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CHO细胞表达系统原理分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。
在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。
它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。
本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
CHO细胞表达体系及其特点诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。
1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。
各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。
基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。
针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。
随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。
大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。
此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。
真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。
但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。
一、包涵体的纯化和复性总结(二)关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,内容比较庞杂。
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1。
高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度.此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等.2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动,即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50—100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10—15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整,超声完全了菌液应该变清亮,如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用.4。
反复冻融法：将细胞在—20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸(DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取.这是标准配方:裂解液：50mM Tris—HCl(pH8.5~9.0)， 2mM EDTA, 100mM NaCl， 0.5% Triton X-100， 1mg/ml 溶菌酶。
第21卷6期中国病毒学21（6）：589-593收稿日期：2006-06-01，修回日期：0000-06-19作者简介：李伟灿（1981-），男，福建省籍，硕士研究生，主要从事分子病毒学研究。
** 通讯作者：孟小林（1956-），男，山东省籍，教授，从事基因工程药物及昆虫分子病毒学研究。
Corresponding author. Tel: 86-27-68754217, E-mail:Mengxiaolin8@590 中国病毒学第21卷（36aa）。
CD为线形阳离子肽，成熟肽链长36个氨基酸残基，不含半胱氨酸，对大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌如沙门氏菌具有很强的活性，对某些革兰氏阳性菌也有杀伤活性。
天然抗菌肽来源有限，不易分离纯化，无法满足将来医药和科研的需求。
因此采用外源系统实现活性表达很有必要。
国内外均有抗菌肽表达的文献报道[6,7]，但是关于抗菌肽CD 的高效表达及生物活性却未见报道。
本研究成功调取了CD 全长基因，并将编码成熟肽的基因序列成功克隆到表达载体pET32a中，在大肠杆菌BL21中实现了高效融合表达，融合蛋白经肠激酶切割后，分离纯化得到的重组成熟肽，经检验有抑菌和抗BmNPV病毒感染活性。
1 材料与方法1.1实验材料实验用的家蚕来自湖北省农业科学院经济作物研究所，BmNPV提取自病毒感染致死家蚕，经活体感染扩增后提纯，－70 ℃保存。
测活用细菌，金黄葡萄球菌，枯草芽孢杆菌来自湖北省药检所。
克隆载体pGEM-T，反转录酶AMV酶为Promega 公司产品，表达载体pET32a，及大肠杆菌JM109，BL21(DE3) 由本室保存。
RNA提取试剂盒及Ni-NTA亲和层析柱购于 Qiagen公司，超滤管购于Millipore 公司。
Tag DNA聚合酶，T4DNA连接酶及限制性内切酶均购于TAKARA公司，DNA回收试剂盒为Omega公司产品，肠激酶为 Invitrogen 公司产品。
1.2Cecropin D 基因的扩增根据GenBank上登录的CD全长cDNA序列，利用引物设计软件Prime5.0设计调取CD基因全长序列的引物：上游引物(5’-A TGAAA TTCTCGAAAAT TTTCGTT-3’) 下游引物(5’-TCCTTGTCCGAGAGC TTTTGC-3’)。
ＰＡＰ的内化，提高其抗病毒效果。
由于编码ＰＴＤ的１０个氨基酸的核苷酸序列仅为３０ｂｐ，本实验采用在引物中直接引入该编码序列的方法实现ＰＴＤ与ＰＡＰ的基因重组。
同时引入在两个引物（Ｐ１和ＩＣ。
２）中分别构建原核大肠杆菌表达中所需的ＢａｍＨＩ和ＰｓｔＩ酶切位点。
具体步骤详见图１。
ＰＴＤ－ｐｒｉｍｅ吖ＣＧ曼昼盘里￡９＿岫ＨＤＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＡＴｅＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧ）ＰＴｎＰＡＰ图１．ＰＴＤ－ＰＡＰ的合成模式图通过ＰＣＲ扩增，用ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ加Ａ后电泳得到了约８００ｂｐ的扩增片段。
回收后的片段与ｐＰＧＥＭ－ＴＶｅｃｔｏｒ连接。
转入大肠杆菌ＤＨ５Ｑ中，经蓝白筛选，选取白色菌落行ＰＣＲ鉴定见可扩增出约８００ｂｐ的片段；提取ＰＣＲ阳性菌株的质粒，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切，电泳示可约８００ｂｐ和３Ｋｂ处两条条带（见图２）。
株的质粒，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切，电泳示可约１Ｋｂ和３Ｋｂ处两条条带（图４）。
图４ｐＰＧＥＭ—ＴＶｅｃｔｏｒ／ＴＡＴ－ＰＡＰ重组体酶切图示：１．分子量标准为ＢＬ２０００：２．酶切片段。
图中可见酶切下略大于１Ｋｂ片段，相当于Ｔａｔ加上ＰＡＰ序列的大小，支持二者重组成功。
将酶切鉴定阳性菌株质粒测序示ｒＩ钒序列和ＰＡＰ序列正确连入ｐＰＧＥＭ．ＴＶｅｃｔｏｒ中。
１．３．２Ｔａｔ与ＰＡＰ的基因重组体中Ｔａｔ显性负突变体的构建前期的工作共获得的ＨＩＶ的Ｔａｔ显性负突变体共六个：ｐＭｌ：Ｃｙｓ２２＋Ｇｌｙ；ｐＭ２：Ｈｉｓ３３／Ｃｙｓ３４一Ａｌａ／Ｓｅｒ；ｐＭ３：Ｔｈｒ４０／Ｌｙｓ４１一Ａｌ矶～ｌａ；ｐＭ４：Ｌｙｓ５０一ＳＴＯＰ；ｐＭ５：Ａｒ９５２一Ｌｅｕ；ｐＭ６：Ｔｈｒ４０／Ｌｙｓ４１／Ｃｙｓ５０一Ａｌａ／Ａｌａ／ＳＴＯＰ。
之后验证了突变Ｔａｔ对ＨＩＶ－１Ｔａｔ活性的影响：结果说明不同Ｔａｔ突变蛋白都对正常Ｔａｔ有一定程度的抑制作用，其中以ｐＭ５最大，达８５％，另外ｐＭ３可达４０％。
慢病毒载体PLKO．1-shHIF-2α的构建及鉴定刘鹏飞;崔春萍;门同义【摘要】目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的干涉缺氧诱导因子（HIF）-2α表达的慢病毒载体，并对所得产物进行鉴定。
方法体外合成的单链HIF-2α干涉片段经过退火后形成的双链片段和以质粒 PCDH为模板扩增出的EF1-EGFP 均与PLKO．1-puro连接，形成重组的慢病毒载体质粒PLKO．1-shHIF-2α，后者与pMD2G，pSAX2共转染293 FT细胞中进行包装，产生重组慢病毒颗粒。
用其感染786-0细胞，检测细胞中GFP表达情况。
结果成功扩增出干涉HIF-2α片段和EF1-EGFP片段，酶切鉴定及测序均证实PLKO．1-shHIF-2α质粒构建成功。
转染293FT细胞产生的重组慢病毒颗粒感染786-0细胞后高表达绿色荧光。
结论成功构建了高效的带GFP报告基因并稳定干涉HIF-2α表达的慢病毒载体。
【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2014(000)014【总页数】3页(P32-34)【关键词】肾细胞癌;缺氧诱导因子-2α;绿色荧光蛋白;RNA干扰【作者】刘鹏飞;崔春萍;门同义【作者单位】山东省医学科学院，济南250021; 济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院;军事医学科学院放射与辐射医学研究所;山东省千佛山医院【正文语种】中文【中图分类】Q291近20年来肾细胞癌的发病率和病死率不断升高［1，2］，已经成为男性中第 7、女性中第 8 位的常见癌症。
研究证实，缺氧诱导因子(HIF)在肾癌的发生中起重要作用，其作为转录因子参与血管生成、肿瘤细胞的增殖、细胞的迁移等过程［3］。
HIF由一个α 亚基(HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α)和一个β 亚基组成。
β亚基作为结构单位稳定存在，而α亚基作为功能单位很不稳定，只有在低氧环境中存在;最近的研究表明HIF-2α在肾细胞癌的致癌中起重要作用。
为研究HIF-2α表达对下游靶基因、细胞生物学特征和致癌能力的影响，我们构建了带绿色荧光蛋白(GFP)并稳定干涉 HIF-2α的 PLKO.1-shHIF-2α的慢病毒载体，并对所得产物进行了鉴定。
中山大学硕士学位论文
ｙ７６７１６１２
ＨＳＶ－２糖蛋白Ｄ与ｈｌＬ．２ｅＤＮＡ融合基因表达产物的纯化及重组杆状病毒表达载体的构建
专业：皮肤病与性病学
学位申请人：李海翩导师：韩建德副教授
答辩委员会委员（签名）：揣御女教授
委员教授
教授教授教授
本课题由以下基金资助：省科技计划重点项目基金（编号：２００２Ｃ３１２０３）２００５年５月２５目・广州基Ｓ盥擅量自坠生ｈｉ垒：２￡丛△融金基固蠹达主垫的缝丝盈重组拄遮瘗垂鑫达螫签盟控建ＨＳＶ－２糖蛋白Ｄ与ｈＩＬ．２ｃＤＮＡ融合基因表达产物的纯化及重组杆状病毒表达载体的构建
专业：皮肤病与性病学硕士生：李海翩指导教师：韩建德副教授
摘要背景与目的生殖器疱疹（ＧＨ）是最常见的性传播疾病之一，近年来发病率不断上升。ＨＳＶ－２仍是ＧＨ的主要病原体，具有建立潜伏感染、复发、无症状排毒等生物学特性，目前尚无有效药物可以预防及根治，因此疫苗的研制是防治生殖器疱疹的重要措施。传统形式的减毒活疫苗、复制受限疫苗等，基本保留了病毒的完整成分，可以建立特异性的体液和细胞免疫，但安全性及副作用等问题限制了其发展。重组亚单位疫苗相比之下更安全，与免疫佐剂联合可以普遍提高疫苗的免疫应答水平。单纯疱疹病毒体中有１０种包膜糖蛋白，其中糖蛋白Ｄ（ｇＤ）在病毒吸附、穿入、复制及细胞融合等过程中发挥重要作用，可以诱导高滴度中和抗体和ＡＤＣＣ，是目前研制亚单位疫苗的最佳候选蛋白。为了方便基因工程下游技术的操作，多数作者只节选ｇＤ全基因的一部分构建重组体，生产亚单位疫苗。应用ｇＤ２全基因构建疫苗，最大的利处在于不会破坏ｇＤ２的空间构型，避免破坏非连续性抗原决定簇，保证其免疫完整性。ＩＬ．２是免疫佐剂大家族的一员，来源于ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞，诱导ＣＭＩ的效果明显，是一种理想的病毒疫苗佐剂。针对目前普遍存在的疫苗免疫效率低下，ＨＳＶ潜伏、复发等问题，我们提出连接ｇＤ２全基因与ｈＩＬ．２的ｃＤＮＡ片段为融合基因，克隆后共表达融合蛋白，作为免疫原的设想。ＨＳ选蓥堑自Ｑ皇ｈｌ量二２§隧△融盒基固麦达主扬毂红也厦重组拄达瘤盔壶盗戴馇鼓捣建ｇＤ２全基因与ｈｔＬ一２基因的联合，了下游表达、纯化技术的难度。另外，分子量大、蛋白质结构复杂，无疑加大若以治疗为目的，则要求疫苗必须以可溶的活性形式表达。分子生物学技术的飞速发展，为我们提供了满足上述要求的技术保证。目前，ＨＳＶｇＤ２－ｈＩＬ－２的融合基因已成功拼接并克隆完毕。
本研究的目的：在前阶段工作的基础上，以原核表达系统为主，优化表达体系及表达条件，用亲和层析的方法，纯化出可溶形式的目的蛋白。尝试构建杆状病毒表达载体（ＢＡＣ—ＴＯ．ＢＡＣ），期望获得溶解性更好、活性更接近于天然状态的目标蛋白质，为下一步的动物免疫工作提供有活性的免疫原。材料与方法１．构建重组表达载体依据融合基因９０２一ｈＩＬ一２全长序列，保留ｇＤ２基因的信号肽，设计一对特异性引物，ＰＣＲ法扩增目的基因。双酶切扩增片段和表达载体，酶切产物连接，连接产物转化入克隆菌株，筛选阳性克隆，抽提质粒，ＰＣＲ、双酶切和测序鉴定，应用电脑软件，分析融合基因。２．目的蛋白的表达与优化重组表达质粒转化入工程菌，随机挑选克隆，扩大培养，诱导表达，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｃｍｂｌｏｔ法检测。阳性克隆菌株扩大培养，ＩＰＴＧ诱导，对细胞各组分进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析，判断可溶性。改变温度、ＩＰＴＧ浓度．不同条件下诱导目的蛋白表达．对胞质可溶组分进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，摸索最佳表达条件。３．目标蛋白质纯化将单个转化菌扩大培养，以最佳条件诱导表达，收集菌体，超声波裂解，收集上清液。选用Ｈｉｓ．Ｂｉｎｄ亲和纯化试剂盒，经结合、漂洗和洗脱等步骤，分离融合蛋白，用特异性蛋白酶将标签切掉，得到纯化的目的蛋白。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ法检测纯化效果。标定最终体积、浓度，保存目的蛋白备用。４．重组秆状病毒表达载体的构建双酶切原核重组体和杆状病毒供体质粒，将融合基因亚克隆入供体质粒，连接产物转化感受态细胞，抽提质粒．双酶切和ＰＣＲ法鉴定，转化重组供体质粒至ＤＨＩＯＢＡｃ．感受态细胞（包含杆粒及辅助质粒），蓝白斑筛选，靶序列自
ＩＩＨＳ坠２揸蛋自Ｑ皇ｈＩＬ：２￡立△丛融盒基因麦丛芒扬的鲤业盈重组拄监瘟壹重达戴馇啦掏建动转位至ＢＡＣＭＩＤ（杆状病毒表达载体），扩大培养阳性克隆，碱裂解法提取ＢＡＣＭＩＤＤＮＡ，ＰＣＲ鉴定。
结果１．重组表达载体的鉴定应用ＰＣＲ的方法，成功扩增出大量的目的基因片段，电泳检测结果与理论预测值相符。重组质粒ＰＣＲ和双酶切鉴定结果也与理论值一致，表明目的基因已成功插入表达载体中。重组体ＤＮＡ测序显示外源基因按设计的接头恰当连接，以正确的读码框架插入载体中，融合基因序列与原测序报告完全一致，末发现碱基增失和突变。２．蛋白质鉴定和最佳表达条件以ＳＤＳ．ＰＡＧＥ法检测表达结果，在预期位置显示出特异条带，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定该条带能与专用抗体特异结合，表明目的基因己成功表达，并具有抗原性。细胞各组分的分析结果显示：目的蛋白主要以包涵体形式表达；细胞质可溶组分可检测到微弱的特异条带，表明仍有部分目的蛋白是可溶的。适当ＩＰＴＧ浓度时，目的蛋白表达量最多，在此基础上升高浓度则外源蛋白的表达并不随之增加；高温下诱导，胞质可溶组分ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳检测不到特异条带，而低温长时间诱导，可检测到异源表达带。上述结果表明：适当ＩＰＴＧ浓度、低温、长时间条件下胞质可溶目的蛋白产量最大。３．纯化目标蛋白的鉴定扩大培养，细菌裂解后，上清液的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析，可观察到特异条带，表明具备继续纯化的条件。纯化蛋白产物的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ检测可观察到一条清晰的特异条带，表明目的蛋白已有效分离，并具有抗原性。４．重组杆状病毒表达载体的鉴定运用双酶切和ＰＣＲ法鉴定杆状病毒供体质粒，结果与理论预测值相符，表明目的基因已成功插入供体质粒中。供体质粒转化后的平板上可见到蓝白斑随机分布，ＰＣＲ法鉴定重组ＢＡＣＭＩＤＤＮＡ，可见到与预期大小一致的特异条带，表明目的基因己成功克隆入杆状病毒载体。结论Ｉ．扩大培养过程中，ｇＤ２．ＭＬ２融合蛋白对细胞存在毒性，妨碍细胞生长，采ＩｌＩ珏Ｓ坠２棱誊自旦量丛ｋ：２￡ＱＨ△融盒基固鑫丛亡物殴缝化盈重组拄拭瘟垂蠢达载娃曲掏建取严格控制细胞本底表达的方法，能够确保质粒的稳定性。２．融合基因ｇＤ２一ｈｌＬ－２以包涵体和可溶状态两种形式表达。胞内可溶蛋白表达的最佳诱导条件为低温、长时间。３．相比之下，利用Ｈｉｓ—ｔａｇ融合标签抗体检测目的蛋白的效果没有目的蛋白专用抗体特异性高，但是利用Ｈｉｓ－ｔａｇ融合标签却可以高效地、快速地纯化出目的蛋白。４．应用杆状病毒表达系统，可以高效获得重组杆状病毒表达载体的构建。Ｓ．本实验证明：利用原核表达系统，构建ｇＤ２坷Ｌ．２融合基因重组体，表达目的蛋白的设想是可行的，通过诱导条件的优化可以获得可溶形式的蛋白。关键词：单纯疱疹病毒，糖蛋白Ｄ，人白细胞介素２，亲和层析，杆状病毒表达系统ＨＳ坠２揸蛋自旦量蜒Ｌ：２￡凶△融佥基固盘姿主物的缍他厦重组拄拈疽噩蠢达戴佳的掏建ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｕｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎｉｎＥ．ｃｏｌｉａｎｄＣｌｏｎｉｎｇｉｎ
ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｏｆＨＳＶ－２ＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＤ－ｈｌＬ一２ｃＤＮＡｇｅｎｅ
Ｍａｊｏｒ：ＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ：ＬｉＨａｉｐｉａｎ
Ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＨａｎＪｉａｎｄｅ
ＡＢＳＴＲＡＣＴＢａｅｋｇｒｏｕｎｄａｎｄＰｕｒｐｏｓｅ
Ｏｅｍｔａｌｈｅｒｐｅｓ（ＧＨ）ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｌｎｏｎｓｅｘｕａｌｌｙｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ
ｄｉｓｅａｓｅｓ．
ａｎｄｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｈａｓｂｅｇｕｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．ＨＳＶ－２ｉｓｓｔｉｌｌｔｈｅｍａｉｎ
ｐａｔｈｏｇｅｎ，ａｎｄｈａｓｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｓｕｃｈａｓｌａｔｅｎｃｙ，ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｒｅｌｅａｓｉｎｇｖｉｒｕｓｗｉｔｈｏｕｔｓｙｍｐｔｏｍｓｅｔｃ．Ｕｎｔｉｌｎｏｗ，ｗｅｓｔｉｌｌｈａｖｅｎｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌＧＨ，ＳＯｉｔｓｖａｃｃｉｎｅｗｉｌｌｂｅｃｏｍｅ
ｔｈｅ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ
ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌａｔｔｅｎｕａｔｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅａｎｄ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｅ．ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ
ｖａｃｃｉｎｅｃｔｃ，ｗｈｉｃｈｃａｒｌｂａｓｉｃａｌｌｙ
ｐｒｅｓｅｒｖｅｔｈｅｖｉｒｕｓｉｎｔｅｇｒｉｔｙ，Ｃａｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｈｕｍｏｒａｌａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｈｏｗｅｖｅｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｍｉｓｌｉｍｉｔｅｄｂｙｔｈｅ
ｐｒｏｂｌｅｍｓｓｕｃｈａｓｓｅｃｕｒｉｔｙａｎｄｓｉｄｅｅｆｆｅｃｔｓ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅｉｓｍｏｒｅ
ｓａｆｅ，ｉｆｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｉｍｍｕｎｅａｄｊｕｖａｎｔ，ｗｈｉｃｈｃａｌｌｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ
ｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆ
ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ．
Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｈａｓｔｅｎｅｎｖｅｌｏｐｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈ，Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ
Ｄ（ｇＤ）ｔａｋｅｓｇｒｅａｔｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ、ｅｎｔｒａｎｃｅ、ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄｆｕｓｉｏｎ．Ｉｎｖｉｖｏ，ｇＤＣａｎｉｎｄｕｃｅｈｉ．ｇｈｔｉｔｅｒｏｆｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ
ａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄＡＤＣＣ，
ＳＯｉｔｉｓｏｆｔｅｎｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｓｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅｒｅｓｅａｒｃｈ．
Ｍｏｓｔｏｆｓｃｈｏｌａｒｓｃｈｏｓｅａｓｅｇｍｅｎｔｏｕｔｏｆｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｅｔｏ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｓｗｈｉｃｈｙｉｅｌｄｅｄｓｕｂｕｎｉｔ—ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｕｒｓｕｅｔｈｅ
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