代时，细胞形态发生变化，产生细胞病变，培养液发生混浊，确定为细菌污染。
07批细胞传至20代时，细胞能够与48～72小时长成良好单层，从21代后细胞生长开始缓慢，传至24代时7天后也没有长成单层。
出现这种情况的原因有待进一步研究。
见表1。
表1 各批次细胞传代情况批次 01批 02批 03批 04批 05批 06批 07批代次 0 2 4 4 10 0 204 讨论影响细胞生长的因素很多，除了生长液和维持液因素外，还有以下主要因素。
4.1 温度细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体温相似，一般为37～38℃,高温易导致细胞死亡，低于可减慢或终止细胞的增殖。
4.2 PH细胞培养最适PH一般为7.0～7.4，因细胞种类不同而稍有差异，通常以不低于6.8和超过7.6为宜，当低于6.8和超过7.6时，对细胞生长会有抑制作用。
4.3 气体细胞生长需要O2和CO2。
再用橡皮塞密封的培养瓶内，由于生长液中的-HCO3及细胞生长时分解糖而排出CO2。
可供细胞代谢的需要。
如用CO2培养箱培养，则更有利于细胞生长，培养瓶不需要密封。
4.4 细胞接种量细胞浓度与形成细胞单层的速度成正比。
当细胞贴壁以后，细胞代谢过程中产生刺激细胞分裂物质，这种物质需要达到一定浓度时才能促进细胞的分裂繁殖，细胞量过少，排出的刺激细胞分裂的物质少，作用小，而细胞不易形成单层，容易死亡，但接种量过大，形成单层后很快脱落，致使死细胞和细胞碎片对分裂细胞发生毒性作用，导致细胞生长受到抑制，甚至死亡。
