抗癌药物筛选模型与筛选方法的研究_王兴旺

目前对筛选中发现的有一定抗癌活性的 新药已开始重视 观察其对免疫学指标 的影 响。其中非特异性免疫学指标包括巨噬细胞 的吞噬活性和碳粒廓清能力等。反映 T 淋巴 细胞功能的免疫学指标包括移植物抗宿主反 应、T 淋巴细胞体外增殖反应、迟发性超敏反 应和 T 淋巴细胞亚群的功能等。反映 B 淋巴 细胞功能的免疫学指标有溶血空斑形成反应 和血清溶血素含量的变化等。其他免疫学指 标还有 NK 细胞活性、淋巴因子激活的杀伤 细胞( L AK) 活性和白介素的活性等。
分化治疗可使异常增殖的癌细胞转变为
不增殖的较为成熟的细胞, 因此, 寻找分化诱 导剂作为新型肿瘤治疗药物具有重要的理论
和实际意义。HL -60 细胞株是一较为理想的 筛选分化诱导剂的体外模型, 目前多采用硝 基蓝四氮唑( NBT ) 还原法测定该细胞株分化 诱导的情况。其基本原理是: 正常的中性粒细 胞内磷酸戊糖支路活跃, 受佛波酯( T P A) 的 激发, 细胞内还原型辅 酶 II 含量增加, 将可 溶性 NBT 还原为不溶性蓝紫色颗粒, 而沉积 于细胞浆内。在 HL -60 细胞群体中仅有 5% ～10% 的细胞具有 N BT 还原能力。如果经分 化诱导剂作用, 便可使 NBT 反应阳性细胞百 分率提高。本室采用此法观察到低浓度 -双 炔失碳酯对 HL -60 细胞有诱导分化作用, 经 药物作用后, 细胞形态向粒细胞方向分化[ 8] 。 但应注意不能只用上述一项指标来判定一个
使细胞蓝染
3. 无法把握染色时间尺度;
4. 无法适应大规模筛药
MTT 法
较高
较长
M T T 被活细胞线粒体水解酶还原 为不溶性甲? 而 显色, 显色程度与 活细胞数呈正相关
1. 方法简便、快速、经济、敏感; 2. 反应形成不溶物, 测定终点不 稳定; 3. 成色反应有时间依赖性; 4. 不能用于植物粗提物; 5. 不适 用于酶活力低的细胞; 6. M T T 需新鲜配制
2. 4 抗微管药的筛选方法 微管是抗癌药的又一作用靶点。微管蛋
白的聚合活性可通过浊度测定法、粘度测定 法和免疫荧光法等来观察。特别是浊度测定 法简便快速, 重复性又好, 已被用于抗微管药 的筛选[ 10] 。其基本原理是: 在一定缓冲条件 及 GT P 存在下, 随温度升高, 微管蛋白聚合 成 微 管, 溶 液 浊 度 也 随 之 增 加, 可 根 据 350nm 波长处吸光度的改变绘出一条“S”型 微管聚合曲线。再将已聚合的微管蛋白溶液 置于 0～4℃, 使已聚合的微管开始解聚, 其 浊度也逐渐下降, 可根据吸光度的改变绘出 一 条 倒“S ”型 解 聚曲 线 。这 样 即 可依 据 浊 度 变化曲线分析药物的作用。 2. 5 生物反应调节剂( BRM ) 类抗癌药物的 筛选方法
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组织移植至 SRC 部位, 在装有 100 格( 10 格 = 1 m m) 显微标尺的体视显微镜下测量移植 块的最大直径( L ) 和最小直径( W ) , 复原肾脏
化合物是否有分化诱导作用, 应同时观察细 胞形态的变化。
2. 3 拓扑异构酶抑制剂的筛选方法 拓扑异构酶能将 DNA 超螺旋解开, 有
利于 DNA 的复制, 因而以该酶为靶点的新 抗癌药的筛选已引起广泛关注。筛选拓扑异 构酶抑制剂 的方法归纳起来 可分为细 胞外
法、细胞内法和碱洗脱法。细胞外法的核心是
寻找选择性高的抗癌药物是当前制药工 业的重要研究课题, 应提高新药筛选质量, 增 加筛选工作的可靠性和预见性, 减少筛选结 果的假阴性和假阳性, 创制出有代表性的各 类肿瘤的筛选模型和筛选方法。近年来, 我国 在此方面的研究已取得不少进展。现结合本 实验室的工作作一介绍。 1 抗癌药物筛选模型的研究
540nm 检读
XT T 法:
预培养 1d 药物处理 2d 加 X TT 4h 450nm 检读
SRB 法:
预培养 1d 药物处理 2d 三氯乙 酸固定 1h 洗 涤 540nm 检读
干燥
加 SR B 30min 洗 涤
干燥
溶解
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加 1 倍) 。几种抗肿瘤药物对该模型均呈现抑 制作用, 抑瘤率都在 60% 以上( 表 1) , 提示在
一时缺少大量裸鼠的情况下, 可用免疫功能
正 常 的 小鼠 代 替 裸 鼠 进 行 抗癌 药 物 的 筛
选[ 2] 。
表 1 一些药物对正常小鼠肾包膜下人肺腺
癌移植瘤生长的影响
组 别
剂 量 ( mg /kg/
并缝合伤口。移植后第 7 d 处死小鼠, 取出持 瘤 肾脏, 在体 视显微 镜下 测量 移植 块 L 和 W , 求出平均直径和理论瘤重( 1/ 2L W 2) , 并 计算抑瘤率。本室将人体肺腺癌移植至正常
ICR 小鼠 SRC 部位, 移植后 5～8 d 内, 肿瘤 直径能持续生长( 在这段时间, 肿瘤直径约增
操作流程
台盼蓝法: 预培养 1d 药物处理 2d 加台盼蓝
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镜下计数
1. 方法灵敏、稳定; 2. 成色反应无 时间依赖性, 故特别适用于大规模 筛药; 3. 可用于植物粗提物; 4. 不 适 用 于 悬浮 细 胞; 5. 操 作 步骤 较 多, 工作量大
MT T 法:
预培养 1d 药物处理 2d 加 M T T 4h 离心 溶解
法, 适用于增殖比率较高、生长速度较快的细 胞, 对悬浮细胞的细胞毒活性检测尤为合适。 MT T 法的 主要 缺点是 所形 成的 甲? ( form azan) 不溶于水, 给实验操作带来不便[ 4] 。如 采用十二烷基硫酸钠( SDS ) 溶解, 可不必去 除上清, 但重复性较差; 晚近本室改用三联溶 液( 10% SDS-5% 异 丙醇-0. 12% HCl) 溶 解 或将 M T T 改 为 XT T , 取 得较 好 结果[ 。 5, 6] SRB( 磺基罗丹明) 蛋白质染色法的主要优点 是克服了 MT T 法和 XT T 法成色反应的时 间依赖性, 因而特别适用于批量测定, 既可减 少实验误差, 又可提高工作效率[ 7] 。现将 4 种 检测方法的主要特点比较于表 2。 2. 2 分化诱导剂的筛选方法
△本课题得到“八·五”国家科技攻关专题基金和本所 新药研究国家重点实验室基金资助
裸鼠移植模型和人癌小鼠肾包膜下( SRC) 移 植模型的研究。 1. 1 人癌裸鼠移植模型
裸鼠因胸腺依赖性免疫功能缺陷, 异种 移植时无明显排斥反应, 可进行人癌移植, 并 可保持人癌原有的组织形态和生物学特性以 及对抗癌药的原有敏感性。可见, 人癌裸鼠移 植模型的建立, 开辟了直接针对人癌进行化 疗研究的新途径。我所是目前国内拥有人癌 裸小鼠移植模型最多的单位, 已成功地将人 结肠癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、 肾癌、宫颈癌、肝癌、淋巴瘤和白血病等移植 于裸小鼠, 晚近又首建了儿童视网膜细胞瘤 ( Rb-C) 和人恶性纤维组织细 胞瘤裸鼠移植 模型, 并进行了抗癌药筛选研究[ 1] 。只是裸鼠 饲养困难, 价格昂贵, 国内现有条件下尚难用 于常规筛药。 1. 2 人癌小鼠 SRC 移植模型
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综述与专论
抗癌药物筛选模型与筛选方法的研究△
王兴旺 胥 彬
( 中国科学院上海药物研究所, 上海 200031)
摘要 主要介绍用于抗癌药物 筛选的人癌裸鼠移 植模型和人癌小鼠 肾包膜下移植模型; 对细胞毒 活性的 4 种体外检测方法 进行了比较; 还对分化诱导剂、拓扑异构酶 抑制剂、抗微 管药和生物反应 调节剂的筛选方法进行了评述。 关键词 抗癌药物 筛选模型 筛选方法
肿瘤平 理论瘤重 肿瘤抑制率
均直径
d ×d , ip) ( mm ±SD ) ( mg)
(%)
对照
3. 2±0. 3 16. 4
5-氟尿嘧啶 37. 5×5 1. 1±0. 5* * 0. 7
96
长春新碱 0. 3×5 1. 9±0. 8*
3. 4
79
对照
4. 0±0. 6 32. 0
丙双吗啉 100. 0×5 2. 8±0. 4* 11. 0
本室研究表明, 人癌移植于免疫功能正 常的小鼠 SRC 部位后, 在较短时间内能逃避 机体的免疫排斥反应, 并可增加肿瘤浸润和 转移的机会; 而且 SRC 部位的肿瘤血供较丰 富, 化疗的敏感性高; 实验周期短; 每次实验 动物较少, 可使成本大大降低; 因而具有很大 的实用价值。具体做法是: 小鼠 ip 水合氯醛 麻醉, 5 m in 后常规消毒背部皮肤, 手术暴露 右侧肾脏, 用套管针将 2 mm 左右的新鲜癌
表 2 4 种细胞毒检测方法和操作流程的比较
方 法
灵敏度
需要时间 基 本 原 理
主 要 特 点
台盼蓝法
较高
1. 方法简便、快速, 成本低廉;
活细胞不被低浓度台盼蓝染色。使
2. 膜通 透性改 变与细 胞死 亡不 同
癌细胞与之接触, 直接镜下观察,
短
如细 胞死 亡, 台盼 蓝即 进入 细胞, 步, 故客观性不够, 假阴性率较高;
胺, 150 mg / kg , ip) 的昆明种小鼠 SRC 部位, 并以此 模型观察 到 -双炔 失碳酯对 HL -60 细胞的体内生长有明显抑制作用( 待发表资
料) 。 2 抗癌药物筛选方法的研究
2. 1 细胞毒活性的体外检测方法
细胞毒活性的体外检测方法主要包括台
盼蓝排染法、MT T 法、XT T 法和 SRB 法。台 盼蓝排染法是以活细胞计数为指标的经典方
XTT 法
较高
XTT 被活细 胞线粒体水解 酶还原 1. 反应产物具水溶性, 故贴壁与悬
短
为可溶性甲? 而 显色, 显色程度与 浮细胞均可采用; 2. 本底较高, 重
活细胞数呈正相关
复性受 pH 影响; 其余同 M T T 法
SRB 法
高
SR B 使活细胞内蛋白质染色; 染色 长
程度与活细胞数呈正相关
动物移植性肿瘤仍是目前筛选实验中最 常用的模型。其主要优点是: 接种适量瘤细胞 后不久即产生肿瘤, 移植成活率高, 生长均 匀, 易于客观地判断疗效, 实验周期较短等。 但其主要缺点是实验结果常与临床反应不一 致。此外, 用动物移植性肿瘤发现的抗癌药主 要对恶性淋巴瘤和白血病有效, 而对常见的 实体瘤如肺癌、肝癌、胃癌及食道癌等往往疗 效不佳。因此动物移植性肿瘤模型有其可用 性, 也有其局限性, 也说明建立人肿瘤细胞株 及人癌异种移植模型至关重要。近几年, 我国 从国外引进并自建了不少人肿瘤细胞株, 自 建的瘤株包括耐维 A 酸的人白血病细胞株 ( HL -60-RA R) 、人 结 肠 癌 耐 药 株 ( HCT , V2000) 和人口腔癌耐 药株( KB, V2000) 等。 在人体肿瘤异种移植方面, 主要开展了人癌
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直接将受试药物加入到拓扑异构酶反应体系 判断药物的活性。由于药物直接作用于细胞, 中, 于 37℃反应 30 min 后, 以 10% 的 SDS 终 与细胞外法相比更客观, 更接近于整体实验, 止反应, 再以蛋白酶 K 消化药物-DNA-酶复 并可用于那些通过影响细胞内其他系统而改 合物中的酶, 经琼脂糖凝胶电泳, EB 染色, 于 变拓扑酶活性的药物的研究, 但较费时。碱洗 260nm 紫外灯下观察, 照相记录。根据反应结 脱法是研究 DNA 损伤和 修复的重要方 法。 果, 判断药物的活性。细胞内法直接用受试药 由于药物引起的 DNA 断裂大多与拓扑酶活 物处理细胞, 经一定时间后收集细胞, 提取拓 性有关, 故常用该法来研究药物对拓扑酶的 扑异构酶, 测定酶总量或酶活性的变化, 由此 作用。
66
n= 6, * P< 0. 01, * * P < 0. 001, 理论瘤重= 1/ 2 ×最大 直径×最小直径2
但上述方法只能接种实体瘤块, 体外培 养的肿瘤细胞一般不能直接进行移植。因此,
晚近本室又采用 Fingert 等[ 3] 首建的肿瘤细
胞加纤维蛋白凝块的 SRC 法将体外培养的 人早幼粒白血病 HL -60 细胞以纤维蛋白凝 块作为支持物, 接种于经免疫抑制( 环磷酰