HPLC异硫氰酸苯酯柱前衍生化测定黄柏及其不同炮制品中17种氨基酸的含量
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高效液相色谱柱前衍生化法测定不同产地灵芝中氨基酸的含量朱龙平1苗慧1陈建文1(1.中山大学药学院,广东广州5100062.)摘要:有关灵芝中氨基酸含量测定的报道相对较少,且大多数都是用氨基酸分析仪来测定。
本方法用异硫氰酸苯酯为衍生化试剂,处理灵芝样品后用高效液相色谱法测定了不同产地灵芝中六种氨基酸的含量,方法简便可靠,适用于灵芝中氨基酸含量的测定。
关键词:灵芝,高效液相色谱法,柱前衍生化,氨基酸灵芝又称灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草,是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝(G.lucidum·karst)和紫芝(G.japonicrn L loyd)的总称。
灵芝作为拥有数千年药用历史的中国传统珍惜药材,具备很高的药用价值,现代药理学研究证实,灵芝对于增强人体免疫力,调节血糖,控制血压,辅助肿瘤放化疗,保肝护肝,促进睡眠等方面均具有显著疗效。
市面上灵芝类保健品种类繁多,目前国内的每年销售额约十几亿元人民币。
笔者对无限极(中国)公司提供的不同产生的灵芝样品中氨基酸含量进行分析,为更好的利用灵芝提供一些参考。
1实验部分1.1仪器:岛津LC-20A高效液相色谱仪,梅特勒AG285分析天平。
1.2试药灵芝,无限极(中国)有限公司提供,产地如下:经中山大学药学院生药学教研室杨得坡教授鉴定为多孔菌科灵芝属真菌紫芝(G.japonicrn L loyd)。
,氨基酸对照品门冬氨酸,谷氨酸,丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸。
色谱纯乙腈(百灵威),异硫氰酸苯酯(阿拉丁),三乙胺,正己烷等均为分析纯,高纯水实验室自制。
2.实验方法与结果2.1色谱条件色谱柱为venusil Mp柱(250mm×4.6mm,5u m),流动相A为0.1mol/L醋酸钠溶液-乙腈(93:7),流动相B为乙腈-水(8:2)流速为1ml/min梯度洗脱,柱温箱40℃,进样体积2uL,检测波长254nm。
洗脱梯度见表1表1流动相洗脱梯度t(min)A(%)B(%)0 100 013 93 723 77 2329 65 3535 60 4040 0 10045 0 10047 100 02.2对照品溶液分别精密称取缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等对照品约6.0mg,置5ml容量瓶中用纯水稀释并定容至刻度。
MV_RR_CNJ_0019 氨基酸分析方法通则1.氨基酸分析方法通则的说明编号JY/T 019—1996名称(中文) 氨基酸分析方法通则(英文) General rules for amino acid analysis归口单位国家教育委员会起草单位国家教育委员会主要起草人李 聪 刘子列批准日期 1997年1月22日实施日期 1997年4月1日替代规程号无适用范围本方法适用于异硫氰酸苯酯柱前衍生法定性、定量测定样品中水解氨基酸、游离氨基酸以及不常见的氨基酸。
主要技术要求 1.定义2. 方法原理3. 试剂和材料4. 仪器5. 样品6. 分析步骤7. 分析结果的表述是否分级无检定周期(年)附录数目无出版单位科学技术文献出版社检定用标准物质相关技术文件备注2.氨基酸分析方法通则的摘要本方法适用于异硫氰酸苯酯柱前衍生法定性、定量测定样品中水解氨基酸、游离氨基酸以及不常见的氨基酸。
2 定义2.1 氨基酸 Amino acid分子内含氨基(亚氨基)和羧基的有机物化合物的总称。
根据氨基(亚氨基)与羧基相对位置的不同,分为α-,β-,γ-,δ-,ω-氨基酸。
α-氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
常规的氨基酸分析主要指蛋白质水解氨基酸,游离氨基酸的分离测定。
2.2 柱前衍生 Pre-column derivatization为了提高氨基酸分析的检测灵敏度和分离选择特性,通常采用使氨基酸衍生化的方法。
柱前衍生法,即样品在用分析柱分离前进行衍生化反应,然后经色谱柱对衍生物进行分离。
2.3 梯度洗脱 Gradient elution间断地或连续地改变流动相组成或其它操作条件,从而改变色谱洗脱能力的过程。
2.4 基线Baseline在正常操作条件下,仅有流动相通过检测器系统时所产生的响应信号曲线。
基线反映仪器的噪音随时间的变化。
2.5 色谱峰 Chromatographic peak色谱柱流出组分通过检测系统时,所产生的响应信号对时间作图所得的曲线,曲线的突起部分称为色谱峰。
异硫氰酸苯酯(pitc)柱前衍生化hplc法
答:异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化HPLC法是一种常用的蛋白质分析方法。
该方法的原理是利用异硫氰酸苯酯(PITC)作为柱前衍生剂,将蛋白质中的氨基酸残基转化为对应的衍生物,然后通过高效液相色谱(HPLC)进行分离和检测。
具体步骤如下:
1. 将蛋白质溶液与PITC溶液混合,室温下反应一定时间。
2. 用有机溶剂(如乙醚)萃取出生成的衍生物。
3. 去除有机溶剂,将衍生物进行高效液相色谱分离。
4. 通过紫外检测器或荧光检测器检测各氨基酸衍生物的峰面积或峰高。
通过与标准品对比,可以确定蛋白质中各种氨基酸的组成和含量。
该方法具有灵敏度高、分离效果好、可同时测定多种氨基酸等优点,因此在生物化学、药物研发、临床诊断等领域得到了广泛应用。
异硫氰酸苯酯柱前衍生法测定复方氨基酸注射液(3AA)中氨基酸含量张莹;黄哲甦【摘要】目的:建立采用异硫氰酸苯酯柱前衍生化高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液(3AA)的含量.方法:色谱柱:Diamonsil C18 (2)(250mm×4.6 mm,5μm);流动相:A为0.1 mol/L醋酸钠溶液(pH 6.5)-乙腈(93:7);B为乙腈-水(80:20)梯度洗脱,流速:1.0 ml/min;柱温:40℃;检测波长:254 nm.结果:各个氨基酸的浓度与其相应色谱峰面积的线性相关系数均达到0.999以上;各个氨基酸的浓度与其相应色谱峰面积呈良好的线性关系,回收率在98.5%~99.6%.结论:该方法适用于测定复方氨基酸注射液(3AA)的含量,具有准确、快速和灵敏度高等优点.【期刊名称】《天津药学》【年(卷),期】2013(025)004【总页数】4页(P17-20)【关键词】异硫氰酸苯酯;柱前衍生;高效液相色谱法;复方氨基酸注射液【作者】张莹;黄哲甦【作者单位】天津市药品检验所,天津300070;天津市药品检验所,天津300070【正文语种】中文【中图分类】R927.2复方氨基酸注射液(3AA)为复方制剂,由缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸配制而成,可用于各种原因引起的肝性脑病、重症肝炎以及肝硬化、慢性活动性肝炎。
亦可用于肝胆外科手术前后。
该品种现收载于卫生部药品标准(二部)第六册(生化药品第一分册)中,国外药典未见收载。
原质量标准中含量测定仅规定用适宜的氨基酸分析仪或高效液相色谱仪测定氨基酸的含量,因目前国内使用氨基酸分析仪分析该品种的情况较少,多数情况下使用柱前衍生高效液相色谱法进行测定,且柱前衍生法可采用几种不同的方法,如:PITC、DNFB、AQC等方法,不同的方法需要制备合适的对照品溶液和供试品溶液的浓度,以及采用不同的衍生试剂等。
考虑到原标准检验方法的可操作性较差,对样品质量的仲裁带来一定的难度,因此本文采用异硫氰酸苯酯柱前衍生化高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液(3AA)的含量[1],该方法具有准确、快速和灵敏度高等优点。
柱前衍生化HPLC法测定藏药熏倒牛种子中15种氨基酸含量李运;张国强;高鹏;李红玉;景明;魏锋【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2022(31)4【摘要】目的:建立柱前衍生化HPLC法测定藏药熏倒牛种子中15种氨基酸的含量。
方法:供试品在一定量6 moL·L^(-1)盐酸中110℃水解6 h,与异硫氰酸苯酯进行衍生化反应。
采用CAPCELL PAK-C18(250 mm×46 mm,5μm)色谱柱,以80%乙腈溶液(A)-0056 moL·L^(-1)乙酸钠缓冲液(B)为流动相,梯度洗脱(0~15 min,5%A;15~20 min,5%A→20%A;20~35 min,20%A→36%A;35~45min,36%A→70%A;45~50 min,70%→90%A;50~55 min,90%A;55~56 min,90%A→5%A;56~60 min,5%A),流速为10 mL·min^(-1),检测波长254 nm,色谱柱温度40℃。
结果:15种氨基酸衍生物能够达到基线分离,在096~5856μg·mL^(-1)范围内线性关系良好,r≥09991,精密度、重复性、稳定性试验的RSD值分别小于273%、285%、289%,加样回收率介于952%~1044%之间,RSD值均小于246%。
经测定,3批熏倒牛种子中氨基酸总含量分别为164%、155%和108%。
结论:此法简便易行,可用于藏药熏倒牛种子中15种氨基酸的含量测定。
【总页数】5页(P48-52)【作者】李运;张国强;高鹏;李红玉;景明;魏锋【作者单位】兰州市食品药品检验检测研究院/甘肃省种植中药材外源性污染物监测工程研究中心;兰州大学药学院;甘肃中医药大学药学院;中国食品药品检定研究院【正文语种】中文【中图分类】R284【相关文献】1.柱前衍生RP-HPLC法测定狗尾草种子氨基酸含量2.DNFB柱前衍生化RP-HPLC测定大黄种子氨基酸的含量3.异硫氰酸苯酯柱前衍生化HPLC法测定水牛角浓缩粉6种氨基酸的含量及特征图谱分析4.DNFB柱前衍生化RP-HPLC法测定氨肽素的氨基酸含量因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
柱前衍生化-超高效液相色谱法快速测定酱油中的18种氨基酸陈丽梅;尚艳芬;赵孟彬;刘虎威【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2010(28)12【摘要】建立了一种6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)柱前衍生,超高效液相色谱(UPLC)对酱油中18种氨基酸进行快速分离检测的方法.采用BEH C18色谱柱分离,在260 nm波长下检测,以乙酸铵-乙酸-乙腈-水和乙腈-乙酸为流动相,将流动相梯度和流速梯度相结合,在12 min内实现了18种氨基酸衍生物的分离.方法的线性回归系数(r2)均大于0.999,检出限为0.032~0.12 mg/L,日间相对标准偏差(RSD)为0.72% ~4.05% ,在酱油中18种氨基酸的加标回收率为90.2% ~103.7% .该方法前处理过程简单,分离时间短,是检测酱油中氨基酸的有效手段,可用于酱油的质量评定.【总页数】4页(P1154-1157)【作者】陈丽梅;尚艳芬;赵孟彬;刘虎威【作者单位】北京大学化学与分子工程学院,北京,100871;北京锦绣大地农业股份有限公司,北京,100049;北京锦绣大地农业股份有限公司,北京,100049;北京锦绣大地农业股份有限公司,北京,100049;北京大学化学与分子工程学院,北京,100871【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.程序进样-柱前衍生-超高效液相色谱法测定鱼露酱油中的牛磺酸含量 [J], 孟冰冰;杨桂玲;徐惠;于林;马驰骋;陈莎莎;孙娜;杨劭辰2.柱前衍生-超高效液相色谱法同时测定虫草酒中17种游离氨基酸 [J], 刘国英;李亭亭;汤有宏;何宏魁;马雷;王银辉3.柱前衍生-超高效液相色谱法测定鱼卵中的17种氨基酸 [J], 孙言春;许宪祝;徐衍岭;谭志军;牟振波;杜宁宁4.柱前衍生-超高效液相色谱法测定油莎豆饼粕中17种氨基酸的含量 [J], 陆雨顺; 赵丽娟; 宫瑞泽; 陈建波; 李志满; 孙印石5.柱前衍生-超高效液相色谱法测定3种奶粉中18种氨基酸 [J], 曲栗;古淑青;张嘉麒;赵超敏;邓晓军因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
HPLC测定黄柏生品与不同炮制品中3种生物碱的含量
夏荃;李灿明
【期刊名称】《中成药》
【年(卷),期】2008(30)7
【摘要】目的:采用反相高效液相色谱法分别测定黄柏生品与不同炮制品中小檗碱、巴马汀、药根碱的含量,并对其进行比较.方法:采用C18ODS分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(50:50,每100 mL加0.1 g十二烷基硫酸钠);检测波长:265 nm;流速:1.5 mL/min;柱温:30℃.结果:与生品比较,盐炙黄柏的小檗碱、巴马汀含量稍降低;黄柏炭的小檗碱、巴马汀含量明显降低,药根碱含量变化
不明显.结论:所测成分色谱峰均能达到基线分离,方法稳定,为黄柏及其炮制品的生物碱含量测定建立了简便、准确的定量分析方法.炒炭对黄柏中所含生物碱成分有较
大影响.
【总页数】4页(P1018-1021)
【作者】夏荃;李灿明
【作者单位】广州中医药大学中药炮制教研室,广东,广州,510006;广州中医药大学
中药炮制教研室,广东,广州,510006
【正文语种】中文
【中图分类】R283
【相关文献】
1.不同产地黄柏药材中4种主要生物碱类成分的含量测定
2.HPLC法测定新疆准噶尔乌头不同炮制品中单酯型生物碱的含量
3.一测多评法测定不同产地黄柏炭中4种生物碱含量
4.HPLC法测定黄连、黄柏及其中成药中小檗碱型生物碱的含量
5.RP-HPLC测定不同采收期川黄柏中小檗碱、黄柏碱的含量
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中华中医药学刊DOI :10.13193/j.issn.1673-7717.2017.09.014HPLC 异硫氰酸苯酯柱前衍生化测定黄柏及其不同炮制品中17种氨基酸的含量张凡1,2,3,周远征1,2,3,赵远1,2,3,刘蓬蓬1,2,3,徐珊1,2,3,贾天柱1,2,3(1.辽宁中医药大学药学院,辽宁大连116600;2.国家中医药管理局中药炮制原理解析重点实验室,辽宁大连116600;3.辽宁省中药炮制工程技术研究中心,辽宁大连116600)摘要:目的:研究黄柏炮制前后17种氨基酸的含量变化情况进而评价黄柏炮制前后的寒热药性的变化。
方法:采用反相高效液相色潽法,以异硫氰酸苯酯(PITC )为衍生化试剂衍生后进行HPLC 分析。
采用C 18(250mm ˑ4.6mm ,5μm )色谱柱,柱温为43ħ;流动相A 为0.1mol ·L -1醋酸钠缓冲液(以醋酸调pH 6.5)-乙腈(93ʒ7),流动相B 为乙腈-水(4ʒ1),梯度洗脱,流速为1.0mL ·min -1;检测波长为254nm 。
结果:17种氨基酸浓度在线性范围内呈良好的线性关系(r =0.9968 0.9995);回收率在96.7% 104.26%之间,RSD 均小于3.0%。
结论:本方法灵敏、准确,具有良好的重复性和稳定性,可用于黄柏中氨基酸的检测。
关键词:黄柏;炮制;氨基酸;中药药性中图分类号:R284.1文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2017)09-2259-04Content Determination of 17Kinds of Amino Acids in Different ProcessedProducts of Phellodendron by HPLC with Pre -column PITC DerivationZHANG Fan 1,2,3,ZHOU Yuanzheng 1,2,3,ZHAO Yuan 1,2,3,LIU Pengpeng 1,2,3,XU Shan 1,2,3,JIA Tianzhu 1,2,3(1.College of Pharmacy ,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine ,Dalian 116600,Liaoning ,China ;2.Key Laboratory of Processing Theory Analysis of State Administration of Traditional Chinese Medicine ,Dalian 116600,Liaoning ,China ;3.Traditional Chinese Materia Medica Processing Engineering Center of Liaoning Province ,Dalian 116600,Liaoning ,China )Abstract :Objective :To study the changes of content of 17kinds of amino acids in Phellodendron with different pro-cessing products.Methods :Use RP -HPLC method with phenyl isothiocyanate (PITC )derived after derivatization rea-gent for HPLC analysis.Ecosil C 18(250mm ˑ4.6mm ,5μm )column was used.The column temperature was 43ħ.The mobile phase A was 0.1mol ·L -1sodium acetate buffer (adjusted with acetic acid pH 6.5)-acetonitrile (93ʒ7)and the mobile phase B was acetonitrile -water (4ʒ1)by gradient elution.The flow rate was 1.0mL ·min -1and the detection wavelength was 254nm.Results :17kinds of amino acid concentration in the linear range showed a good linear relationship (r =0.9968 0.9995).The average recovery was between 96.7% 104.26%and RSDs were less than 3.0%.Conclusion :The method is sensitive and accurate ,with good reproducibility and stability ,and can be used to de-tect the amino acids in Phellodendron.Key words :Phellodendron ;processing ;amino acids ;nature of Chinese medicinal material 收稿日期:2017-04-25基金项目:国家自然科学基金项目(81274083);国家公益性科研专项项目(201507002)作者简介:张凡(1985-),男(回族),辽宁沈阳人,讲师,博士研究生,研究方向:中药炮制。
通讯作者:贾天柱(1951-),男,辽宁朝阳人,教授,研究方向:中药炮制。
E-mail :jiatzh@126.com 。
黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.的干燥树皮,习称“川黄柏”。
黄柏性苦、寒,归肾、膀胱经。
具有清热燥湿、泻热除蒸、解毒疗疮的功效[1]。
黄柏有三种常用炮制品,分别为盐黄柏,酒黄柏和黄柏炭。
黄柏经盐炙后,可引药下行入肾,缓和枯燥之性,不伤脾胃,增加了滋肾阴、泻肾水、退虚热的作用,可用于阴虚发热,梦遗滑精,骨蒸劳热,盗汗,咳嗽咳血;而酒炙可缓和苦寒之性,免伤脾阳,并借酒升腾之力,引药上行,且能入血分,清血分湿热,用于热壅上焦诸症及热在血分。
故在黄柏炮制的传统理论中可以发现,黄柏经盐炙可增强其自身的苦寒之性,可谓之寒者益寒,而经酒炙可缓和其寒性,可谓之“以热制寒”。
但黄柏炮制前后的寒热属性变化能否通过相关的理化指标来反应,而其中的寒热药性差异究竟有多大并没有相关报道。
当前有学者研究发现中药药性与中药中蛋白质、脂肪、氨基酸等初生物质成分具有一定的相关性[2]。
本实验在此基础上,首次采用异硫氰酸苯酯柱前衍生化法测定黄柏生品及炮制品中17种氨基酸的含量[3],为从黄柏经炮制后初生物质含量变化的角度解析黄柏酒炙与盐炙后寒热温凉的药性变化提供依据。
1仪器与试药1.1仪器Agilent -1100液相色谱仪(美国安捷伦公司,agilent -1100系列,VWD 检测器,Agilent chemstation 色谱工作站),WS -70B 电热干燥恒温箱,FA1004B 十万分之一天平(上海精密科学仪器有限公司)。
中华中医药学刊1.2试药PITC(批号F1214047),购自aladdin公司,纯度99%,可用于HPLC标记;17种氨基酸混合对照品(批号SLBF8136V)购自sigma公司,乙腈色谱纯,醋酸钠、三乙胺、苯酚、浓盐酸等为分析纯。
1.3药材黄柏药材购自四川省药材公司,由实验室自行根据中国药典鉴定为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.的干燥树皮。
生黄柏的制备:取原药材,洗净,润透,切4mm丝,干燥。
酒黄柏的制备:取净黄柏丝,放入适宜的容器中,加黄酒、蒸馏水拌匀,闷润2h,药透汤尽后取出。
在150 160ħ温度条件下,置锅内炒制6min,取出,放凉,即得。
每100g黄柏加20%黄酒,30%蒸馏水[4]。
盐黄柏的制备:取净黄柏丝,放入适宜的容器中,加盐水拌匀,闷润2h,药透汤尽后取出。
在150 160ħ温度条件下,置锅内炒制6min,取出,放凉,即得。
每100g黄柏加2%盐,30%蒸馏水[5]。
2方法与结果2.1色谱条件采用Ecosil C18色谱柱(250mmˑ4.6mm,5μm),柱温为43ħ。
流动相A为0.1mol·L-1醋酸钠缓冲液(以醋酸调pH6.5)-乙腈(93ʒ7),即称取醋酸钠30g,加水3.4L溶解,醋酸调pH至6.5,再加水至3.7L,并加入乙腈0.28L,用0.45μm滤膜过滤,即得;流动相B为乙腈-水(4ʒ1)。
进行梯度洗脱,洗脱程序见表1,流速1mL·min-1。
检测波长254nm;进样量5μL[6-9]。
2.2溶液的配制和衍生2.2.1混合对照品溶液的配制和衍生取17种混合对照品溶液200μL,其中含丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)(胱氨酸浓度为1.25μmol/mL,其他16种氨基酸浓度均为2.5μmol/mL)。
取混合对照品溶液200μL,置离心管中,加入三乙胺-乙腈溶液250μL,PITC-乙腈溶液250μL,混匀,室温放置1h后加入正己烷1mL,振摇2min后放置10min,取下层溶液,最终用0.1N HCl溶液转移定容至5mL容量瓶备用,后经0.45μm滤膜过滤,进行色谱分析。
标准品进样5μL。
2.2.2供试品溶液的配制和衍生取黄柏各炮制品粉末各0.4g,置5mL安瓿中,加入水1mL和浓盐酸1mL,熔封安瓿,于100ħ水解12h,放冷,移入蒸发皿中,蒸干,残渣加入0.1mol/L HCl溶解并转移至25mL容量瓶,并定容到刻度。
后加入PITC-乙腈溶液及三乙胺-乙腈溶液各2.5mL,室温放置1h后,50%乙腈溶液定容,加入正己烷25mL,静置20min取下层,过0.45μm滤膜过滤,进行色谱分析[10-11]。
表1梯度洗脱程序时间t(min)流动相A-B比例0.00100ʒ015.0097ʒ320.0097ʒ325.0080ʒ2045.0078ʒ2245.0170ʒ3050.000ʒ10055.00100ʒ060.00100ʒ02.2.3空白溶液的配置和衍生取0.1mol/L盐酸溶液5mL,按“2.2.1”项下方法,置于25mL量瓶中,加入0.1mol/L PITC-乙腈溶液2.5mL”起操作,既得。