衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达(一)

衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达(一)

作者：任文君,王群义,吕小凤,毛泽斌,蒋晓刚

【摘要】目的:研究在衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白（）表达增加的影响因素。方法:用Northernblot的方法显示基因的表达在年轻和衰老的2BS细胞中存在差异;PCR扩增出人类上游包括5＇区的2kb的序列并用酶切得到4组不同长短的启动子片段;将各片段用EffecteneTransfectionReagent试剂盒转染到年轻和衰老细胞中,测出几组构建基因片段的启动活性,确定可调控转录活性的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件。结果:与年轻的2BS细胞相比,衰老的2BS细胞中基因的表达升高;在启动子+59到-58序列之间存在着蛋白结合位点;5＇＇是的增强子元件。结论:在衰老的2BS细胞中基因上游-37到-8的30bp序列存在一个新的增强子元件对的表达起到调控作用。

【关键词】胰岛素样生长因子结合蛋白细胞

〔Abstract〕AIM:Tostudytheinfluencingfactorsoftheincreasedexpressionofthecontrollinginsulingrowthfactorsb（）inthesenescentcells.METHODS:NorthernblotwasusedtoshowofthedifferentialexpressionoftheIGFudingtheseriesofthe5＇eobtainedbyenzymedigestion.TheEffecteneTransfectionReagent(Qiagen)kitwasusedtotransfectthefragmentsintotheyoungandsenescentcells.Thepromotingactivityofseveralgroupsofconstructinggenefragmentswereevaluated.Theareaofthecontrollingtransfectionactivitywasdetermined.Theenhancerelementintheactivityareawasascertainedbysuperimposingtheoligonucleotidegelblockingexperi＇＇wastheenhancere〔Keywords〕

胰岛素样生长因子（insulingrowthfactors,IGFs）是人体最重要的生长因子之一,对人体组织细胞的生长发育有广泛而重要的调节作用。不少研究结果发现胰岛素样生长因子对免疫系统及多种免疫细胞有正性调节作用,如促进T、B淋巴细胞和粒细胞增生〔1〕,调节前B细胞分化,促进B细胞抗体生成〔2〕,增强NK细胞杀伤活性等〔3〕。许多免疫组织细胞也表达IGFs受体,自身分泌IGFs和产生IGFs结合蛋白（）,因而IGFs在免疫发育和功能调节中的作用越来越受到关注。人类和动物血浆及体液中的IGFs绝大部分以与IGFBP结合的形式存在,游离的部分才具有生物活性,约占1%。IGFs与IGFBP的结合可调节IGFs与IGFR的结合,影响胰岛素样生长因子受体(IGFR)下游信号转导通路中信号强度,从而控制IGFs的生物活性〔4〕。因此,探明IGFBPs基因表达的分子机制,对研究IGFs的生物学作用及调节机制奠定基础。我们扩增出人类上游包括5＇UTR区的2kb的序列并用酶切得到4组不同长短的IGFBP3启动子片段;将各片段用EffecteneTransfectionReagent(Qiagen)试剂盒转染到年轻和衰老细胞中,测出几组构建基因片段的启动活性,确定可调控转录活性的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件。为今后研究该基因的表达调控机制和生物学功能打下了基础。

1材料和方法

1.1材料

人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）购于中国生物制品研究所;杂交试剂ExpresshybTMhybridizationsolution购于Clontech公司;Taq酶,SacII,PmacI,Xh质粒,Corefootprintingsystemkit均购于Promega公司;RNA提取试剂盒RNeasytotalRNAkit和转染试剂盒EffecteneTransfectionReagent购于Qiagen公司;〔〕ATP购于北京福瑞公司购于AmershamPharmaciaBiotech公司。

1.2方法

1.2.1Northernblot检测

用RNeasytotalRNA试剂盒提取总RNA。DNA片段通过randomprimingkit(Promega,Madison,WI)用〔α32P〕dCTP进行标记。在含有2.2mol/L甲醛的10g/L琼脂糖胶中进行电泳,每个样品中总RNA为30μg。电泳完毕后转膜并紫外交联,用ExpresshybTMhybridizationsolution(Clontech)进行杂交,放射自显影。

1.2.2IGFBP3基因5＇调控区片段的构建

用高保真Taq酶扩增出人类上游包括5＇UTR区的2kb的序列。上游引物是:5＇GCTAGCACCTGGGACCTCAAGAATTGCATTT3＇,（5＇端加入了NheI酶切位点）;下游引物是:5＇＇,（5＇端加入了BglII切位点）。将扩增片段转化到质粒当中(Promega),并进一步转化到质粒中,用限制性内切酶从5＇端对片段进行酶切,酶切位点分别在-1303（SacII）、-778（PmacI）、-305（XhoI）、-141（SmaI）,这样用SacII/NheI、PmacI/NheI、XhoI/NheI和SmaI/NheI酶切得到四组不同长短的启动子片段。将酶切后的质粒用T4DNA酶进行酶切,并用T4连接酶连接,将连接好的几组质粒进行电泳和测序鉴定。这样我们得到了5组片段,起始点分别是-2031、-1303、-778、-305和-141,并且片段均包含了转录起始位点。

另将-305的质粒用HindIII和BglII酶切,酶切后的片段用核酸外切酶III/S1核酸酶处理后从新连接测序。这样就得到了另2组基因片段,序列是-58～+59和-114～+59。

1.2.3瞬时转染

将质粒DNA用EffecteneTransfectionReagent(Qiagen)试剂盒转染到年轻和衰老细胞中,同时一起转入0.1μg的质粒作为标准校正,空质粒pGL3作为阴性对照。转染36～48h后加入200μL的裂解液收集,依照Promega双荧光素酶试剂盒建立反应体系并通过的标准化即可测出几组构建基因片段的启动活性。

1.2.4凝胶阻滞试验

提取年轻和老年2BS的核蛋白,准备好野生型和突变型的寡核苷酸探针。在探针末端用T4激酶标记上〔γ32p〕ATP(3000mci/mmol,标记好的探针用sephad纯化。建立反应体系如下:32P标记探针(0.3ng)、5μg核蛋白、1μg的poly(dIdC)和20μLBindingbuffer(20mmol/Lepes,pH7.9,1.5mmol/LMgCl2,0.2mmol/LEDTA,1mmol/L二硫苏糖醇,0.1mmol/LPMSF,75mL/L甘油)。在室温反应30min后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳后进行放射自显影。

1.2.5定点突变

用Quikchange(stratagene)试剂盒进行定点突变,以为模版进行突变反应,突变后的质粒转入到细胞中进行筛选,筛选出突变质粒株并测序鉴定。

1.2.6Northern及RTPCR 用RNeasytotalRNAkit(Qiagen)试剂盒提取总RNA,用randompriming(Promega)试剂盒将α32P〔dCTP〕标记在IGFBP3和GAPDHcDNA片段上。用甲醛变性胶对RNA进行电泳,随后转膜并用紫外交联仪固定。用ExpresshybTMHybridization杂交液(clontech)杂交后进行放射自显影。

用gen)试剂盒进行扩增的上游引物是5＇CAGGCTACACCACCAAGGGGAAG3＇,下游引物是5＇TCCCTGTCTCTCTGTCCCTCCTACC3＇。扩增的同时加入GAPDH作为内参,GAPDH的上下游引物分别为5＇＇;5＇＇。

1.2.7双重荧光素酶报告系统

将野生型和突变型IEE元件克隆到带有SV40启动子的pGL3质粒中,将构建好的质粒与内参质粒共转染到老年和年轻细胞中,用荧光光度计测定荧光酶活性。

2结果

基因在年轻和衰老细胞中的表达差异Northern的结果显示与年轻的2BS细胞相比,在衰老的2BS细胞中基因的表达是升高的。