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抗菌药物筛选的实验方法与技术博哥(中山大学化学与化学工程学院，广州510275)摘要为了筛选出活性更好的抗菌药物，本实验采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC50来评定药物活性。
结果显示，样品1（环丙沙星）对二者有杀菌作用，最小抗菌浓度都为1.56 μmol·L-1。
样品30仅对大肠杆菌有杀菌作用，最小抗菌浓度为1.56 μmol·L-1。
样品17、19、20、24、26、28，表现出对大肠杆菌较好的抑制作用，其中抑制活性最好的为样品28(2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)，IC50值为1.72 μmol·L-1。
样品31、42表现出对金黄色葡萄球菌较好的抑制活性，IC50值分别为11.04 μmol·L-1和24.44 μmol·L-1。
关键词抗菌药物筛选体外实验微量稀释法1 引言一个新的化合物或分离提取的有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验来证实。
一般采用体外实验方法，观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用。
药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。
因此，体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。
体外实验的重要性在于方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。
但是，体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。
本实验进行微生物培养基的配置、灭菌与接种等操作，以熟悉细菌培养的过程，并采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC50来评定药物活性。
2实验部分2.1药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、胰蛋白胨、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl溶液、DMSO以44种化合物(见表1)。
抗菌药物筛选的实验方法与技术教案第一章：抗菌药物筛选概述1.1 抗菌药物的概念与作用1.2 抗菌药物的分类及代表药物1.3 抗菌药物筛选的重要性1.4 抗菌药物筛选的发展历程及趋势第二章：抗菌药物筛选实验方法2.1 纸片扩散法2.1.1 原理及操作步骤2.1.2 结果判定与分析2.2 微量肉汤稀释法2.2.1 原理及操作步骤2.2.2 结果判定与分析2.3 微量棋盘法2.3.1 原理及操作步骤2.3.2 结果判定与分析2.4 时间耐药法2.4.1 原理及操作步骤2.4.2 结果判定与分析第三章：抗菌药物筛选实验技术3.1 菌株的准备与鉴定3.1.1 菌株的来源与保存3.1.2 菌株的纯化与鉴定3.2 抗菌药物的准备与应用3.2.1 抗菌药物的来源与储存3.2.2 抗菌药物的应用方法3.3 实验数据的统计分析3.3.1 实验数据的收集与整理3.3.2 实验数据的统计方法及应用第四章：抗菌药物筛选实验中的常见问题及解决办法4.1 菌株的选择与鉴定问题4.2 抗菌药物的应用与浓度选择问题4.3 实验操作过程中的技术问题4.4 实验结果的判定与分析问题第五章：抗菌药物筛选实验的应用与实践5.1 临床抗菌药物筛选与应用5.1.1 临床抗菌药物筛选的流程与要求5.1.2 临床抗菌药物的应用原则与策略5.2 抗菌药物的研究与开发5.2.1 抗菌药物研究的基本方法与技术5.2.2 抗菌药物研发的趋势与挑战5.3 抗菌药物筛选实验在疫苗研究中的应用5.3.1 疫苗研究中的抗菌药物筛选问题5.3.2 抗菌药物在疫苗研究中的应用实例第六章：抗菌药物筛选实验的案例分析6.1 案例一：医院感染病原菌的抗菌药物筛选6.1.1 案例背景与目的6.1.2 实验方法与步骤6.1.3 结果分析与讨论6.2 案例二：新型抗菌药物的研究与筛选6.2.1 案例背景与目的6.2.2 实验方法与步骤6.2.3 结果分析与讨论第七章：抗菌药物耐药机制7.1 细菌耐药机制概述7.1.1 细菌耐药的定义与分类7.1.2 细菌耐药机制的主要类型7.2 常见的细菌耐药机制7.2.1 酶抑制剂的产生与作用7.2.2 药物靶点的改变与适应7.2.3 药物外排系统的功能与调控7.3 抗菌药物耐药机制的研究方法7.3.1 耐药机制研究的实验方法7.3.2 耐药机制研究的生物信息学方法第八章：抗菌药物筛选实验的优化与改进8.1 抗菌药物筛选实验的优化策略8.1.1 实验条件的优化8.1.2 实验方法的改进与创新8.2 实验技术的更新与发展8.2.1 自动化与智能化技术在抗菌药物筛选中的应用8.2.2 微流控技术在抗菌药物筛选中的优势与挑战8.3 抗菌药物筛选实验的未来发展趋势8.3.1 个性化医疗与精准抗菌治疗8.3.2 抗菌药物筛选与合成生物学的结合第九章：抗菌药物筛选实验在疫苗研究中的应用9.1 疫苗研究中的抗菌药物筛选问题9.1.1 疫苗与抗菌药物筛选的关系9.1.2 疫苗研究中的抗菌药物筛选挑战9.2 抗菌药物在疫苗研究中的应用实例9.2.1 抗菌药物在疫苗保护效果评估中的应用9.2.2 抗菌药物在疫苗载体研究中的应用第十章：总结与展望10.1 抗菌药物筛选实验方法的优缺点分析10.1.1 各种实验方法的优缺点对比10.1.2 实验方法选择与应用的建议10.2 抗菌药物筛选实验技术的发展趋势10.2.1 实验技术的创新与改进10.2.2 抗菌药物筛选实验在多领域的应用扩展10.3 对抗菌药物筛选实验的展望10.3.1 提高抗菌药物筛选的准确性与效率10.3.2 为抗菌药物的研究与临床应用提供有力支持重点和难点解析重点环节一：抗菌药物筛选的实验方法与技术补充和说明：在这一部分，学生需要理解并掌握各种抗菌药物筛选实验方法的原理、操作步骤和结果判定与分析。
一、实验目的1. 熟悉细菌分离纯化的原理和方法。
2. 掌握平板划线法和稀释涂布平板法两种分离纯化细菌的方法。
3. 学会观察和识别不同类型的细菌菌落。
4. 提高无菌操作技能。
二、实验原理细菌分离纯化是微生物学实验中的重要技术，其目的是从混杂的微生物群体中分离出单个或少数几个纯培养的细菌。
常用的分离纯化方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
平板划线法：将混合菌液涂布在琼脂平板上，用接种环划线，使菌液在平板上逐渐稀释，最终在划线末端获得单个菌落。
稀释涂布平板法：将混合菌液进行系列稀释，然后将不同稀释度的菌液涂布在琼脂平板上，经过培养，观察和计数菌落，计算出原菌液的含菌量。
三、实验材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯培养基等。
3. 实验器材：无菌操作台、接种环、涂布器、酒精灯、镊子、试管、试管架、显微镜等。
四、实验方法1. 平板划线法（1）将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上。
（2）用接种环在平板上划线，从一端开始，划到另一端，每次划线前用火焰灼烧接种环。
（3）重复划线，使菌液在平板上逐渐稀释。
（4）将平板倒置，放入恒温培养箱培养。
（5）观察菌落生长情况，记录菌落特征。
2. 稀释涂布平板法（1）将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上。
（2）将菌液进行系列稀释，如1:10、1:100、1:1000等。
（3）用涂布器将不同稀释度的菌液涂布在平板上。
（4）将平板倒置，放入恒温培养箱培养。
（5）观察菌落生长情况，记录菌落特征和菌落数。
五、实验结果与分析1. 平板划线法（1）金黄色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上生长出的菌落呈金黄色，表面光滑，边缘整齐。
（2）大肠杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上生长出的菌落呈红色，表面光滑，边缘整齐。
（3）枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上生长出的菌落呈白色，表面粗糙，边缘不整齐。
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
实验六抗菌药物的体外药效试验文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-实验六、抗菌药物的体外药效试验（药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。
［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。
［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。
琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。
浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。
1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。
对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)方法近年来，随着抗生素的广泛使用以及细菌耐药性的增加，抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）的测定变得日益重要。
MIC是指抗菌药物能够抑制细菌生长的最低浓度，是评估抗菌药物对细菌耐药性的一种重要方法。
下面介绍几种测定抗菌药物MIC的方法。
1. 琼脂扩散法琼脂扩散法是一种经典的MIC测定方法。
该方法基于抗生素与菌株相互作用抑制菌株生长的原理。
实验中将不同浓度的抗生素溶液加入琼脂平板中，并在琼脂表面均匀涂布细菌悬液。
待菌株在琼脂表面生长形成克隆后，观察克隆周围清晰的无菌区域大小，根据无菌区域所对应的抗生素浓度计算MIC值。
该方法简单易行，但由于该方法目测判断，因此存在主观性差异和读片误差的问题。
2. 荧光素二磷酸盐3-（4,5-二苯基噻唑）（Alamar blue）法荧光素二磷酸盐3-（4,5-二苯基噻唑）法是一种高通量及准确性较高的MIC测定方法。
该方法基于菌株呼吸代谢消耗的荧光素二磷酸盐3-（4,5-二苯基噻唑）的发光信号变化来评估抗生素的MIC值。
实验中将不同浓度的抗生素溶液加入微孔板中，并添加细菌悬液及荧光素二磷酸盐3-（4,5-二苯基噻唑），经过一定时间后读取板上的荧光信号，测算MIC 值。
该方法准确性高，可用于筛选大量样本的抗菌药物敏感性，但需要特殊设备和耗费较多经费。
3. 壳聚糖纳米粒子微滴法壳聚糖纳米粒子微滴法是一种新兴的MIC测定方法。
该方法基于壳聚糖纳米粒子本身具有抑菌作用及微滴原理，实验中将不同浓度的抗生素与含菌液的溶液制成微滴，并添加壳聚糖纳米粒子，待微滴凝胶后进行观察，根据微滴内的细菌生长情况评估折射率值，进而计算MIC值。
这种方法具有较高的准确性和可靠性，但需要特殊仪器和技术支持。
4. 测序MIC法随着测序技术的发展，现已出现测序MIC法。
该方法基于高通量测序技术，对菌株进行全基因组测序，确定细菌株中抗生素耐药基因的编码序列，并进行序列比对和分析，确定抗生素的MIC值。
抗菌药物筛选的实验方法与技术一、实验原理体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。
药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。
培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖成积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。
主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。
培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。
此外，为了满有微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的pH。
按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。
固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂(常加1.5%-2%的琼脂)经融化冷凝而成。
半固体培养这是指在液体培养基中加入0.8％-1％左右的琼脂，经融化冷凝而成。
液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。
正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。
由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。
但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及接菌等基本环节大致相同。
微量稀释法常用于测定细菌对药物敏感性或新药对细菌的抗菌活性试验。
一般应用96孔微量稀释板，孔底呈U型，每孔容量为0.20-0.30ml。
本法操作较便，用培养基量少，可作大批量药敏试验。
二、材料与方法1，药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、胰蛋白胨、琼脂等。
1mol/L NaOH、1mol/L HCl溶液。
2，材料与仪器天平、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、超净工作台、酒精灯、移液器、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗、药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管、报纸、96孔板等。
抗菌药物筛选的实验方法与技术一、实验原理体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。
药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。
培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖成积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。
主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。
培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。
此外，为了满有微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的pH。
按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。
固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂(常加1.5%-2%的琼脂)经融化冷凝而成。
半固体培养这是指在液体培养基中加入0.8％-1％左右的琼脂，经融化冷凝而成。
液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。
正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。
由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。
但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及接菌等基本环节大致相同。
微量稀释法常用于测定细菌对药物敏感性或新药对细菌的抗菌活性试验。
一般应用96孔微量稀释板，孔底呈U型，每孔容量为0.20-0.30ml。
本法操作较便，用培养基量少，可作大批量药敏试验。
二、材料与方法1，药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、胰蛋白胨、琼脂等。
1mol/L NaOH、1mol/L HCl溶液。
2，材料与仪器天平、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、超净工作台、酒精灯、移液器、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗、药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管、报纸、96孔板等。
青霉素菌的分离和筛选土壤中青霉素菌的分离和筛选（一）实验目的1、了解采集土样的要求和方法。
2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。
3、学习并掌握微生物的纯培养技术。
(二)实验原理采用适宜(选择)培养基和培养条件，或加入某种抑制剂有利于目标微生物的生长，从而分离获得目标微生物的纯培养：常用稀释平板分离法和划线分离法在固体培养基上形成单个菌落。
抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质青霉素属于青霉素类抗生素，干扰细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用。
（三）实验材料1含菌种的土壤，学校旁边的土层中获取2.复筛实验菌种：金黄色葡萄球菌，曲霉3.培养基和试剂：高氏一号培养基，高氏一号初筛培养基（含青霉素），试剂：青霉素，硝酸钾，氯化钠，重铬酸钾，4.实验器材：无菌试管，烧杯，移液管，三角瓶,天平,接种环，高压锅灭菌锅,显微镜.（四）实验步骤1.培养基配制①：高氏一号改良培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，终浓度为50×10-5重铬酸钾，pH7.2～7.4。
配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。
112℃灭菌20分钟。
冷却后，倒致平版数个。
②：初筛培养基：改良高氏一号培养基（在原来配置的高氏一号琼脂培养基灭菌后，再分别加入青霉素终浓度为10-3，10-4，10-5的药剂），倒致平版数个2.样品采样：取样时应取土壤表层下5～10cm处土样，干后混匀；3 制备稀释液：（1）. 称取土壤1g（或量取1nl水样），放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10－2的土壤悬液。
抗菌药物筛选的实验方法与技术博哥(中山大学化学与化学工程学院，广州510275)摘要为了筛选出活性更好的抗菌药物，本实验采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC50来评定药物活性。
结果显示，样品1（环丙沙星）对二者有杀菌作用，最小抗菌浓度都为1.56 μmol·L-1。
样品30仅对大肠杆菌有杀菌作用，最小抗菌浓度为1.56 μmol·L-1。
样品17、19、20、24、26、28，表现出对大肠杆菌较好的抑制作用，其中抑制活性最好的为样品28(2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)，IC50值为1.72 μmol·L-1。
样品31、42表现出对金黄色葡萄球菌较好的抑制活性，IC50值分别为11.04 μmol·L-1和24.44 μmol·L-1。
关键词抗菌药物筛选体外实验微量稀释法1 引言一个新的化合物或分离提取的有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验来证实。
一般采用体外实验方法，观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用。
药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。
因此，体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。
体外实验的重要性在于方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。
但是，体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。
本实验进行微生物培养基的配置、灭菌与接种等操作，以熟悉细菌培养的过程，并采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC50来评定药物活性。
2实验部分2.1药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、胰蛋白胨、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl溶液、DMSO以44种化合物(见表1)。
表1 44种化合物与对应编号2.2材料与仪器天平、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、超净工作台、酒精灯、移液器、96孔板、酶标仪、恒温箱、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗、药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管、报纸。
2.3实验方法2.3.1玻璃器皿的洗涤和包装将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。
移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。
洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。
培养皿由一盖一底组成一套。
可用报纸将几套培养皿包成—包、或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。
(已由实验室完成)2.3.2固体培养基的配制过程表2 固体培养基药品与用量药品牛肉膏蛋白胨NaCl 琼脂水pH 用量0.5g 1g 0.5g 1.5-2g 100ml 7.2 (1)称量及溶化：分别称取蛋白胨相NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。
然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。
将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。
(2)调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。
(3)定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
(4)固体培养基加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水。
(5)分装、加塞、包扎。
(6)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。
2.3.3棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一快，铺展于左手拇指和食指如成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。
也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。
制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不室过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。
棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。
2.3.4培养基的灭菌培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，100Pa灭菌20min。
灭菌完毕，除去锅内剩余水分，保持灭菌锅干燥。
2.3.5斜面和平板的制作(1)斜面的制作：将巳灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面，斜面长度不超过试管长度1/2为宜。
如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。
(2)平板的制作：将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷李50°C左右倾入无菌培养皿中。
平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10-12 ml的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。
2.3.6斜面培养基接种(1)左手拇指、食指、中指及无名指分别持菌种相待接种的培养基管，使菌种管口位前，待接种培养基管口位后，斜面部均应向上，勿成水平，以免管底凝结的水浸湿培养基表面或沾湿棉塞。
(2)右手持接种环，在火焰上烧灼灭菌，待冷。
(3)以有手手掌与小指，小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞，将两管管口迅速通过火焰灭菌。
(4)以灭菌并冷却的接种环伸入菌种管内，从斜面上沾取菌苔少许，退出菌种管，再迅速移入待接种的培养基管，自斜面底部轻轻向顶端婉蜒划线或在斜面作上下轻轻涂布，切勿划破培养基表面。
沾菌的接种环进出试管时，均不应触及试管内壁及管口。
(5)接种完毕，重新烧红接种环灭菌后插入试管架上。
两管管口迅速通过火焰2-3次，塞回棉塞。
(6)将接种管置37℃温箱培养18-24小时后观察生长情况。
2.3.7微量稀释法体外抗菌实验(1)抗菌化合物的初步筛选选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，取96孔培养板一块，在超净工作台内，酒精灯下，用无菌的连续移液器按表3加样，DMSO的最终浓度保持在1%，样品最终浓度为200 μmol/L，每个样品设两个平行孔。
震荡混合后37℃培养12h-18h,，再用酶标仪630nm侧吸光度。
表3 初步筛选加样方式1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 培养液200μl 样品1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11B 培养液200μl 样品1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11C 培养液200μl 样品12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22D 培养液200μl 样品12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22E 菌对照(2μl DMSO) 样品23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33F 菌对照(2μl DMSO) 样品23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33G 菌对照(2μl DMSO) 样品34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44H 菌对照(2μl DMSO) 样品34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44(2) 最小抑菌浓度或IC50的测试从上述筛选中选出11种抑制较好的化合物，用微量稀释法测定最小抑菌浓度或IC50，培养板样品的加入方法与表3类似，第1列相同，第2列到12列为选出的11个化合物，以2倍进行稀释3结果分析与讨论3.1数据记录表4 大肠杆菌药物初步筛选结果123456789101112 A-0.0600.1030.0550.0070.0350.0000.0370.0320.0130.0060.0850.061 B-0.069-0.0640.0470.0010.054-0.0270.0460.0610.032-0.0010.0480.031 C-0.100-0.006-0.010-0.0550.0160.581-0.001-0.007-0.063-0.028-0.025-0.009 D-0.060-0.0030.0610.0490.284-0.022-0.043-0.011-0.053-0.0110.003-0.015 E0.069-0.012-0.0490.017-0.047-0.024-0.027-0.015-0.065-0.0520.0670.002 F0.048-0.035-0.055-0.027-0.0430.038-0.037-0.009-0.056-0.0570.0170.008 G0.0880.0040.0570.026-0.0390.0370.0410.1180.220-0.025-0.0160.015 H0.0840.1100.0640.0690.0180.0860.0740.1090.171-0.0650.1090.039表5 金黄色葡萄球菌药物初步筛选结果123456789101112 A-0.0870.0590.002-0.0300.009-0.0490.0100.009-0.011-0.0220.0120.022 B-0.0920.0640.0070.0170.0080.0530.043-0.0050.015-0.0070.0080.119 C-0.117-0.024-0.0130.029-0.023-0.017-0.0100.009-0.078-0.054-0.0020.034 D-0.083-0.0120.039-0.0010.025-0.019-0.062-0.058-0.066-0.047-0.0080.006 E0.0480.027-0.048-0.007-0.0390.057-0.043-0.037-0.079-0.0720.0570.022 F0.058-0.032-0.0340.009-0.002-0.005-0.047-0.024-0.069-0.0480.0710.030 G0.1490.0210.049-0.034-0.0170.023-0.0110.2190.484-0.0750.1070.034 H0.1230.1490.1440.0930.0810.0890.0860.1010.067-0.0770.0390.413根据初步筛选结果，对大肠杆菌有较好抑制活性的化合物有样品1、17、19、20、23、24、26、28、30、31和42，对金黄色葡萄球菌有较好抑制活性的化合物有样品1、9、17、19、20、24、26、28、30、31和42，将选出的化合物用微量稀释法测定最小抑菌浓度或IC50。
表6 大肠杆菌最小抑菌浓度或IC50的测试123456789101112 A-0.030-0.0260.0490.0080.0490.023-0.0460.039-0.043-0.0360.009-0.055 B-0.045-0.0440.042-0.030-0.0140.117-0.0550.009-0.047-0.033-0.018-0.075 C-0.107-0.105-0.067-0.092-0.069-0.098-0.107-0.055-0.081-0.077-0.0470.360 D-0.038-0.038-0.009-0.023-0.012-0.023-0.033-0.032-0.039-0.031-0.0130.025 E0.050-0.043-0.002-0.026-0.022-0.024-0.035-0.042-0.050-0.024-0.0090.115 F0.035-0.0570.0490.0480.0220.014-0.014-0.015-0.034-0.018-0.0100.027 G0.069-0.0380.0580.0550.0410.0060.0100.009-0.005-0.021-0.0030.064 H0.066-0.0670.0000.0430.0880.1070.0120.045-0.009-0.0200.0100.052表7 金黄色葡萄球最小抑菌浓度或IC50的测试123456789101112 A-0.025-0.0160.0310.0440.0060.050-0.0310.0780.0250.0180.016-0.030 B-0.046-0.0320.0170.0030.0000.019-0.0100.0500.0330.015-0.011-0.038 C-0.093-0.093-0.048-0.063-0.043-0.046-0.059-0.022-0.010-0.035-0.020-0.035 D-0.042-0.034-0.003-0.028-0.016-0.031-0.035-0.026-0.033-0.0460.0030.029 E0.048-0.0350.001-0.0110.012-0.018-0.038-0.030-0.042-0.039-0.0050.014 F0.039-0.052-0.001-0.052-0.052-0.027-0.003-0.037-0.032-0.0420.0050.018 G0.051-0.0330.061-0.045-0.0430.0330.0540.0360.0170.0120.0140.011 H0.065-0.0590.097-0.069-0.0620.1110.1290.0800.0940.0150.0440.0853.2数据处理与分析3.2.1 大肠杆菌药物筛选从表6中可以看出第2组(样品1)和第10组(样品30)的数据全是负值且与空白值接近，证明在每一个浓度下，大肠杆菌都不能生长，所以最小抑菌浓度为1.5625 μmol/L，如果需要找出更准确的最小抑菌浓度，样品需要进一步稀释。
