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引言可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖等单糖和双糖，是植物品质的重要构成性状之一，尤其是以果实为目的产品的植物，可溶性糖与酸的含量及其配比是影响果实风味品质的重要因素。
对于鲜食品种，一般来讲，高糖中酸，风味浓，品质优；低糖中酸，风味淡，品质差。
因此，可溶性糖的定量研究对植物的品质育种、储藏、加工特性等具有重要意义。
而且可溶性糖广泛存在于植物的根、茎块和种子中，是人体热量的最最主要来源，具有较高的营养价值。
本文重点介绍蒽酮比色法、铜还原碘量法、费林试剂法、原子吸收法、气相色谱法、液相色谱-蒸发光散射法，及连续流动法这几种实验如何定量测定可溶性糖含量。
1 蒽酮比色法1.1 原理糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。
在625 nm波长下的OD值与糖含量成正比。
由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。
1.2 仪器与材料1.2.1实验仪器分光光度计，电炉，铝锅，电子天平，20ml刻度试管，刻度吸管5ml 1支、1ml 2支，漏斗。
1.2.2实验试剂（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。
（2）浓硫酸（比重1.84）。
1.2.3实验材料植物叶片。
1.3 实验方法1.3.1标准曲线的制作取20ml刻度试管11支，从0～10分别编号，按表24-1加入溶液和水。
然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入5ml浓硫酸，摇匀。
比色液总体积为8ml，在恒温下放置30min，显色。
然后以空白为参比，在485nm 波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
按表1加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
实验二十一可溶性总糖的测定（蒽酮比色法）一、目的掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。
二、原理强酸可使糖类脱水生成糠醛，生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在 620 nm 处有最大吸收 . 在 10 -100ug 范围内其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
这一方法有很高的灵敏度，糖含量在 30ug 左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。
一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。
三、仪器、试剂和材料1 .仪器（ 1) 分光光度计(2 ）电子顶载天平(3 ）三角瓶： 50m1 X 1（ 4 ）大试管： 9 支（ 5) 试管架，试管夹（ 6 ）漏斗，漏斗架（ 7 ）容量瓶： 50rnl X 2（ 8 ）刻度吸管： 1m1X3 ， 2m1X1 ， 5mlX1（ 9 ）水浴锅2 .试剂（ 1) 葡萄糖标准液： l00ug/ml(2 ）浓硫酸(3) 蒽酮试剂 :0.2g 蒽酮溶于 100 ml 浓 H2SO4 中当日配制使用。
3 .材料小麦分蘖节。
四、操作步骤1 .葡萄糖标准曲线的制作取 7 支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：管号 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖标准液（ ml ） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8蒸馏水（ ml ） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2葡萄糖含量（ ug ）0 10 20 30 40 60 80在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4.0m1 ，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。
自水浴重新煮沸起，准确煮沸 l0min 取出，用流水冷却，室温放置 10min ，在 620 nm 波长下比色。
以标准葡萄糖含量（ ug) 作横坐标，以吸光值作纵坐标，作出标准曲线。
2 .植物样品中可溶性糖的提取将小麦分蘖节剪碎至 2mm 以下，准确称取 Ig, 放入 50m1 三角瓶中，加沸水 25m1 ，在水浴中加盖煮沸10min ，冷却后过滤，滤液收集在 50m1 容量瓶中，定容至刻度。
蒽酮——硫酸比色法测定枇杷叶中可溶性多糖的含量摘要：目的：建立枇杷叶中可溶性多糖的含量测定方法。
方法：采用蒽酮—硫酸比色法。
结果：显示624nm处有最大吸收峰，线性关系较好(r=0.9999)，平均回收率为99.58%(n=5，RSD=2.85%)，枇杷叶可溶性多糖的含量为8%以上。
结论：该方法快速准确、重现性好，可为枇杷叶中水溶液多糖的检测提供参考方法。
关键词：枇杷叶多糖；蒽酮—硫酸比色法；含量测定枇杷叶为蔷薇科(Rosaceae)植物枇杷(Eriobotrya japonica Thunb Lindl)的干燥叶，在我国已有2200多年的栽培历史。
目前已报道枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸的含量测定方法，但是采用蒽酮比色法测定枇杷叶中水溶性多糖含量方法的研究报道较少[1]。
本试验探讨了枇杷叶中水溶性多糖的含量测定方法，旨在为今后产业化利用枇杷资源的含量检测提供参考。
1 材料试验用枇杷叶采自成都中医药大学峨嵋学院植物种植园，由王书林教授鉴定为蔷薇科(Rosaceae)植物枇杷(Eriobotrya japonica Thunb Lindl)的干燥叶。
1.1 试药无水葡萄糖(AR)、枇杷叶、蒽酮(AR)、硫酸(AR)、无水乙醇。
1.2 主要仪器设备UV2450紫外-可见分光光度计、R-201旋转蒸发仪、101-2A电热恒温鼓风干燥箱、W201C数控恒温水浴锅、SHB-Ⅲ循环水真空泵、2G 10-2.4A离心机。
2 方法2.1 样品溶液的制备将枇杷叶洗涤后于60℃干燥，粉碎备用。
精密称取约10g，加水150mL，在80℃回流提取3h[1]，趁热过滤，重复提取一次，合并上述滤液，离心，上清液减压浓缩至约25mL，精密吸取浓缩液10mL，加乙醇调含醇量至含乙醇量为85%，密闭置4℃冰箱中静置过夜。
回收乙醇，沉淀用水适量超声溶解，摇匀定容至50mL，精密吸取上述定容液0.5mL用水定容至100mL作为待测液。
2.2 标准液的配制精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖100.00mg，加蒸馏水100mL，配置成浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液备用。
植物组织中可溶性糖含量的测定在作物的碳素营养中，作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。
它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为 NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。
由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。
Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。
在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。
但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。
此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。
糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。
二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物鲜样或干样。
（二）试剂1. 80 ％乙醇。
2. 葡萄糖标准溶液（100 μg/mL ）：准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至 100 mL ，使用时再稀释 10 倍（100 μg/mL ）。
实验1 可溶性糖的测定一、实验目的1．学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。
2．学习721型分光光度计的原理和操作方法。
二、实验原理总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。
蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。
其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糖醛衍生物后与蒽酮（C14H10O）缩合成蓝色化合物。
溶液含糖量在150μg /ml以内，与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。
蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接作用，样品不必经过水解。
三、实验器材1．试管（或具塞试管）2. 吸量管及试管架（1 ml、10 ml）3．沸水浴 4. 冰浴5．721型分光光度计6．蒽酮试剂称取100 mg蒽酮溶于100 ml 98%硫酸溶液（A.R）中，用时配制。
7．葡萄糖标准溶液（100 μg/ml）200 ml精确称取100 mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定容至1000 ml。
8．样品溶液200 ml 可自选待测物制成样品溶液。
举例：称取500 g市售白薯（或淀粉），洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆，4层纱布压滤、弃滤液溜渣，将渣放于烘箱内80～85℃烘干后，再用植物粉碎机（微型）研细，过筛，取100目筛下物为待测样品。
取样品在烘箱内105℃烘干，恒重后，精确称取1～5 g，置于锥形瓶中，加入80 ml沸蒸馏水，放入沸水浴。
不时摇动，提取0.5 h。
取出立即过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤，合并滤液。
冷却至室温，用蒸馏水定容至100 ml。
9．白薯。
四、实验步骤：每管加入葡萄糖标准液和水后立即混匀，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂后，同时置于沸水浴中，准确加热7 min，立即取出置冰浴中迅速冷却。
待各管溶液达室温后，用1 cm厚度的比色皿，以第一管为空白，迅速测其余各管的光吸收值。
然后以第2～7管溶液含糖量μg为横坐标，吸光度（OD620）为纵坐标，画出含糖量与OD620值的相关标准曲1要在冰浴条件下加入蒽酮，以防止发热，影响颜色反应。
植物组织中总糖和还原糖含量的测定（蒽酮比色法）2010-5-24一、实验目的掌握蒽酮比色法测定总糖和还原糖含量的原理和方法，学会正确使用分光光度计。
二、实验原理游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在浓硫酸的作用下脱水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物与蒽酮缩合成蓝色的化合物，在620nm处有最大吸收，在一定糖浓度范围内（200ug/ml），溶液吸光度值与糖溶液的浓度成线性关系。
用酸将植物组织中没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，或直接提取植物组织中的还原糖，即可对植物组织中的总糖和还原糖进行定量测定。
三、实验材料1．可见分光光度计、电子天平(1/100)、粉碎机、水浴锅、电炉。
2．研钵、量筒、三角烧瓶、烧杯、容量瓶、玻璃漏斗、试管1.5cm×15cm、刻度吸管、胶头滴管、pH试纸、坐标纸。
3．植物原料，如银耳、木耳、菜叶等。
四、实验试剂1．蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于l000ml体积分数为80％的硫酸中，当日配制使用。
2．标准葡萄糖溶液(0.1mg／m1)：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1 000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。
3．6mol／L HCl溶液：50ml盐酸，加水至100ml。
4．10％NaOH溶液：称取10g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100ml。
五、操作步骤1．葡萄糖标准曲线的绘制取干净试管6支，按下表进行操作。
以吸光度为纵坐标，各标准液浓度(mg／m1)为横坐标做图。
2．样品中还原糖的提取和测定称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。
于50℃水浴中保温半小时（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100ml。
过滤，取lml滤液进行还原糖的测定：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。
植物组织中可溶性糖与淀粉的测定一、蒽酮法测定可溶性糖【仪器与器具】分光光度计；电炉；铝锅； 20ml 刻度试管；刻度吸管 5ml 1 支，1ml 2 支；记号笔；吸水纸适当。
【试剂】1．蒽酮乙酸乙酯试剂：取剖析纯蒽酮 1g，溶于 50ml 乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保留数礼拜，若有结晶析出，可微热溶解。
2．浓硫酸（比重）。
【方法】1．标准曲线的制作取 20ml 刻度试管 11 支，从 0～10 分别编号，按表 24-1 加入溶液和水。
表 1各试管加溶液和水的量管号01～23～45～67～89～10100μg/ml 蔗糖液(ml)水(ml)蔗糖量 ( μg)020*********而后按次序向试管内加入 1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面迅速加入 5ml 浓硫酸，摇匀。
比色液整体积为 8ml，在恒温下搁置30min，显色。
而后以空白为参比，在 485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
按表 1 加入标准的蔗糖溶液，而后按次序向试管中加入蒽酮乙酸乙酯试剂和 5ml 浓硫酸，充足振荡，立刻将试管放入开水浴中，逐管均正保证温 1min，拿出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm 波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
2．可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取～ 0.30g ，共 3 份，或干资料。
分别放入3 支刻度试管中，加入5～10ml 蒸馏水，塑料薄膜封口，于开水中提取 30min（提取 2 次），提取液过滤入 25ml 容量瓶中，频频冲刷试管及残渣，定容至刻度。
3．显色测定汲取样品提取液于20ml 刻度试管中（重复 2 次），加蒸馏水，以下步骤与标准曲线测定同样，测定样品的光密度。
4．计算可溶性糖的含量VC n可溶性糖含量 (mg/g)= W 103式中 C －标准方程求得糖量 ( μg) ；a－汲取样品液体积 (ml) ；V－提取液量 (ml) ；n－稀释倍数；W－组织重量（ g）。
实验四植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定一、目的从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物体内碳、氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，亦可以作为鉴定其品质的重要指标，而且也有助于训练基本操作技能。
二、原理（一）分离提取原理在80-85%的乙醇中，植物组织中的还原糖、蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2 mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1 mol/L氢氧化钠溶解蛋白质，然后选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。
（二）测定原理1.蒽酮比色法——可溶性糖含量测定碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内其颜色深浅与碳水化合物含量成线性关系。
蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100℃时，加热10 min后出现，而核糖在相同温度下，加热3 min后出现。
此法灵敏度高，糖含量达30 μg即可测定。
2.茚三酮比色法——氨基酸含量测定氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570 nm下有最大光吸收。
在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量呈正比。
3.考马斯亮蓝G-250结合法——蛋白质含量测定考马斯亮蓝在游离状态时呈红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，后者最大光吸收在595 nm，在一定范围内（0-1000 μg /mL），其颜色深浅与蛋白质的含量呈正比。
此法快速灵敏，反应在2 min内即达到平衡，室温1h内颜色稳定，而且干扰物也少。
三、实验用品（一）实验材料：植物样品。
（二）器皿：1. 25 mL刻度试管⨯8 ，15 mL试管⨯20；2. 10 mL离心管⨯2；3. 容量瓶：50 mL⨯1 ，25 mL⨯1；4. 移液管：5 mL⨯2，2 mL⨯4，1 mL⨯2，0.1 mL⨯2；5. 恒温水浴锅；6. 离心机；7. 电子天平；8. 分光光度计。
植物组织中总糖和还原糖含量的测定（蒽酮比色法）2010-5-24一、实验目的掌握蒽酮比色法测定总糖和还原糖含量的原理和方法，学会正确使用分光光度计。
二、实验原理游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在浓硫酸的作用下脱水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物与蒽酮缩合成蓝色的化合物，在620nm处有最大吸收，在一定糖浓度范围内（200ug/ml），溶液吸光度值与糖溶液的浓度成线性关系。
用酸将植物组织中没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，或直接提取植物组织中的还原糖，即可对植物组织中的总糖和还原糖进行定量测定。
三、实验材料1．可见分光光度计、电子天平(1/100)、粉碎机、水浴锅、电炉。
2．研钵、量筒、三角烧瓶、烧杯、容量瓶、玻璃漏斗、试管1.5cm×15cm、刻度吸管、胶头滴管、pH试纸、坐标纸。
3．植物原料，如银耳、木耳、菜叶等。
四、实验试剂1．蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于l000ml体积分数为80％的硫酸中，当日配制使用。
2．标准葡萄糖溶液(0.1mg／m1)：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1 000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。
3．6mol／L HCl溶液：50ml盐酸，加水至100ml。
4．10％NaOH溶液：称取10g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100ml。
五、操作步骤1．葡萄糖标准曲线的绘制取干净试管6支，按下表进行操作。
以吸光度为纵坐标，各标准液浓度(mg／m1)为横坐标做图。
2．样品中还原糖的提取和测定称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。
于50℃水浴中保温半小时（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100ml。
过滤，取lml滤液进行还原糖的测定：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。
实验方案 一、 实验目的 通过实验，掌握测定萝卜品质的方法 （一） 萝卜外部形态的测定 1、 实验材料 取鲜样3个∕小区 直尺、蒸馏水、笔、记录本、吸水纸 2、 实验方法 ．用自来水将各组萝卜洗净后，再用蒸馏水洗涤，擦干表面水分．每个小区取3个重复，用电子天平称量每株的鲜重，用直尺测量植株的茎长、茎粗、叶长，取平均值作为指标值 实验(二) 植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）
一、实验目的 了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用 二、实验原理 糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。 蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上述特定的糖类物质，反应较稳定。该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。 三、材料、仪器及试剂 1.材料：植物种子、白菜叶、柑桔 2.仪器：分光光度计；恒温水箱； 20ml具塞刻度试管（3支） 漏斗；100ml容量瓶；刻度试管；试管架；剪刀；研钵 3.试剂 （1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。 （2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏； （3）浓硫酸 四、实验方法 1.葡萄糖标准曲线的制作 取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。 管 号 1 2 3 4 5 6 标准葡萄糖原液(ml)(200μg/ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸 馏 水 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 葡萄糖含量（μg） 0 40 80 120 160 200 2.样品中可溶性糖的提取 称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。 3.糖含量测定 用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加1ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓H2SO4（注意：浓硫酸遇水会产生大量的热！），盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟（比色空白用2ml蒸馏水与0.5ml蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温10分钟）。冷却至室温后，在波长620nm下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（μg）。 五、结果计算 样品含糖量（g/100g鲜重）=查表所得糖含量（μg）×稀释倍数×100/样品重（g）×106 六、注意事项 （1）加浓H2SO4时应缓慢加入，以免产生大量热量而爆沸，灼伤皮肤，如出现上述情况，应迅速用自来水冲洗。 （2）水浴加热时应打开试管塞。
实验（三） 维生素C的定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）
一、目的要求: （1）学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。 （2）了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。 二、实验原理: 维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸（ascorbic acid）。它对物质代谢的调节具有重要的作用。近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有化学致癌物的阻断作用。 维生素C是具有L系糖型的不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，植物的绿色部分及许多水果（如橘子、苹果、草莓、山楂等）、蔬菜（黄瓜、洋白菜、西红柿等）中的含量更为丰富。 维生素c具有很强的还原性。它可分为还原性和脱氢型。金属铜和酶（抗坏血酸氧化酶）可以催化维生素C氧化为脱氢型。根据它具有还原性质可测定其金属含量。 还原型抗坏血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此，当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。 本法用于测定还原型抗坏血酸，总抗坏血酸的量常用2,4-二硝基苯肼法和荧光分光光度法测定。
CCCCCCHOHHOHOOH OH
O
2NOHClClO+
CCCCCCOHOHOOH OH
O
2NOH
Cl
ClO+
OH(蓝色)还原型抗坏血酸氧化型脱氢抗坏血酸2，6－二氯酚靛酚还原型2，6－二氯酚靛酚(红色)HOH+(无色）NClClO
三、试剂和器材: （一）试剂 2%草酸溶液: 草酸2g溶于100ml蒸馏水中。 1%草酸溶液: 草酸1g溶于100ml蒸馏水中。 标准抗坏血酸溶液（1mg/ml）: 准确称取100mg纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。 0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150ml含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至250ml，贮于棕色瓶中冷藏（4℃）约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。 （二）材料 辣椒、苹果、卷心菜等。 （三）器材 锥形瓶（100ml），组织捣碎器，吸量管（10ml），漏斗，滤纸，微量滴定管（5ml），容量瓶（100ml，250ml）。 四、操作方法: 1.提取 水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20g，加入20ml 2%草酸，用研钵研磨，四层纱布过滤，滤液备用。纱布可用少量2%草酸洗几次，合并滤液，滤液总体积定容至50ml。 2.标准液滴定 准确吸取标准抗坏血酸溶液1ml置100ml锥形瓶中，加9ml 1%草酸，用微量滴定管以0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15s不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出1ml染料相当于多少毫克抗坏血酸（取10ml 1%草酸作空白对照，按以上方法滴定）。 3.样品滴定 准确吸取滤液两份，每份10ml, 分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。另取10ml 1%草酸作空白对照滴定。 4.计算 (-)100Cmg/100gABVVCTDW维生素含量（样品）＝
式中：VA为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数； VB为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数； C为样品提取液的总毫升数； D为滴定时所取的样品提取液毫升数； T为1ml染料能氧化抗坏血酸毫克数（由操作二计算出）； W为待测样品的重量（g）。 五、注意事项: 1.某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。 2.整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1ml或多于4ml，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。 3.本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物反应进行得很慢。 4.2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作用。 5.干扰滴定因素有： 若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1ml氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。 Fe2＋可还原二氯酚靛酚。对含有大量Fe2＋的样品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时Fe2＋不会很快与染料起作用。 样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15s内不消退为终点。 6.提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。 六、思考题： 1．为了测得准确的维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？为什么？ 2．试简述维生素C的生理意义。
实验（四） 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法） 一、目的 1.学习一种蛋白质染色测定的方法 2.掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法 二、原理 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。2～5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01～1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测
定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。 三、器材与试剂 1.仪器 （1）分析天平；（2）具塞刻度试管10ml×8；（3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I；（4）研钵；（5）漏斗； （6）离心管10ml；（7）容量瓶10ml；（8）离心机；（9）721型分光光度计 2.试剂 （1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 100 pg／ml的原液。 （2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。 此溶液在常温下可放置一个月。 3.材料 植物种子
四、操作步骤 1.标准曲线的制作 取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。
