科学仪器学 离心机

第六章 离心分离技术 离心技术(centrifugal technique)是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物、天然的生物大分子、无机物、有机物。在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。

6.1 基本原理 6.1.1 离心力(centrifugal force，Fc) 离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力(Fc)的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积，即： Fc＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位：m是质量，以克为单位。

6.1.2 相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力随之变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。 RCF = F离心力/F重力 = mω2X/mg = ω2X/g =（2πn/60）2·X/980=X·n2·1.118×10-5 式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度(980cm／sec2)；n为转子每分钟的转数(rpm)。 在上式的基础上，Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图，见图32。在用图32将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。 图32 离心力的转换列线图 例如，已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500×g即是RCF值。

6.1.3 沉降系数(sedimentation coefficient，s) 根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。 S = （1/ω2X）·（dx/dt） =（1/ω2dt）·（dx/X） 积分得：S = 2.303·（logX2-logX1）/ω2（t2-t1） 若ω用2πn/60表示，则 S = 2.1×102log（X2/X1）/n2（t2-t1） 式中X1为离心前粒子离旋转轴的距离；X2为离心后粒子离旋转轴的距离。S实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。

6.1.4 沉降速度(sedimentation velocity) 沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。 dx/dt = [2r2（ρp-ρm）/9η]·ω2X = [d2（ρp-ρm）/18η] ·ω2X 式中r为球形粒子半径，d为球形粒子直径；η为流体介质的粘度；ρp为粒子的密度；ρm为介质的密度。 从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加，将此式代入上项沉降系数公式中，则S的表示式也可表示为： S = （1/ω2X）·（dx/dt）= d2（ρp-ρm）/18η 从该式中可看出，（1）当ρp >ρm ，则S>O，粒子顺着离心方向沉降。（2）当ρp =ρm ，则S= 0，粒子到达某一位置后达到平衡。（3）当ρp S

6.1.5 沉降时间(sedimentation time，Ts) 在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来的问题，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子所需的时间。 根据沉降系数(S)式可得： S = （1/ω2X）·（dx/dt） dt =（1/ω2S）·（dx/X） 积分得： t2-t1 =（1/ω2S）·ln（X2/X1） 式中X2为离心转轴中心至离心管底内壁的距离；X1为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离，那么样品粒子完全沉降到底管内壁的时间(t2-t1)用Ts

表示则上式可改为：

TS = （1/Sω2）·ln（XMAX/XMIN） 式中Ts以小时为单位，S以Svedberg为单位。

6.1.6 K系数(k factor) K系数是用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。也就是溶液恢复成澄清程度的一个指数，所以也叫“cleaning factor”。原则上，K系数愈小的，愈容易，也愈快将粒子沉降。 K = 2.53×1011ln（Rmax/Rmin）/（rpm）2 其中Rmax为转子最大半径；Rmin为转子最小半径。由其公式可知，K系数与离心转速及粒子沉降的路径有关。所以K系数是一个变数。当转速改变，或者离心管的溶液量不同，即粒子沉降的路径改变时，K系数就改变了。通常，离心机的转子说明书中提供的K系数，都是根据最大路径及在最大转速下所计算出来的数值。如果已知粒子的沉降系数，再利用当时条件下的K系数，就可以估计离心分离的时间。例如要离心一个沉降系数为80S的Polysome，采用的转子的K系数是323，那么预计沉降到管底所需的离心时间是T = k／S = 4h，利用此公式预估的离心时间，对水平式转子最适合，对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时间来得快些。

6.2 离心机分类 离心机分为二大类，即制备性和分析性离心机。 6.2.1 制备性离心机

制备性离心机又可分为三类： 1、普通离心机 最大转速6000 rpm左右，最大相对离心力近6000×g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨损，转速是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要，否则会损坏离心机。

2、高速冷冻离心机 最大转速为20000～25000rpm（r/min），最大相对离心力为89000×g，最大容量可达3升，分离形式也是固液沉降分离，转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0～40C，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示，通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。

3、超速离心机 转速可达50000～80000 rpm，相对离心力最大可达510000×g，最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等，离心容量由几十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。

6.2.2 分析性超速离心 与制备性超速离心不同的是：分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程，见图34。 1．测定生物大分子的相对分子量 测定相对分子量主要有三种方法，沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中应用最广的是沉降速度，超速离心在高速中进行，这个速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动，在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面，该界面随时间的移动而移动，这就是粒子沉降速度的一个指标，然后用照相记录，即可求出粒子的沉降系数。 S = （1/ω2X）·（dx/dt） 分子或粒子的相对分子量则可从Svedberg方程式来确定： M = RTS/[D（1-υρ）] 式中M：该分子不含水的相对分子量；R：气体常数；T：绝对温度；S：分子的沉降系数；υ：分子的微分比容(当一克溶质加到一个大体积的溶液中所占有的体积)；ρ：溶剂的密度。 2．生物大分子的纯度估计 分析性超速离心已广泛地应用于研究DNA制剂、病毒和蛋白质的纯度。用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的最常用方法之一，出现单一清晰的界面一般认为是均质的，如有杂质则在主峰的一侧或二侧出现小峰。 3．分析生物大分子中的构象变化 分析性超速离心已成功地用于检测大分子构象的变化，例如DNA可能以单股或双股出现，其中每一股在本质上可能是线性的，也可能是环状的，如果遇到某种因素(温度或有机溶剂)DNA分子可能发生一些构象上的变化，这些变化也许可逆、也许不可逆，这些构象上的变化可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。

图33 分析型超速离心机

6. 3离心机转头 1、角式转头：角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的，其上有4～12个装离心管用的机制孔穴，即离心管腔，孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20～40度之间，角度越大沉降越结实，分离效果越好。这种转头的优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”，壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响分离效果。