三种人用狂犬病纯化疫苗(Vero细胞)纯化方法的比较研究
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华 预 防 医 学 杂 志 ２ ０ ０ ７年 ３月 第 ４ 卷 第 ２期 １
Ｃ ｉ ＪＰｅ ｅ ， ｒｈ２ ０ ，Ｖ ｌ １ ｏ２ ｈｎ ｒｙＭ ｄ Ｍａｃ ０ ７ ｏ ４ ．Ｎ ．
．
短 篇 论 著 ．
三 种 人 用 狂 犬 病 纯 化 疫 苗 （ ｅ ｏ细 胞 ） 化 方 法 的 比 较 研 究 Ｖｒ 纯
三 、方 法
４・ ５ ４ ．０ ３ ・５ ３ ．０ ２．５ ２．０
蛋 白峰 ）
瞽
ｌ ５ ・ １０ ． ０・ ５ ０ ７０ ６ ５０ ４ ３０ ２０ １０ ０ ０ ０
１ ．疫苗制备 ： Ｃ Ｎ １ 狂犬病 固定 毒株 接种 于 Ｖ ｒ 用 Ｔ 一株 ｅｏ
速 ） 胶 过 滤 柱 层 析 法 和 二 乙胺 乙 基 （ ｉｈ ｌ ｉｏｔ ｌ 凝 ｄｅ ｙ ｍ ｎｅ ｙ， ｔ ａ ｈ Ｄ Ａ ）Ｓｐ ａｏｅ Ｅ Ｅ 一ｅ ｈｒｓ 离子交换柱 层 析法 ３种 方法 纯化 Ｖ ｒ ｅｏ细 胞生产的人用狂犬病疫苗 ， 为人用狂犬 病纯 化疫 苗（ ｅ Ｖｒ ｏ细 胞） 的工业化生产提供 了科学依据 。
部“ 人用狂犬病纯化疫苗 （ ｅｏ细胞 ） 中的检测方法进 行检 Ｖｒ ” 测； 小牛血清残 留量测定按 中国药 品生物制 品检定所提 供的
工业化 和规模 化生 产 ， 因此世 界卫 生组织 （ Ｏ） ＷＨ 推荐使 用
Ｖ ｒ 细胞生产人用 狂犬 病疫 苗。 ｅｏ
笔者分析 比较 了密 度梯度 离心 法 ，ｅ ｈｒｓ ４ Ｆ 快 流 Ｓｐ ａｏｅ Ｆ （
鲁 宏 吴敬 民 李惠君 梁晓 云 张红权 刘 宾
２ ｍ ｌＬ， ０ｍ ｏ ／ 流率为 ２ ｌｍ ｎ 检测波长为紫外区 ２ ０ａ ５ｍ／ ｉ ， ８ ｍ。 ３ ．密度梯度离心法 ： 取批号 ９ ００ 的上清液 １０ ｍ 经 ７ ４ ４ ５ ｌ １％ 一 ０ ０ ９ ％蔗糖界 面 ３ ０ ／ ｉ ０００ｒｍｎ梯度 离心 ６ｈ ， 后 检测并 收集 紫外区 ２ ０ｎ ８ ｍ波长处 的病毒蛋 白。 ４ ．离子交换柱层 析法 ： 取批 号 ９ ００ ７ ４ ５的上 清液 １０ ｍ ５ ｌ 过 Ｄ Ａ —ｅ ｈｒｓ 凝胶柱 ， 冲液为 Ｐ Ｓ２ ｍ ｌＬ Ｅ Ｅ Ｓｐ ａｏｅ 缓 Ｂ ０ ｍ ｏ ，流率 ／ 为 ２ ｌｍｎ 检测波长 为紫外 区 ２ ０ｎ ５ｍ／ ｉ， ８ ｍ。
试剂 盒检 测 ； 细胞 残余 Ｄ Ａ含 量测定 采 用 Ｄ Ａ 检测 试剂 Ｎ Ｎ
盒， 方法参照文献 ［ ］ １。
结
果
１密度梯度离心法 纯化样 品 ９ ０ ０ ， 紫外 ２ ０ｎ ． ７ ４ 在 ４ ８ ｍ波 长处 ， 收集 ６ 共 ７个组 份约 ２ ０ｒ 纯化液（ １ 。经 检测 ， ０ ｌ ｎ 图 ） 疫 苗效价大于 ２ ５Ｉ ／ ｌ小牛血清残 留量小于 ５ ｓｍ ， ． Ｕ ｍ ， ０ｎ／ ｌ杂蛋 白去除率大于 ９ ％ （ １ 。 ８ 表 ）
细胞 １６代的工作 种 子批 ， 养后 ， 获病 毒 液 （ ３ 培 收 即疫 苗 原
液） 。疫 苗原 液经 ０ ４ ｍ滤膜过滤 澄清后 ， ．５ 用截 留相对 分
子质量 ３ ０万道尔顿 的超滤膜进 行超滤浓 缩 ， 缩后 加入 １ 浓 ／
纯化液样 品号
图 ｌ 密度梯度 离心法病毒蛋 白检测
４０ ００的 Ｂ丙 内酯灭 活待 用（ 一 即浓缩液 ） 。浓缩液加人工作浓 度为 １２ ０的硫 酸鱼精蛋 白， 其混合振 荡 １ ｎ后 ，００ ／０ 将 ０ｍｉ ４ ０ ｒｍ ｎ离心 １ ｉ， 去 沉 淀 ， 上 清 待用 。上 清 液 （ 成 ／ｉ ０ ｍｎ 弃 取 分 ５等份 ， 号为 ９０ ０ 批 ７ ４ １—９０ ０ ） 别采用 凝胶 过 滤柱层 析 ７ ５分 ４
材料 与方 法
一
、
仪器与试剂
Ｈｉｃ ｉ Ｃ ５ Ｈ型超速离 心机 （日本 日立公司 ） 超 滤膜 ｔ ｈ Ｐ ５ ａ Ｓ ； （ 国 Ｍｉｉｏｅ公司 ） Ｉｄｘ５ １０ 美 ｌｐｒ ｌ ； ｅ３ ／ ０ ０凝 胶柱 ；Ｓｐ ａ ｓ ４ Ｆ ｎ ｅｈｒ ｅ Ｆ ｏ 凝胶 （ 典 Ｐ ａｍ ｃ 瑞 ｈｒ ａｉ 司 ） Ｄ Ａ —ｅ ｈｒｓ 胶 ； Ｎ ａ公 ； Ｅ Ｅ Ｓｐ ａｏｅ凝 Ｄ Ａ检 测试剂盒 （ 国 Ｂ ｅｒ ｇｒＭａｈｉ 德 ｏｈｉ ｅ ｎ ｅｍ公 司） 硫 酸鱼 精 蛋 白 ｎ ； （ ｒｔ ｉｅＳ ｌ ｔ， Ｐｏ ｍ ｎ ｕ ａ 美国 Ｓｇ ａ ｆｅ ｉ ｍａ公司） 磷 酸盐缓 冲液 （ Ｂ ） ； ＰＳ。 二、 细胞与毒种 Ｖｒ ｅ ｏ细胞 （ 购于美国 Ａ Ｃ Ｔ Ｃ公司 ） Ｃ Ｎ １株狂犬病 固定 ；Ｔ 一 毒株（ 购于 中国药品生物制品检定所 ） 。
法、 密度梯度离心法或 离子交换 柱层析 法进行 纯化后 ， 即为
纯化液 。
表 １ 不 同样 品密度梯度离心法检测结果
２ ．凝 胶过 滤柱 层析 法 ： 取批 号 ９ ０ ０ 、７４ ２ ９ ００ ７ １ ９０ ０ 、７ ３ ４ ４ 的上清液各 １０ ｍ 过 Ｓｐ ａｏｅ４ Ｆ凝胶 柱 ， 冲液为 Ｐ Ｓ ５ ｌ ｅｈ ｒｓ Ｆ 缓 Ｂ
病纯化疫苗（ ｝肾细胞 ） 地 ！ ’ ｌ 两种 。虽 然原代地 鼠 肾细 胞纯化
疫苗 比较 适合我 国 国情及 发展 水平 ， 因为 Ｖ ｒ 细 胞来源 但 ｅｏ 方便 、 繁殖速度快 、 外源因子和疫 苗质量可控性强 ， 易实现 更
５ ．疫苗效价和蛋 白含量依照《 中国药典＞ ０５年版第 ３ ＞０ ２
狂犬病是 由狂 犬病 毒引起的人兽共患疾病 ， 和所有温 人
血 动物对 狂犬病 毒都易感。该病在全世界广泛分布 ， 我国是
高发 区之一 。由于狂犬病一旦发病 目前尚无 法医治 ， 以对 所
狂犬病及其预 防制 品的研究 非常有 必要 。 目前 国内预 防狂
犬病 的疫苗有人用狂犬病纯 化疫苗 （ ｅ Ｖｒ ｏ细胞 ） 和人用狂犬
Ｃ ｉ ＪＰｅ ｅ ， ｒｈ２ ０ ，Ｖ ｌ １ ｏ２ ｈｎ ｒｙＭ ｄ Ｍａｃ ０ ７ ｏ ４ ．Ｎ ．
．
短 篇 论 著 ．
三 种 人 用 狂 犬 病 纯 化 疫 苗 （ ｅ ｏ细 胞 ） 化 方 法 的 比 较 研 究 Ｖｒ 纯
三 、方 法
４・ ５ ４ ．０ ３ ・５ ３ ．０ ２．５ ２．０
蛋 白峰 ）
瞽
ｌ ５ ・ １０ ． ０・ ５ ０ ７０ ６ ５０ ４ ３０ ２０ １０ ０ ０ ０
１ ．疫苗制备 ： Ｃ Ｎ １ 狂犬病 固定 毒株 接种 于 Ｖ ｒ 用 Ｔ 一株 ｅｏ
速 ） 胶 过 滤 柱 层 析 法 和 二 乙胺 乙 基 （ ｉｈ ｌ ｉｏｔ ｌ 凝 ｄｅ ｙ ｍ ｎｅ ｙ， ｔ ａ ｈ Ｄ Ａ ）Ｓｐ ａｏｅ Ｅ Ｅ 一ｅ ｈｒｓ 离子交换柱 层 析法 ３种 方法 纯化 Ｖ ｒ ｅｏ细 胞生产的人用狂犬病疫苗 ， 为人用狂犬 病纯 化疫 苗（ ｅ Ｖｒ ｏ细 胞） 的工业化生产提供 了科学依据 。
部“ 人用狂犬病纯化疫苗 （ ｅｏ细胞 ） 中的检测方法进 行检 Ｖｒ ” 测； 小牛血清残 留量测定按 中国药 品生物制 品检定所提 供的
工业化 和规模 化生 产 ， 因此世 界卫 生组织 （ Ｏ） ＷＨ 推荐使 用
Ｖ ｒ 细胞生产人用 狂犬 病疫 苗。 ｅｏ
笔者分析 比较 了密 度梯度 离心 法 ，ｅ ｈｒｓ ４ Ｆ 快 流 Ｓｐ ａｏｅ Ｆ （
鲁 宏 吴敬 民 李惠君 梁晓 云 张红权 刘 宾
２ ｍ ｌＬ， ０ｍ ｏ ／ 流率为 ２ ｌｍ ｎ 检测波长为紫外区 ２ ０ａ ５ｍ／ ｉ ， ８ ｍ。 ３ ．密度梯度离心法 ： 取批号 ９ ００ 的上清液 １０ ｍ 经 ７ ４ ４ ５ ｌ １％ 一 ０ ０ ９ ％蔗糖界 面 ３ ０ ／ ｉ ０００ｒｍｎ梯度 离心 ６ｈ ， 后 检测并 收集 紫外区 ２ ０ｎ ８ ｍ波长处 的病毒蛋 白。 ４ ．离子交换柱层 析法 ： 取批 号 ９ ００ ７ ４ ５的上 清液 １０ ｍ ５ ｌ 过 Ｄ Ａ —ｅ ｈｒｓ 凝胶柱 ， 冲液为 Ｐ Ｓ２ ｍ ｌＬ Ｅ Ｅ Ｓｐ ａｏｅ 缓 Ｂ ０ ｍ ｏ ，流率 ／ 为 ２ ｌｍｎ 检测波长 为紫外 区 ２ ０ｎ ５ｍ／ ｉ， ８ ｍ。
试剂 盒检 测 ； 细胞 残余 Ｄ Ａ含 量测定 采 用 Ｄ Ａ 检测 试剂 Ｎ Ｎ
盒， 方法参照文献 ［ ］ １。
结
果
１密度梯度离心法 纯化样 品 ９ ０ ０ ， 紫外 ２ ０ｎ ． ７ ４ 在 ４ ８ ｍ波 长处 ， 收集 ６ 共 ７个组 份约 ２ ０ｒ 纯化液（ １ 。经 检测 ， ０ ｌ ｎ 图 ） 疫 苗效价大于 ２ ５Ｉ ／ ｌ小牛血清残 留量小于 ５ ｓｍ ， ． Ｕ ｍ ， ０ｎ／ ｌ杂蛋 白去除率大于 ９ ％ （ １ 。 ８ 表 ）
细胞 １６代的工作 种 子批 ， 养后 ， 获病 毒 液 （ ３ 培 收 即疫 苗 原
液） 。疫 苗原 液经 ０ ４ ｍ滤膜过滤 澄清后 ， ．５ 用截 留相对 分
子质量 ３ ０万道尔顿 的超滤膜进 行超滤浓 缩 ， 缩后 加入 １ 浓 ／
纯化液样 品号
图 ｌ 密度梯度 离心法病毒蛋 白检测
４０ ００的 Ｂ丙 内酯灭 活待 用（ 一 即浓缩液 ） 。浓缩液加人工作浓 度为 １２ ０的硫 酸鱼精蛋 白， 其混合振 荡 １ ｎ后 ，００ ／０ 将 ０ｍｉ ４ ０ ｒｍ ｎ离心 １ ｉ， 去 沉 淀 ， 上 清 待用 。上 清 液 （ 成 ／ｉ ０ ｍｎ 弃 取 分 ５等份 ， 号为 ９０ ０ 批 ７ ４ １—９０ ０ ） 别采用 凝胶 过 滤柱层 析 ７ ５分 ４
材料 与方 法
一
、
仪器与试剂
Ｈｉｃ ｉ Ｃ ５ Ｈ型超速离 心机 （日本 日立公司 ） 超 滤膜 ｔ ｈ Ｐ ５ ａ Ｓ ； （ 国 Ｍｉｉｏｅ公司 ） Ｉｄｘ５ １０ 美 ｌｐｒ ｌ ； ｅ３ ／ ０ ０凝 胶柱 ；Ｓｐ ａ ｓ ４ Ｆ ｎ ｅｈｒ ｅ Ｆ ｏ 凝胶 （ 典 Ｐ ａｍ ｃ 瑞 ｈｒ ａｉ 司 ） Ｄ Ａ —ｅ ｈｒｓ 胶 ； Ｎ ａ公 ； Ｅ Ｅ Ｓｐ ａｏｅ凝 Ｄ Ａ检 测试剂盒 （ 国 Ｂ ｅｒ ｇｒＭａｈｉ 德 ｏｈｉ ｅ ｎ ｅｍ公 司） 硫 酸鱼 精 蛋 白 ｎ ； （ ｒｔ ｉｅＳ ｌ ｔ， Ｐｏ ｍ ｎ ｕ ａ 美国 Ｓｇ ａ ｆｅ ｉ ｍａ公司） 磷 酸盐缓 冲液 （ Ｂ ） ； ＰＳ。 二、 细胞与毒种 Ｖｒ ｅ ｏ细胞 （ 购于美国 Ａ Ｃ Ｔ Ｃ公司 ） Ｃ Ｎ １株狂犬病 固定 ；Ｔ 一 毒株（ 购于 中国药品生物制品检定所 ） 。
法、 密度梯度离心法或 离子交换 柱层析 法进行 纯化后 ， 即为
纯化液 。
表 １ 不 同样 品密度梯度离心法检测结果
２ ．凝 胶过 滤柱 层析 法 ： 取批 号 ９ ０ ０ 、７４ ２ ９ ００ ７ １ ９０ ０ 、７ ３ ４ ４ 的上清液各 １０ ｍ 过 Ｓｐ ａｏｅ４ Ｆ凝胶 柱 ， 冲液为 Ｐ Ｓ ５ ｌ ｅｈ ｒｓ Ｆ 缓 Ｂ
病纯化疫苗（ ｝肾细胞 ） 地 ！ ’ ｌ 两种 。虽 然原代地 鼠 肾细 胞纯化
疫苗 比较 适合我 国 国情及 发展 水平 ， 因为 Ｖ ｒ 细 胞来源 但 ｅｏ 方便 、 繁殖速度快 、 外源因子和疫 苗质量可控性强 ， 易实现 更
５ ．疫苗效价和蛋 白含量依照《 中国药典＞ ０５年版第 ３ ＞０ ２
狂犬病是 由狂 犬病 毒引起的人兽共患疾病 ， 和所有温 人
血 动物对 狂犬病 毒都易感。该病在全世界广泛分布 ， 我国是
高发 区之一 。由于狂犬病一旦发病 目前尚无 法医治 ， 以对 所
狂犬病及其预 防制 品的研究 非常有 必要 。 目前 国内预 防狂
犬病 的疫苗有人用狂犬病纯 化疫苗 （ ｅ Ｖｒ ｏ细胞 ） 和人用狂犬
