微生物基因分型鉴定系统
背景：
分子生物学技术在近几年的迅速发展和普及，使得微生物学鉴定得以摆脱传统生化鉴定方法的局限，跨入新的历史进程。较上世纪已经出现的生化鉴定法，基于分子生物学技术的微生物鉴定系统的优越性主要表现为：可鉴定的种属范围均大大扩展；可靠性和灵敏度显著提升；整体检测时间降低。ThermoFisher 公司的MicroSEQ?自动微生物基因分型鉴定系统分型系统是目前技术最为成熟、应用最为广泛的基因分析鉴定系统，现已广泛应用在药品、食品及工业微生物的鉴定分析上，以下内容将对这一系统做更为全面的介绍。
2015版药典中指出，测序是微生物鉴定的最终解释方法
1.在药品微生物鉴定领域的应用
2008年度全球排名前25位的制药集团中，有22家集团已经将ThermoFisher公司的MicmSEQ?自动微生物基因分析鉴定系统用于其日常微生物检测中。
美国FDA在对生产无菌制剂和生物药品的指导性纲要《工业指南用无菌工艺生产的无菌产品一现行GMP》中更是明确提出“快速遗传类型测定方法被建议用于鉴别目的，因为这种方法已经证明比生物化学方法和表型技术更精确和准确。”除美国之外，澳大利亚、日本及欧盟的药典中也已明确推荐使用基因分析的方法用于微生物的鉴定。
2.微生物鉴定基本原理:
16S rRNA基因是伯杰氏手册(Bergey’Manual)细菌菌种分类的客观基础，也是DNA测序鉴定分型的基础。MicroSEQ?微生物鉴定系统是专门为微生物测序分型所设计，结合最新的DNA测序技术、强大的分析软件，通过对细菌共有的16S rRNA基因进行自动化测序得到细菌鉴定结果；而对于真菌鉴定则通过对真菌26S rRNA基因上的D2基因片段进行测序。
3.检测平台：
Applied Biosystems?基因分析仪以可靠性和值得信赖的结果为立足点。作为Applied Biosystems?毛细管电泳(CE)基因分析仪产品系列的最新成员，SeqStudio基因分析仪同样基于这一理念，但同时又追求易用、易维护，易于存取和便于分享数据。其先进特性在于将Sanger测序和片段分析的可靠性，与远程监控 和云应用便利性结合在一起。
多功能卡夹在最大程度上提升了平台的高效和便利。SeqStudio基因分析仪采用一种含有毛细管阵列、POP胶以及阳极缓冲液的多功能卡夹。该卡夹可插拔，并可在仪器上存放达四个月之久。每个卡夹上均含有SeqStudio系统所独有的新型聚合物，无需重新配置即可进 行Sanger测序和片段分析。配备4道毛细管可以处理来自 标准96孔板或8联管的样品。卡夹和阴极缓冲液容器均带有射频识别(RFID)标签，可跟踪二者各自在仪器上加样(卡夹)和存放的时长(阴极缓冲液)。这一特性使科研人员可以利用同一台仪器，根据需要管理并使用自己的卡夹，进一步提高灵活性。最后，SeqStudio基因分析仪的维护工作也得到简化。仪器校准工作通过成像和算法工具的先进功能 自动化完成。
SeqStudio仪器采用紧凑的外观设计，同时配有机载计算机和一体触摸屏，可以快速、直观、灵活的进行运行设置。运行软件经过专门配置，可在运行不中断的情况下， 在同一块板上设置测序和片段分析反应并在仪器上运行。例如，在同一次 CE 运行中，可将基于测序的位点突变筛选检测与基于片段分析的CNV检测结合在一起。同时仪器具备无线
连接功能。可以通过联机触摸屏，远程计算机和移动设备 APP 操作仪器。只要能上网，就能随时随地地访问运行设置、 反应板图、运行条件和分析设置。加样条件、重新加样和 重新调整加样次序可在运行期间调整，从而最大限度提高从每块板采集优质数据的能力。采集数据后，基于网页浏览器的应用程序组合包(Sanger Quality Check、Sanger Variant Analysis和Next‐Generation Confirmation (NGC) )可轻松、方便地分析数据。
4.产品性能：
?强大的细菌和真菌鉴定功能：
现有的配套数据库已建立2100种细菌和1114种真菌的的序列信息，其中已经包含非发酵性革兰阴性菌、杆状菌、棒状杆菌、分枝杆菌、葡萄球菌、放线菌等。所有录入的序列都经过验证以确保正确的鉴定结果。在现有数据库中，已经包括了制药生产环境和药品成品中已知的绝大部分细菌和真菌。
用户还可以将检测获得的数据与NCBI公共数据平台上的已知数据分析比对。
与此同时，用户也可以将自己独有的菌种序列加入MicroSEQ?数据库或者加入其他新的序列，从而建立自己个性化的菌株序列文库。
此外，因为该鉴定方法是基于核酸序列的分析，不同的微生物具有不同的核酸序列，所以随着越来越多微生物物种的核酸序列被破解，鉴定范围可以无限延伸。
?鉴定成功率大大提高：
传统的生化鉴定系统，鉴定成功的很重要前提之一是要确保微生物处于良好的生长状态，因为只有生长状况良好的微生物才能表现出典型的生化特征。因此，传统生化法往往需要很长的时间用于目的细菌的分离、修复，且生化法对难培养的细菌常常束手无策。但是，ThermoFisher公司的微生物鉴定系统是基于16s rRNA核酸序列的分析，对于每种细菌而言，其高度保守的16s rRNA核酸序列不受生长条件和外在环境的制约，即使是难培养的细菌，也能保证获得良好的鉴定结果。统计数据显示，使用ThermoFisher公司的MicroSEQ?微生物鉴定系统，鉴定失败率可以从传统生化鉴定方法的20% 以上下降到2% 以下。
?快速获得结果：
得到细菌/真菌的单菌落后，可在5小时内完成鉴定，这是传统的检测方法往往需要数日甚至更长时间才能完成的工作。
此外，因为对微生物生长状态没有要求，在细菌培养时间上也比传统生化方法大大缩短。
?良好的操作性：
不需要任何菌种分类的知识，不需要进行革兰染色和生化检测就能够得到准确、高重复性的实验结果。
操作简便，单菌落的挑取、DNA提取、PCR扩增、测序反应、软件分析几个简单的步骤即可获得微生物鉴定结果。
?功能强大的应用软件：
拥有微生物DNA测序和比对软件。MicroSEQ?ID软件自动将测序结果与MicroSEQ?微生物数据库中经过验证的序列进行比较，得到一个比较序列分析结果最接近的菌株清单。
检测结果根据样本的遗传距离排列，在显示屏上以种系发生树方式显示, 非常方便了解物种间的亲缘关系。（参见下图）
ThermoFisher 微生物基因分型鉴定系统与 Vitek 2的对比分析
对比项目
MicroSEQ微生物基因分型鉴定系统bioMerieux Vitek 2 微生物鉴定系统技术平台 自动基因序列分析 约15种生化、代谢反应的汇总
鉴定范围 细菌：包括2100种各种类型的细菌
真菌：包括1114种真菌；霉菌、酵母菌均可
鉴定
延展性：随着数据库的补充，鉴定范围还在
不断扩展 细菌：约600种，无法鉴定放线菌
真菌：可以鉴定约50种酵母菌，无法鉴定霉菌
延展性：生化鉴定方法已经发展到平台期，鉴定范围基本没有继续扩充的空间
对样品的要求 对菌的生长状态没有要求，即使是难培养的菌生长状态必须良好，菌长势不好或难培养
菌也能获得结果 的菌会对检测结果造成影响
结果成功率及准确度 1.对制药行业常见的18个ATCC标准菌种鉴定
的准确性达到100% （参考文献：Alexander, R, et
al., New Technologies Forum 6: Rapid Methods in
Microbiology Report. European Pharmaceutical Review, 2,
43-49, 2003.）
2.只要能得到微生物DNA，就能得到结果
3.即使极少数样品序列在现有数据库中无法
找到匹配结果，会提示No ID，不会出现
Wrong ID
4.杂菌混合样会在显示屏上明显辨出
1.30%-70% （参考文献：Alexander, R, et al., New
Technologies Forum 6: Rapid Methods in Microbiology
Report. European Pharmaceutical Review, 2, 43-49, 2003.）
2.只能鉴定活的微生物
3.可能出现错误检测结果的情况，即可能将A
菌判断为B菌
4.杂菌混合样会干扰检测结果，导致错误的
结果
5.对于水产品的检测，VITEK效果较差，可能
因为水产品成分比较复杂，对基于酶联免疫
的方法有干扰。
6. 无法准确鉴定空肠弯曲杆菌，在VITEK上
只能鉴定出弯曲杆菌属，要鉴定空弯，必须
要配合其他生化试验
系统开放程度 支持建立个性化的菌株序列文库
即使现有数据库中无法找到匹配结果，仍可
以与NCBI平台上与新进研究进展比较序列信
息，且可以在不同实验室间共享和分析
没有此功能
检测时间 培养时间：18-24小时
实验操作时间：5小时
总时间：小于23-29小时
总时间：53-120小时
对操作失误的响应 可在实验过程中校正是否存在操作误差 实验中途无法判断实验过程中是否存在操作
错误
实验成本 检测成本由检测数量决定 综合考虑检测时间、有时无法得到准确检测
结果等因素带来的损失，实际高成本
其他功能 还可用于微生物溯源分析。对药品污染事件
的溯源分析很可能将成为药品监管的下一步
工作内容
可以做植物和微生物基因组的AFLP分析以及
其他测序，片段分析，SNP分析等 不具备溯源分析功能
没有AFLP，测序和SNP等更深入的微生物分析功能
可以做药敏试验，但药敏试验主要在医院，CDC等单位使用，药检部门无需此功能
5.一套完整和高效的微生物鉴定解决方案：
对于实验室来说，如何建立一套完整高效的微生物鉴定系统至关重要。这其中，既要考虑常规检测所涉及的简便性、实用性，也要考虑建立行之有效的能解决困难样本的能力。如何将这两方面的要求结合在一起，是最为重要的。
利用MicroSEQ全自动微生物鉴定系统，不仅能完成到种水平的鉴定，还能够完成菌种分型以进行进一步溯源分析。
MLVA，AFLP等分子分型方法可在微生物鉴定系统上完成，进行污染源的调查。例如利用AFLP的方法调查终产品中微生物的来源。
基于 AFLP 的微生物分型可以实现同一血清型下不同来源菌株的区分，利用毛细管电泳平台的高分辨率和稳定性，将选择性扩增的限制性酶切片段信息 快速分析出来，并对不同样本使用不同的荧光标记，以得到菌株的特异性指纹信息。
Micro SEQ?ID鉴定系统并结合其他分子分型技术 AFLP可以最大限度的满足对微生物鉴定的快速，准确，共享的要求。其标准化的试剂，标准的流程，软件对数据质量的分析
最大限度的保证了鉴定结果的一致性，具有可重复性高，操作易掌握，对样本要求低，精
度高，准确度高，数据可共享，可自建数据库等特点，除了鉴定还同时具有分型溯源等功
能。
Micro SEQ?ID的应用将极大的提升实验室的鉴定能力，并对污染源的溯源及调查提
供更好的支持。
此外，在建立大型的鉴定系统时，还必须用发展的眼光从长远的应用着手，建立一套
至少在接下来3‐5年能保证技术水平不落后的检测手段。这也对如何在众多鉴定系统中正
确选型提出了很高的要求。
基于以上几个方面的考虑，我们推荐您采用以下的组合方式建立贵实验室的微生物鉴定体系：
应用实例
1：MicroSeq系统应用于药厂生产区域微生物鉴定
《欧洲药物学综述》中发表的文章，就药厂生产区域常见的18种微生 物进行鉴定， 对多种快速微生物鉴定的方法进行比较， 结论是MicroSeq系统是唯一能
够进行100%分型鉴定和100%重现性的系统。
应用实例2：浙江药监所利用MicroSeq系统进行药品控制菌检查的研究
结论，采用生化鉴定和测序对32株菌进行鉴定，鉴定结果基本一致。 生化鉴定部分菌株只能鉴定到属，而通过对16S rDNA和LSU rDNA测序部分菌可鉴定到种甚至亚种水平。生化鉴定操作过程相对复杂繁琐，影响因素较多。因此，测序鉴定的结果准确、可靠、分辨率高，能够鉴定到种、亚种，而且操作简单、标准的操作流程，结果重现性高。
千里马招标网https://www.doczj.com/doc/a812500314.html, 政府采购谈判 文件 采购编号：SZWK-XC-T-号 采购项目：全自动微生物鉴定及药敏分析系统采购单位：苏州市相城区第三人民医院 项目类别：医疗设备 苏州市卫康招投标咨询服务有限公司 二〇一八年八月
谈判邀请函 ： 受苏州市相城区第三人民医院的委托，苏州市卫康招投标咨询服务有限公司对其所需采购的全自动微生物鉴定及药敏分析系统在国内组织竞争性谈判采购。欢迎符合采购文件资格要求的供应商前来报名参加谈判。 一、采购编号：SZWK-XC-T-号 二、采购内容及数量：全自动微生物鉴定及药敏分析系统一套 三、采购预算：.元整 四、参加谈判的供应商资格要求： A、供应商的一般资格要求 、具有独立承担民事责任的能力； 、具有良好的商业信誉和健全的财务会计制度； 、具有履行合同所必需的设备和专业技术能力； 、有依法缴纳税收和社会保障资金的良好记录； 、参加招标活动前三年内，在经营活动中没有重大违法记录； 、法律、行政法规规定的其他条件。 B、供应商的特殊资格要求 、具有医疗器械生产（经营）企业许可证； 、具有所投产品的合法代理资格。 五、参加谈判报名及领取谈判采购文件时间：自公告发布之日起至月日每日：～：，：～：（节假日除外）； 参加谈判报名及领取谈判采购文件地点：苏州市干将西路号号楼四楼苏州市卫康招投标咨询服务有限公司； 领取谈判文件时请提供以下材料并加盖公章（复印件需提供原件现场核查）： 、企业法人营业执照副本复印件（三证合一）； 、法人授权委托书（报名经办人必须为投标单位正式员工，提供社保缴纳证明及劳动合同等材料）； 、医疗器械生产（经营）企业许可证复印件； 、所投产品的合法代理资格证明材料。 六、谈判时间、地点： 、递交谈判响应文件的时间：年月日：~：（北京时间） 地点：苏州市相城区庆元路号相城区市民服务中心三楼会议室 、递交谈判响应文件的截止时间：年月日：：（北京时间）
A B C D 高鹃 新版GMP 与快速微生物检测鉴定技术新版GMP 与 快速微生物检测鉴定技术 3.快速鉴定技术 4.法规与药典要求 第一部分引言无菌药品生产要求的大幅度提高 新版GMP 无菌药品附录 以上各级别空气悬浮粒子的标准规定如下表： 洁净度级别 悬浮粒子最大允许数静态 ≥0.5μm ≥5.0μm A 级(1) 352020B 级352029C 级3520002900D 级 3520000 29000 洁净级别 浮游菌cfu/m 3 沉降菌（φ90mm ）cfu /4小时 表面微生物 接触cfu /碟（φ55m m ） 5指手套cfu /手套A 级<1<1<1<1B 级10555C 级1005025 － D 级 200 100 50－ 洁净区微生物监测的动态标准 工业工程技术要求隔离装置隔离器Rabs RTP 公用工程 水系统空调系统氮气压缩 空气真空传送系统动态环境监测系统粒子监测沉降菌浮游菌
动态环境监测带来的新课题 １、大量数据的管理和分析 ２、面对细菌培养阳性结果发生争执 是生产管理方面的问题？ 是QC 的OOS ？３、细菌培养阳性结果的后续处理明确what where who how 革兰氏染色无法判定 无菌药品生产要求的大幅度提高 未污染 ？ 无菌药品生产要求的大幅度提高 无菌药品附录： 产品的无菌或其它质量特性绝不能只依赖 于任何形式的最终处理或成品检验（包括无菌检查）。 微生物检测技术的飞跃发展 快速检测技术（不需进行培养PAT ）快速鉴定技术（属种株）为无菌药品生产和质量管理提供了先进技术手段及时发现污染，追溯污染源 案例： 爱吃桔子的员工 一直难以去除的革兰氏阳性短棒状菌燃烧麦秸杆与无菌药品生产车间
全自动微生物鉴定/药敏系统VITEK 2 COMPACT 30 1、设备的主要用途、功能及特点 该系统为完整的全自动细菌鉴定和药敏分析系统,细菌鉴定采用生化反应数码鉴定原理。可以以最少的实验人员及最短的准备和处理时间，提供最准确的测定结果。数据库应涵盖革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、芽胞菌、酵母菌、奈瑟氏菌及嗜血杆菌、厌氧菌；必需有生物反恐菌的鉴定能力（鼠疫杆菌、霍乱弧菌、吐拉菌等） 2、技术参数及指标 ①系统组成：电脑主机为国际知名品牌原装PC；另有比浊仪、充填系统、读数 孵育系统、数据处理系统、废弃物收集系统、打印机等； ②检测原理：采用生化反应数码鉴定原理，结合终点法、阈值法、特别是动态 分析法的检测原理，24小时连续自动检测，并时时出报告； ③充填处理量：每批可同时填充10个试剂卡。 ④充填方式:：利用真空原理进行试剂卡的填充。 ⑤菌液用量：3ml。 ⑥试卡密封方式：自动热切割掉试剂卡上的菌液传送小管，进行密封。 ⑦鉴定速度：每15分钟对同一卡片进行1次光学检测。细菌5小时内鉴定率达95%， 一般3-5小时，酵母菌≤18小时，芽孢菌≤14小时。 ⑧鉴定准确率：90% 的试验将报告单一的鉴定结果。 ⑨鉴定范围：鉴定细菌种类齐全，含概革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、芽孢 菌、奈瑟氏菌嗜血菌弯曲菌、厌氧菌，要求≥550种菌。 ⑩药敏功能：平均药敏检测时间7小时，专家规则同时符合美国CLSI、德国DIN、法国AFNOR标准。 ?自动化程序：自动接种、全封闭实验板、自动培养及判读、打印结果、自动收集废弃物。 ?试卡设计：试卡上有64微孔，内含有鉴定或药敏所用的生化或抗生素干燥底物； 实验过程中除需要从厂家购买鉴定卡和药敏卡之外无其他专用附加试剂和耗材，可
第一章微生物检验常规鉴定技术 课堂教学计划（1学时） 第一章微生物检验基本知识 包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。 接种、分离纯化和培养技术
一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C 左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至
微生物自动化鉴定系统的工作原理 微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配 套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药 敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。 一、微生物数码鉴定法 早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作 提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和 形成独特的不同细菌鉴定系统。如、、、和等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。 ( 一)数码鉴定法基本原理 数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索 本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并 比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。 1．简要介绍计算步骤： (1)出现频率（概率）的计算：将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率：①对阳性特征，则除以100即得。②对阴性特征，除以1
00的商被1减去即可。③说明：对“0”和“100”，因这2个数太超量，为了使结果不出现过小或过大，而用相似值0.01或0 .99值代替。 (2)在每一个分类单位中，将所有测定项目的出现频率相乘，得出总出现频率。 (3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加，除以一个分类单位的总出现频率，乘100，即得鉴定%（） (4)在每个菌群中，再按值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率，得到模式频率T 值，代表个体与总体的近似值。T值越接近1，个体与总体越接近，鉴定价值越大。按大小排序，将相邻两项的之比为R， 代表着首选条目与次选条目的差距，差距越大，价值越大。如果≥80，参考T及R值可作出鉴定。 2．在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式（以鉴定系统为例）。 (1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值（和T值）。②对鉴定结果好坏的评价，最佳……等。 ③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时，鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结 果。⑤指出某些注意要点，需用“推测性鉴定”，并将此菌送至参考实验室；需用“血清学鉴定”，作进一步的证实等。 (2)无此数码谱：可能有以下原因：①此生化谱太不典型。②不能接受，鉴定值低(＜80.0)。③可疑。需进一步确认是否 纯培养，重新鉴定，可与供应商技术服务部联系。 3. 结果解释
设备名称：全自动微生物鉴定及药敏分析系统 一、具体用途：对食品，环境中的微生物进行快速，全自动的鉴定及药物敏感性测试。 二、技术参数与性能要求： 1. 系统可同时处理》30个标本，系统具有扩容功能，至少可以两台联机； 2. 分析组件可对环境中和食品中的细菌进行全自动鉴定，种类包括革兰阴性菌、革兰阳性 球菌、革兰氏阳性杆菌、酵母样真菌、假丝酵母类真菌、苛养菌、厌氧菌及棒状杆菌等的 鉴定； 3. ★分析组件可对芽孢杆菌进行全自动鉴定； 4. ★大于500种可鉴定细菌，鉴定结果通过美国FDA认证，细菌鉴定采用GB推荐生化鉴定 显色法，药敏检测采用比浊法，并且鉴定方法原理可在GB4789中查询（提供具体细菌库）； 5. ^分析组件可自动进行革兰阴性菌、革兰阳性菌、酵母样真菌、肺炎链球菌等药敏试验， 以上所有药敏试验均得到美国FDA批准用于临床应用（提供FDA证明资料）； 6. ★在对标本的鉴定及药敏试验过程中，无需添加任何额外附加试剂； 7. 快速全自动对细菌进行鉴定和药敏试验，采用实时检测系统，系统每隔15分钟对试剂卡 进行一次扫描读数，一旦确认结果，可马上出报告； & ★细菌最快鉴定时间V 4个小时，平均鉴定时间不超过5小时； 9?最快药敏实验时间5小时，平均药敏实验时间不大于6小时； 10. ★系统可同时进行鉴定和药敏实验，并且可同时上机的鉴定试剂卡种类不少于4种，可 同时上机的药敏试剂卡的种类不少于6种； 11. ★系统自动填充悬浮液至试剂卡，自动密封拭卡，并自动将拭卡装载于设备内置读数系 统/孵育系统，测试结束时可自动丢弃拭卡，操作都在仪器内部自动进行，不需要额外设 备； 12. 卡片填充菌液后为封闭式卡片，不会造成污染； 13. ★鉴定卡和药敏卡必须独立包装； 14. 鉴定卡应至少提供3种不同试剂的SFDA注册证； 15. 药敏卡应至少提供5种不同试剂的SFDA注册证； 16. 测试完成后，经分析软件分析后得出结果并可自动打印报告，并保存结果； 17. 具备中文报告软件系统； 18?双向联网软件，可传输报告结果；
碱法提取小鼠总DNA及基因鉴定： 一、实验器材：加样枪（1ml、200ul、20ul、10ul）、枪头（大中小一套）、EP管（20ul、1.5ml、 10ml）、试管架、浮标、温度计、胶布、手套、记号笔、锥形瓶、称量匙、冰盒 二、实验试剂：A液、B液、引物、mix、双蒸水、三蒸水、琼脂糖、TBE（5x、1x、回收液）、 核苷酸染料、Marker 三、母液配置： 1.10M NaOH:NaOH 40g加双蒸水至90ml，待NaOH完全溶解冷却后定容至100ml 2.0.5M EDTA：EDTA.Na2盐18.61g, NaOH 1.5g, 加双蒸水至80ml,逐滴加入10M NaOH 至EDTA完全溶解后加双蒸水定容至100ml 3.1M TrisHCl（pH8.0）：Tris碱12.1g，加水至70ml，边搅拌边加入浓盐酸4ml，然后 边逐滴加入1M HCl边测PH值，直至PH升至8.0（+\-0.05），定容至100ml（pH=8.8 的TrisHCl中边加入浓盐酸边测PH值至PH=8.0（+\-0.05）为止） 四、实验步骤： 1.剪取鼠尾（约芝麻大小）储存于-20度冰箱（-20度冰箱，主要是防止DNA降解，4度不 行） 2.提取DNA： 1)配置工作液——20ml体系液：50ul 10M NaOH 加双蒸水至20ml 8ul 0.5M EDTA B液：800ul 1M TrisHCl（pH8.0）加双蒸水至20ml 2)加150ulA液（液体应完全浸没标本），95度水浴锅煮1.5h（将EP管插入浮标 中后用胶布缠好防止EP管在加热过程中爆开） 3)加150ulB液，混匀（上下颠倒3-5下） 4)12000r/min 4度离心5分钟（可储存于-20度冰箱） 3.PCR（冰上操作）：P1 0.5ul（P为AC3I，G为AAA） 1)配置PCR体系——15ul体系P2 0.5ul Mix 7.5ul 三蒸水4.5ul DNA 2ul 2)加2ul上述离心后的上清液至PCR体系，瞬离 3)PCR仪扩增，参数设定：预变性：94度——3min 变性：94度——30s 退火：55度——30s 30个循环 延伸：72度——24s 72度——5min 4度——∞ 4.琼脂糖凝胶电泳： 1)制胶——2%琼脂糖凝胶配方： 总体积（ml）20 30 40 50 60 120 琼脂糖（g）0.4 0.6 0.8 1 1.2 2.4 TBE 1x（ml）20 30 40 50 60 120 Tris-base 13.6g TBE 5x配方：硼酸 6.56g EDTA 0.73g
课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"
（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
Biolog微生物鉴定步骤 一检测原理 Biolog微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。.鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。 二所需器材和消耗品： 培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。 三鉴定步骤：
第一步： 在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。 对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。 如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/A w，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养，②在BUG+B培养基上生长非
常差，形成针尖大小的菌落，那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)。大多数苛生菌都是从哺乳动物的呼吸道里分离出来的，如Actinobacillus, Alysiella, Brucella, Capnocytophaga, CDC Group DF-3, CDC Group EF-4, Eikenella, Haemophilus, Kingella, Moraxella, Neisseria, Simonsiella, Suttonella,和Taylorella。 如果是革兰氏阳性菌，用革兰氏染色可以很容易的区分球菌和杆菌，推荐再做一个过氧化氢酶实验，最终确定是球菌还是杆菌。通过革兰氏染色或观察菌落形态可以区分出芽孢杆菌。 微生物的扩大培养应该用Biolog推荐的培养基和培养条件，以便使微生物达到最佳的代谢活性，进而准确的和数据库中的代谢模式匹配。 微生物应该是新鲜的，确保其处于指数增长期，因为一些菌株在达到稳定期时会失去生存能力或代谢活性，推荐的培养周期为4-24个小时。 如果扩大培养的量不足以配制相应的浊度，可以培养多个平板，培养时间可以延长到48个小时。 第二步： 首先确定浊度仪没开启电源的时候，指针应指在0%，如果没有，用螺丝刀调整。开启电源，取未开盖的装有接种液的试管，擦干净管壁，放入浊度仪，指针应指在100%，如果没有，旋动右方旋钮。然后用浊度标准管检验，读数在±2%都是正常的。要使用哪管接种液，就用相应的试管做100%校正，不要在浊度仪的光路中旋转试管。 在鉴定革兰氏阴性肠道菌和苛生菌的时候，在接种液里应该加准确三滴巯基乙酸钠。巯基乙酸钠的作用是抑制芽孢形成，并且可以部分或完全的抑制A-1或其它孔由于微生物利用自身分泌的聚多糖荚膜而出现的紫色。一些非肠道菌液需要添加巯基乙酸钠。 按照下列步骤制备均匀的菌悬液：用接种液将棉签稍微浸湿，用棉签在菌落上面轻轻的滚动可以将菌落取到接种液中，从而不会将培养基或其它营养物质带入接种液。先取单菌落，不够再取生长紧密的菌落。在试管内壁接种液液面的上方，旋转挤压棉签可以将菌落团分散。然后上下移动棉签，将分散的菌落和接种液充分混合形成均一，无菌团的菌悬液。如果菌悬液有菌团，可以让菌团沉到管底。 调整浊度直至达到允许的范围，增加接种液或添加菌落可以降低或升高菌悬液的密度。 将菌悬液接种到鉴定板上，不要超过20分钟。如果长时间部接种到鉴定板上，一些菌会失去代谢活性。 第三步： 将鉴定板编上相应的号码。把菌悬液倒入储液槽，不要全部倒入，因为试管底部可能有未分散的菌团。按照不同的鉴定板所需的加样量进行移液器的程序选择，将移液器头安放到移液器上，必要时可以用手加固，以免
微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。 二、生理生化试验 微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 微生物检验中常用的生化反应有：
BD PHOENIX 100 型全自动微生物分析仪仪器标准操作规程 一、概况和工作原理 1、概况是快速全自动细菌鉴定/药敏系统，能对于临床大多数的革兰氏需氧和苛养厌氧菌；大多数革兰氏阴性的需氧和苛养厌氧菌能进行快速鉴定和药敏实验。它一次能同时做100份鉴定和药敏。 2、细菌鉴定原理BDPHOENIX100的鉴定部分由51个孔组成，采用传统生化、酶一底物生化呈色反应和BD专利的荧光增强法相结合的原理。由一系列改良的发酵，氧化，降解，水解等反应的产物与各类指示剂（酸碱指示剂、酶联指示剂、荧光指示剂）反应，最后被实时仪器检测。 3、药敏试验原理BDPHOENIX100的药敏试验部分由85孔组成，其中84孔包被有抗生素，1孔为生长对照。试验采用微量肉汤二倍稀释法，采用传统比浊法及BD专利呈色反应（指示剂随细菌生长过程中的氧化还原反应而变色的反应）结合的双重检测。 4、BDPHOENIX100的专家系统能对以下的耐药机制进行监测：产ESBL 的肠杆菌科、万古霉素耐药（VRE）的肠球菌、高度的氨基糖肽类抗生素耐药（HLAR）的肠球菌、甲氧西林耐药（MRS）的葡萄球菌、产?-内酰氨酶（BL）的葡萄球菌。 二、基本结构 1、菌液配置CrystalSpec比浊仪、鉴定管4.5ml（2～25oC）、药敏管8ml（2～25oC）、药敏指示剂（2～8oC、启封后14 天内保持稳定）、鉴定或鉴定加药敏板。 2、孵箱由计算机控制下的孵箱，孵育箱内置可旋转的直立圆柱体，一次可置100份标本鉴定和药敏。 3、工作站由标本扫描装置、标本基本信息输入的键盘、液晶屏幕、快捷键组成。 三、操作步骤 1. 加样 1.1 将鉴定和药敏板放在加样盘上。注：手持板条时，不要触及板条的正面；鉴定/药敏板启封后应在2小时内使用。 1.2 标注实验室编号。注：标记不要影响到ID/AST检测孔的判读；请勿使用带有荧光的标记笔。 1.3 将肉汤试管放在加样盘上；鉴定管放在左边；药敏管放在右边。 1.4 用鉴定管配制0.5麦氏单位菌悬液。注：配好的菌液必须在60分钟内加样完成；请勿使用金属接种环加样。
基因敲除小鼠的PCR鉴定 一、实验目的： 通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。 二、实验原理： 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 1.PCR原理： PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1) 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2) 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3) 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 2.琼脂糖凝胶电泳原理： 在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4~30℃之间）无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，与电场强度（小于5V/cm）成正比。 三、实验操作 1.获取鼠尾组织 剪鼠尾0.5cm置于试管中，加入500ul裂解液和10ul蛋白酶K(20mg/ml)，55℃水浴过夜，至鼠尾溶解 2.提取基因组DNA 1) 试管中加入300ul饱和NaCl，充分混匀，12500rpm 离心20min
VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用 近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。 近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。VITEK已被许多国家定为细菌最终鉴定设备，并获美国药品食品管理局（FDA）认可。该系统有高度的特异性、敏感性和重复性，还具有操作简便、检测速度快的特点，绝大多数细菌的鉴定在2～18 h内可得出结果。现将该系统的工作原理、主要结构、功能并结合我们使用后的一些体会介绍如下。 1工作原理 VITEK对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础，不同种类的VITEK试卡（检测卡）含有多种的生化反应孔，可达30种。将手工分离的待检菌的纯菌落制成符合一定浊度要求的菌悬液，经充填机将菌悬液注入试卡内，封口后放入读数器/恒温培养箱，根据试卡各生化反应孔中的生长变化情况，由读数器按光学扫描原理，定时测定各生化介质中指示剂的显色(或浊度反应，然后把读出信息输入电脑储存并进行分析，再和预定的阈值进行比较，判定反应，再通过数值编码技术与数据库中反应文件进行比较，最后鉴定报告将在显示器上自动显示)并在打印机上自动打印。 2VITEK系统的结构组成 2.1检测卡 目前VITEK系统的检测卡有14种，微生物常用的有7种，即：革兰氏阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰氏阴性菌卡（GNI+）、非发酵菌卡（NFC）、酵母菌卡（YBC）、厌氧菌卡（ANI）、芽胞杆菌卡（BAC）、奈瑟氏菌嗜血杆菌卡（NHI），以及药敏检测卡等。每张检测卡对应接种1份标本，检测卡为一次性消耗品。 2.2充填机将待测菌的菌悬液注入试卡内。 2.3读数器/恒温箱可在培养过程中定时读出细菌在试卡内培养基中的生长变化值。 2.4电脑主机/显示器/键盘/打印机用于储存和分析资料、系统的操作和结果分析鉴定，实验结果的自动显示报告和打印。 2.5电源稳压器和UPS在外围断电的情况下提供电脑主机约10 min持续电源。 3VITEK系统的功能
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微生物鉴定指导原则
本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定， 以及药物 原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指 导。当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其 进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药 品微生物检验中的重要环节， 药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确 规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则 1106）中选择培养 基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法” （通则 1101） 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验 室微生物监测和控制指导原则（通则 9203）建议对洁净室和其他受控环境分离 到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在 药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终 产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数 非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中， 对所检出微生物的常规 特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法，某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧 化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌 检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装） 失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行 初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到 的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与 方法和数据库的局限性息息相关， 未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准 微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没 有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户
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全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2操作规程 1、目的 规范操作程序，正确使用仪器，保证检测工作顺利进行，更好地维护保养仪器。 2、适用范围 适用于全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2的使用操作。 3、程序 3.1开机： 1 先开稳压电源，然后开UPS、打印机、终端、读数器，最后开电脑。 2 等待屏幕出现，输入用户名及密码，双击VITEK 2-compact软件进入主菜单。 3 点击Enter图标，进入试卡编辑菜单。 4 点击试卡图标，选中BAR CORD。 5 扫描试卡；载卡架信息：可以用条码扫描器输入，也可自下拉菜单选择。 6 输入实验号和菌株号保存。 3.2测试标本 1 标本的稀释：选取经纯培养18～24小时后，大小为3mm左右的待测菌落2～3个，置于装有3 mL 0.45 %生理盐水的试管中进行稀释，用标准比浊计测菌液浓度（如浊度高加生理盐水，浊度低加菌落）。最后的菌液浓度必须达到测试卡所要求相应标准度。将试管放到样品架上。 2 卡片标记：从冰箱中取出测试卡，放置2～3分钟，使温度与室温相同。 3 卡片充样：将测试卡放在载卡架上，输样管浸入装有待测菌液的标准管中。将载卡架放入仪器的填充仓，按START FILL触点开关，约70秒左右，填充完毕。 4 填充完毕后，待蓝色指示灯闪烁，将载卡架取出，在十分钟之内取出并放入
装载仓。 5 仪器自动扫描条码，审核所有输入的卡片信息是否正确，确认无误后自动进行封口和上卡。操作完成后，待蓝色指示灯闪烁时才能打开装载仓门取出卡架。 3.3关机程序： 1 先将读数器状态窗口关闭，待系统接受，退出主菜单。 2 按下仪器上功能键，选择Maintainance键。 3 点击Shutdown键，关仪器。 4 依次关闭仪器电源、UPS、稳压电源。 5关机次序：先关电脑，再其他附件。
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），
利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
全自动微生物快速检测质谱仪 一设备名称：微生物快速质谱鉴定仪 二主要技术规格及系统概述： 1. 微生物快速鉴定仪主要由质谱仪主机和微生物数据库、计算机工作站、软件等组成。主要用微生物快速鉴定和分型。 2．技术规格与要求： 2.1 分子量范围:1-500KDa 2.2．灵敏度：大于250 fmol BSA（m/z66,000），信噪比50：1 2.3．质量准确度：蛋白混合物：< 200 ppm 2.4．激光器： 2.4.1 气态激光器 *2.4.2最大频率≥50Hz，且激光频率在其范围内任意连续可调。 2.4.3．激光照射次数≥60,000,000 shots 2.5．离子源及清洗方式：独立的自动清洗离子源装置，可软件控制，方便日常维护，确保仪器长期稳定运行。 2.6．检测器：检测器具有长寿命、宽的动态范围、高分辨和高质量精度。 2.7．真空泵：采用无油真空泵，运行噪音低保证科室工作环境安静，后期免维护，节约成本。 2.8．离子源：离子源电离处为无网格设计，提高仪器检测灵敏度。离子源具备红外激光自动清洗功能，无需泄真空，方便日常维护，确保仪器长期稳定运行。 2.9．稳定性：校准标准品为蛋白质混合物且校正能保持24小时 2.10. 自诊断系统：提供自动化的自诊断程序。
2.11. 远程监控：提供安全的ISDN点对点连接，实现远程服务。 2.12．软件： 2.12.1 基于Windows操作系统的仪器控制、数据采集、数据处理及分析的全套最新软件。 2.12.2 常规细菌，酵母菌，分枝杆菌、丝状真菌鉴定分析软件。 2.12.3 需要包含IVD和科研操作软件，科研库与临床库采用相同的建库原理和算法，以便确保自建库的可靠性。 3. 微生物数据库 *3.1 微生物数据库含标准配置的细菌、酵母菌数据库，同时配置分枝杆菌、丝状真菌菌库科研库。 3.2 数据库含有大于5600种以上微生物菌株的信息。每一张MSP（数据库内数据）都是平均20-24的平行实验图谱所得统计结果，保持更新。 *3.3 数据库中包括了不少于380个属、总计≥1046个菌种的特征指纹图谱。3.4 允许用户轻松自建微生物数据库，完成数据库的扩充和自定义，且数据库可共享。 4.配置要求 4.1. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪/一套，台式机以节约科室空间 4.2．计算机工作站/一套，激光打印机/一台，UPS电源/一台。 *4.3．不少于3块可重复使用靶板，以便降低检测成本。 4.4．仪器控制软件； 4.5．其它所必需的附件、专用工具和消耗品 4.6. LIS对接联网。
PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用 摘要目的为ApoE基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型ApoE基因和ApoE缺陷突变基因的DNA片段，用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用PCR鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的Southern blot方法检测得到的基因型结果比较。结果野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。用PCR方法获得的ApoE基因分析结果与经典的Southern blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析ApoE基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。 关键词聚合酶链反应基因型基因打靶载脂蛋白E Genotype identification of ApoE Gene Knockout Mice with Polymerase Chain Reaction Objective This study was to explore a simple and quick polymerase chain reaction（PCR）method for genotyping of ApoE knockout mice.Method Two pairs of primers were designed to amplify genomic DNA fragment of wild-type ApoE gene and the same region on ApoE targeting veceor respectively.A gradient PCR strategy was used to test the best annealing temperature. Results A 155bp band was found in wild-type ApoE mice,a 245 bp band in homozygous mutated ApoE mice and both bands in hetemzygous mice.The genotyping results were completely coincided with those from typical Southern blot. Conclusion PCR is a simple,fast and practical method for the genotyping of ApoE gene knockout mice. Key words Poiymerase Chain Reaction genotype gene targeting ApoE 载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化
VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定仪的标准操作规程 1.目的 规范VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定仪的操作规程,保证检验质量. 2.授权操作人 经培训并通过考核合格的微生物实验室工作人员。 3.原理 为光电技术,电脑技术和细菌八进位制数码鉴定技术相结合的鉴定方法。每个鉴定卡内含有64项生化反应,每三项为一组,组内各项反应阳性时分别赋值为1,2,4,然后计算每组数值。根据64项生化反应结果即可获得生物数码。在电脑控制下,读数器每隔15分钟对每一试卡读数一次,对各反应孔底物进行光扫描,动态观察反应变化,一旦试卡内终点指示孔达到临界值,表示此卡检测完成,系统将最后一次判读结果所得的生物数码与菌种资料库标准菌生物模型相比较,经矩阵分析得到鉴定值和鉴定结果。 4.工作环境 相对湿度：20%～80%；温度15～30℃；电源电压：200～240V，50/60Hz。 5.操作程序 5.1 开机 5.1.1 依次打开UPS,交流电源,仪器将自动进行初始化。仪器孵育转盘温度上升至测试卡所需的温度。（5～15分钟） 5.1.2 启动完成之后,屏幕下方的状态区显示OK,代表仪器可以处理测试卡了。 5.1.3 依次打开显示器,打印机,电脑电源,进入VITEK 2 Compact 软件应用界面。 5.2 卡片的选择 5.2.1 鉴定卡 GN：革兰阴性菌鉴定卡；GP：革兰阳性菌鉴定卡；YST：酵母菌鉴定卡；NH:苛养菌鉴定卡；ANC：厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡 5.2.2药敏卡 AST-GNxx:革兰阴性菌药敏卡；AST-GPxx:革兰阳性菌药敏卡。 5.3菌悬液配置及药敏卡稀释 5.3.1 悬浮液 0.45%NaCl 溶液,PH4.5～7.2。 5.3.2 菌悬液浓度：见表1 表1 VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定仪各种鉴定卡所需细菌悬液浓度 GN GP YST AST-GNxxAST-GPxxNH 0.5～0.63McF 0.5～0.63McF 1.8～2.2 McF 3.0ml盐水+145μl 3.0ml盐水+280μl 2.8～3.2McF 0.5～0.63McF菌悬液 0.5～0.63McF菌悬液