免疫组化实验方法ppt课件

⑶制备电泳法 如PAGE制备电泳的分
离条带切割等。
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第二节 抗体
1.抗体的概念 抗体（antibody）是机体 通过体液免疫，由B淋巴细胞活化、增殖、 分化的浆细胞合成并分泌与刺激抗原发生 特异性结合反应的免疫球蛋白 （immunoglobulin，Ig）。
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抗体是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不 都具有抗体活性。两者在概念上并不完全 等同，抗体是生物学和功能上的命名，而 Ig是结构和化学本质上的概念。
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基本特点是“特异, 灵敏，准确， 形态、 机能、 代谢三位一体”，系分 子病理学研究的常用手段。
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学习的重点有四：
1.名词概念； 2.技术原理； 3.操作要领； 4.结果判断原则 （尤其是对照染色和假阳性 假阴性的判 别）。
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第一节 抗原
1. 抗原的概念 凡能在机体内引起体
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①结构抗原，为组成细胞结构的成分，如细胞骨架蛋白； ②分泌抗原，为细胞所产生和分泌的酶`激素`粘液蛋白等； ③沉淀抗原，如肾小球肾炎时，沉淀在肾小球基膜的免疫 球蛋白`补体和免疫复合物等； ④入侵抗原，主要指病原微生物。
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4.抗原分离纯化的一般原则
免疫组化方法检测的抗原中，蛋白 质占了大多数，故此处叙述的一般原则 以蛋白抗原为主要对象。
液免疫和/或细胞免疫反应的物质,称为 抗原。
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抗原主要具有两方面的特性，抗原 能引起机体产生抗体和/或致敏淋巴细胞， 称之为免疫原性； 抗原还与相应的抗体 及致敏淋巴细胞发生特异性结合或反应， 称为免疫反应性。

谢 请多
谢！ 指教！
异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现； （2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致
抗体与组织产生非特异性结合； （3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸
酶及生物素等产生非特异性显色；
免疫组化操作经验和体会
• 操作中应注意以下问题：
1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。 2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。 3.PBS洗涤要充分。 4.要设阴性和阳性对照。 5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。
• 5.复合型 在常规免疫组化标记中，同一
种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞 核和胞浆、微绒毛和胞浆，但很少发现 胞膜和胞核同时表达。值得注意的是组 织标本固定不及时造成抗原移位或乳腺 ER和PR修复不充分也可以发生胞核和胞 浆同时阳性。
三、阳性标记组织学特征
• 根据免疫组化阳性细胞的组织学特点，
五、非特异着色特征
• 以下情况可干扰免疫组化标记结果的观察和判断：
（1）抗体交叉反应： 是由于该抗原决定簇同时 存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在于星 形胶质细胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白则更为严 重，可表达于多种组织细胞。因此，应全面了解 和认识该抗体的功能和标记范围。故抗体交叉反 应只要应用得当仍有助于诊断。
• 近十年来，免疫组化技术发展很快，在现代医学
的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病， 尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机理的研 究提供了强有力的手段，但随着免疫组化标记物 的增多和利用，原为特异的标记物并非绝对特异， 而且出现交叉反应和异常表达的情况日益增多。 故对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应在 光镜观察组织形态的基础上，合理使用免疫组化 技术，审慎判断其标记的意义。

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免疫组织化学的应用
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(一)提高病理诊断的准确性
病理诊断当属坚信不疑的，但在实际工作 中要做到100%是不可能的。采用免疫组化 检查后，部分疑难病例最后获得正确诊断。 应用免疫组化方法，可以大大提高病理诊 断的准确率，有利于疾病的临床诊治。
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(二)在肿瘤病理学的研究和诊断中的应用
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免疫组化结果的判断原则
每批染色都要有特异性阳性对照和阴性对照为基础,才能对染色结果 做判断。 阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。 阴性结果不能视为抗原不表达,即阴性结果无判断意义;阳性结果
有强弱、多少之分,
当免疫组化结果与HE切片诊断有矛盾时,以HE切片诊断为准。 应用“反证法, 确保免疫组化在诊断病理中的准确性。 避免假阴性和假阳性的发生。
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免疫细胞化学的突出优点是：
1. 高度的特异性
抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细 胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体， 具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基 酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。
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2. 敏感性高
现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度 保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增
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5、在肿瘤分期上的意义
在判断肿瘤是原位还是有浸润发生以及有无血 管、淋巴管的侵袭是与肿瘤分期密切相关的。 采用免疫组化法检查可获得明确的结果。如采 用层粘连蛋白(laminin）和Ⅳ型胶原的单克隆 抗体可以清楚地显示基底膜的主要成分。一旦 证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌， 而是浸润性癌了，其预后意义是不同的。

1.6
1.2
0.8 显著性
差异
0.4
0.2
0
阳性样品
0.1
阴性样品
1.2 1.1
1.0
无显著 性差异
背景
背景+阳性样品 背景+阴性样品
扣背景后依然没有显著性差异
阳性样品
阴1性.6样品
背景
1.2
阳性样品-背景
阳1性.2样品-背景
0.8
0.4
0
阳性样品
1.2
0.1
1.1
0.1
1 01..21 0.1
0.1 0.1 0.1 1.0
应当把照片存为无损压缩格式TIFF
特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式 后会损失亮度细节，导致测量误差增大。
注意那些 马赛克
总结拍摄注意事项：
调整显微镜光源亮度（电压9伏），足够白， 足够亮。
调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值 最好能达到230以上。
确认相机未使用自动白平衡功能。但要使用手 动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。
3.用IPP分析免疫组化图片的过程
拍摄样品照片。 选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of
interesting）。 测量该区域的IOD。 选择并测量有效统计区域的面积 计算光密度平均值IOD/area（ mean density ） 计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间
处理照片时用的却是灰度
各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时， 计算机是对照片的灰度进行测量和计算的。为 了定量物质含量，最后还是需要转换为OD值 来表示。
所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个 OD值，光密度。不应该是灰度。