2020版《中国药典》液相色谱法检验操作规程(USP)
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一、目的:
制订详尽的工作程序,规范检验操作,保证检验数据的准确性。
二、范围:
本操作规程适用于参考美国药典标准检验品种液相色谱法的测定。
三、职责:
1、检验员:严格按操作规程操作,认真、及时、准确地填写检验记录;
2、化验室负责人:监督检查检验员执行本操作规程。
四、内容:
1、简述:液相色谱一词,如本纲要中所用,是高压液相色谱和高效液相色谱的同义词。LC是一种基于固体固定相和液体流动相的分离技术。
2、固定相:根据所用的固定相的类型,通过分配、吸附或离子交换过程实现分离。最常用的固定相是改性二氧化硅或聚合物珠。通过添加长链烃类来修饰珠粒。完成分析所需的具体包装类型由各个专著中的“L”指定表示(另见下面的色谱柱部分)。珠子的大小通常也在专著中描述。包装类型和尺寸的变化包括在本章的系统适用部分中。
3、色谱柱:
3.1术语柱包括不锈钢、内衬不锈钢和聚合物柱,用固定相填充。柱子的长度和内径影响分离,因此典型的柱子尺寸包括在单独的专著中。在本章的系统适配部分中讨论了列尺寸的变化。简编专著不包括适当专栏的名称;这种省略避免了出现对供应商产品的认可和市场中的自然变化。请参阅色谱柱以获取更多信息。
3.2在LC程序中,除另有规定外,保护柱可按下列要求使用:(a)保护柱的长度必须是分析柱长度的NMT15%,(b)内径必须等于或小于分析柱的内径,(c)填料应与分析柱(例如,二氧化硅)相同,并含有相同的结合相(例如,C18)。在任何情况下,在正式程序中规定的所有系统适用性要求必须安装在保护柱上。USP-NF测试和测定中使用的填料(L)、相(G)和载体(S)的完整列表位于USP-NF和PF、试剂、指示剂和溶液-色谱柱中。该列表旨在为色谱学家在识别个别专著中指定的相关色谱柱时提供方便的参考。
4、流动相:流动相是溶剂或溶剂混合物,如在专著中所定义的。
5、装置:液相色谱仪由包含流动相的储液器、在高压下迫使流动相通过系统的泵、将样品引入流动相的注射器、色谱柱、检测器和数据收集装置组成。
6、梯度洗脱:在色谱过程中连续改变溶剂组成的技术称为梯度洗脱或溶剂编程。梯度洗脱曲线在单独的专著中作为梯度表提出,其中列出了流动相在规定时间的时间和比例组成。
7、程序:
7.1用流动载气平衡柱、注射器和检测器,直到接收到恒定信号。
7.2通过注射器隔片注射样本,或使用自动采样仪。
7.3开始温度程序。
7.4记录色谱图。
按规定作分析。
8、色谱图的定义和解释:
8.1色谱图:色谱图是检测器响应、流出物中分析物浓度或作为流出物浓度相对于流出物体积或时间的度量的其他量的图形表示。在平面色谱中,色谱可指具有分离区的纸或层。
8.2如Figure 1表示两种物质1和2的典型色谱分离。对于峰1,tR1和tR2是各自的保留时间;h是高度,h/2是半高度,Wh/2是半高度处的宽度。W1和W2是基线处的峰1和2的各自宽度。空气峰是气相色谱的特征,对应于LC中的溶剂前沿。这些空气峰的保留时间,或未保留的成分,被指定为TM。
Figure 1:两种物质的色谱分离
8.3闭合容积(D):也被称为闭合的体积,是洗脱液相遇点和柱顶之间的体积。
8.4保持时间(TM):保持时间是洗脱未保留组分所需的时间。(参见Figure 1,在基线中显示的空气或未滞留的溶剂峰,)。
滞留体积(VM):滞留体积是洗脱未保留组分所需的流动相的体积。它可以从保持时间和流速f计算,用mL/min:
VM=tM×F
在排阻色谱法中,使用符号VO。
理论板数(N):N是柱效率的量度。高斯提出它是由:
N=16(tR/W)2
其中,tR是物质的保留时间,W是其底部的峰宽,这是通过将峰的相对直边外推到基线而获得的。N值取决于被色谱的物质以及操作条件,例如流动相或载气的流速和温度、填料的质量、填料在柱内的均匀性,以及毛细管柱的厚度、固定相膜的厚度和柱的内径和长度。在使用电子积分器的情况下,通过方程可以方便地确定理论板的数目:
其中W h/2是半高度的峰值宽度。然而,在争议的情况下,只有基于峰值宽度在基线的方程将被使用。
峰:峰是从柱中洗脱单个组分时检测器响应的色谱记录部分。如果分离不完全,则可以将两个或更多个组分洗脱为一个未分解的峰。
8.5峰-谷比(P/V):当两个峰之间没有达到基线分离时,p/v可被用作相关物质测试的系统适应性标准。如Figure 2,表示两种物质的部分分离,其中H P是在小峰的外推基线之上的高度,H V是在分离次要和主要峰的曲线的最低点处的外推基线之上的高度:
p/v= H p/H v
Figure2:峰谷比的测定
相对延迟(R ret):相对延迟是分析物行进的距离与参考化合物同时行进的距离的比率(参见Figure 3),并用于平面色谱。
Figure3:典型的平面色谱法
8.6相对保留(r)1:在相同条件下获得的组分相对于另一组分的调整保留时间的比率,用作参考:
r=t R2t M/t R1t M
其中t R2是从感兴趣化合物的注射点测得的保留时间;t R1是从用作参考的化合物的注射点测得的保留时间;t M是在该程序中定义的非保留标记的保留时间,均在同一柱上的实验条件。
8.7相对保留时间(RRT):也称为未调节相对保留。在USP中通常是在未经调整的相对保留条件下进行的,除非另有说明。
RRT=t R2/t R1
符号r G也用于指定未调整的相对保留值。
相对标准偏差百分率:
8.8延迟因子(RF):延迟因子是斑点中心移动的距离与流动相同时移动的距离的比值,用于平面色谱。使用Figure 3中的符号:
R F=b/a
8.9保留因子(K)1:保留因子也称为容量因子(k)。定义为:
K=固定相物质量/流动相物质含量
K=固定相分离时间/流动相分离时间
组分的保留因子可以从色谱图中确定:
k=(t R-t M)/t M
8.10保留时间(Tr):在液相色谱中,保留时间tR被定义为样品注射到洗脱样品区出现最大峰值响应之间的时间。TR可以用作识别的参数。
色谱保留时间是它们所代表的化合物的特征,但不是唯一的。样品和参考物质的保留时间的重合可以用作构建身份简档的部分标准,但是其本身可能不足以建立身份。给定化合物的绝对保留时间可以从一个色谱图变化到下一个色谱图。
8.11保留体积(VR):保留体积是用于洗脱组分所需的流动相的体积。它可以从保留时间和流速在mL/min中计算:
V R=t R×F
8.12 R S分辨率:分辨率是混合物中两个组分的分离,计算为:
R S=2×(t R2-t R1)/(W1+W2)
其中,t R2和t R1是两个组分的保留时间,W2和W1是通过将峰的相对直边外推到基线而获得的峰基处的对应宽度。
在使用电子积分器的情况下,通过方程可以方便地确定分辨率:
R S=1.18×(t R2-t R1)/(W1,h/2+W2,h/2)
8.13分离因子(α):分离因子是对两个相邻峰计算的相对保留度(按照惯例,分离因子的值总是>1):
α=k2/k1
8.14对称因子(AS)2:峰的对称因子,也称尾部因子(Figure 4)是通过以下来计算的:
A S=W0.05/2f
其中,W0.05是在5%高度处的峰值的宽度,f是从峰值最大值到峰值前沿的距离,该距离是在峰值高度的点5%处从基线测量的。