第三章细胞免疫功能测定
第一节淋巴细胞计数和亚群测定
淋巴细胞各亚群细胞的膜表面均具有可供鉴别的特殊结构，即表面标志。
应用化学方法可检测淋巴细胞在不同发育阶段所含酶种类及含量的差异。
检测外周血中各类淋巴细胞及其亚群的数量，这对了解机体的免疫功能状态，研究某些疾病发病机制及辅助临床诊断具有一定的意义。
（一） E花结试验
人类T细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，称E受体。
该受体在体外与SRBC结合，从而形成玫瑰花结样细胞团，可用来计数T细胞。
1、试验方法：
外周血淋巴细胞：2×106／m1
SRBC：2×108／m1
各取0.1m1在试管中混匀，置37℃水浴温育5min，1000r／min离心5min，4℃冰箱放置2h后取出。
轻轻吸去大部分上清，旋转试管使细胞重悬，取一滴细胞悬液于载玻片上，甲苯胺蓝染色后镜检，结合3个以上SRBC的淋巴细胞为E花结形成细胞，即T细胞。
计数200个淋巴细胞后计算T细胞的百分率。
2、正常参考值：60％一80％
3、意义：有助于细胞免疫缺陷性疾病的诊断和疗效观察，有助于对恶性肿瘤、严重病毒或真菌感染、活动期自身免疫疾病患者的疗效观察和预后判断。
（二）活性E(Ea)花结试验
部分T淋巴细胞与较低比例SRBC混合，经低速离心沉淀后，需在低温共同培育，即能迅速形成E花结，故称为活性E花结形成细胞。
现认为此类细胞对SRBC具有高度亲和力的T细胞亚群，它能更敏感地反映细胞免疫的水平和动态的变化。
1、试验方法：同E花结试验基本相同，只是省去4℃冰箱放置2h一步。
2、正常参考值：15％一20％
3、意义：临床上用于评价癌症、免疫缺陷病、迟发型变态反应、某些感染和组织器官移植时人体细胞免疫状况以及判断预后，并用于考核药物疗效，研究药物作用机制等。
（三）稳定性E花结试验
在E花结试验中，如将形成的E花结在37℃放置30min，绝大多数会快速解离，但有极少数振荡后仍不解离，称为稳定性E花结(Es花结)。
1、试验方法：按E花结试验操作形成E花结后，在37℃放置30min，计数Es花结形率。
2、正常参考值：1.5％一5.1％
3、意义：Es花结的形成，是T细胞被激活的结果，是活化T细胞的一个标志，可反映T细胞的功能，有助于了解细胞免疫的状态，在慢性活动性肝炎、急性淋巴细胞血病、淋巴瘤、肝癌、妇科肿瘤等疾病中可显著升高。
（四）29℃E花结试验
E花结试验的结果与温度密切相关，据实验推测，29℃条件下，某疾病患者T细胞SRBC受体密度、亲和力有所改变，从而提出29℃E花结试验。
据实验推测，29℃条件下，某疾病患者T细胞SRBC受体密度、亲和力有所改变，从而提出29℃E花结试
验。
1、试验方法：淋巴细胞与SRBC混合后，离心，在29℃中共温1h，同上计数花结形成率
2、正常参考值：49％一59％
3、意义：在恶性肿瘤、系统性红斑狼疮、病毒感染、肝炎、心肌梗死等患者中29℃E花环形成率可明显降低。
（五）EA花结试验
B细胞：
EA花结： Fc受体
EAC花结： C3b受体
检测外周血B细胞的百分率。
（ EA花结为例）
1、试验方法：取1%鸡或羊红细胞悬液，加等容积的抗血清混合，置37℃水浴温育30min，不时摇动， Hanks液洗涤3次，除去未结合的抗体，配成1%（致敏RBC 2×108／m1）的EA悬液。
取0.1ml淋巴细胞悬液与等量的EA悬液混合，置37℃水浴温育30min， 500r／min离心5min，以下同E花结试验。
（2）正常参考值：10%-19%
（3）意义：慢性淋巴细胞白血病时可升高，免疫缺陷时降低。
（二）B细胞膜表面 Ig(SmIg)测定：免疫荧光法测定SmIg
（1）试验方法：取0.2ml 1-2×105／m1的外周血淋巴细胞，200r／min离心5min，弃上清，加入50ml抗人免疫球蛋白荧光抗体，40℃反应60 min ，用含1%的BSA 的PBS洗涤3次，弃上清，制片，荧光显微镜检查。
细胞周边出现线状荧光的淋巴细胞为SmIg细胞，即B淋巴细胞，计算B细胞百分率。
（2）正常值：16%-20%
IgG: 4.0%-12.7%;
IgA: 1.0%-4.3%;
IgM: 6.7%-13.0%
（3）意义：同上
（三）淋巴细胞亚群检测
T细胞亚群：
Tc: 杀伤性T细胞
Ts：抑制性 T细胞
TDTH: 迟发型超敏反应性T细胞
1、试验方法：
（1）取5×106／m1的外周血单个核细胞悬液；
（2）取0.1ml细胞悬液与0.1ml 相应的CD McAb工作液混合， 4℃静置45 min，洗涤3次，弃上清；
（3）加入最适浓度的荧光二抗0.1ml ，混匀， 4℃反应30 min，洗涤3次， 1200r ／min离心5min，弃上清，细胞重悬；
（4）制片，荧光显微镜检查。
阳性百分率。
2、正常值：CD3+:65%-78% CD4+: 40%-50%
CD8+: 22%-33% CD4+/ CD8+:1.3-2.0
3、意义：传染性单核细胞增多症时CD8+可明显升高，免疫缺陷时CD4+/ CD8+降低。
第二节淋巴细胞功能检测法：淋巴细胞转化试验
1、形态学方法
方法：细胞悬液+适量PHA，培养3-5天，离心去上清，取沉淀重悬，滴片，Giemsa 染色，油镜观察计算转化率。
结果判定：染色体形成型；母细胞型；过度型；
正常为：50%-74%
2. 3H-TdR渗入法
细胞转化程度与染色体复制成正比，即与DNA 合成， 3H-TdR渗入量成正比，可用脉冲数（cpm）测量。
方法：细胞悬液加一定量的PHA培养，培养后期加入3H-TdR。
结果判定：
绝对值=（测定管cpm-本底cpm） 1 104/每毫升淋巴细胞数
刺激指数（SI）=试验组cpm 均值/对照组cpm 均值
SI>=2为阳性
第三节细胞因子的检测
一、生物学活性检测法
生物学检测法一般敏感性较低，直接表示待测标本中的活性水平。
缺点：实验周期较长；易受细胞培养中某些因素的影响，如血清、pH、药物；易受生物学活性相同、相近的其他细胞因子的影响，如检测IL-2时可受IL-4的干扰；易受待检样品中某些细胞因子抑制物的干扰，如IL-1的活性可被IL—1受体拮抗物所抑制；不能区分某些细胞因子的型和亚型某些指示细胞长期培养易发生突变,不同指示细胞对同一种细胞因子的敏感性不同，所获结果难于标准化。
生物学检测的方法大致可分为增殖或增殖抑制、集落形成、直接杀伤靶细胞、保护靶细胞免受病毒攻击、趋化作用以及抗体形成法等几类。
(一)增殖或增殖抑制法
其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些指示细胞的增殖，经过H—TdR掺人或MTT法显色，反映待检细胞因子的活性水平。
(二)集落形成法
其基本原理是应用骨髓干细胞／祖细胞体外半固体培养系统，根据不同造血因子和集落刺激因子(CSF)能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种或某些种类细胞的集落，通过对形成集落形态学、酶学鉴定，计算不同种类集落形成的数量和比例，反映待测标本中CSF的种类和活性水平。
(三)直接杀伤靶细胞
在细胞因子中TNF-a、LT具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株作为指示细胞，通过3H-TdR释放法或染料染色法等可检测待检样品中TNF的活性水平。
(四)保护靶细胞免受病毒的攻击
靶细胞受某些病毒感染后发生明显病变和死亡，干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击，常用的病毒是水疱性口炎病毒，敏感的指示细胞为喉癌的上皮细胞株H叩—2和羊膜的上皮细胞，通过干扰素抑制病毒致病变的程度，算出待测样品中IFN的活
性单位。
(五)趋化作用
如IL—8对多形核细胞、淋巴细胞具有趋化作用，可用小室法或软琼脂趋化法，以PMN或淋巴细胞作为指示细胞，通过细胞趋化的程度来反映样品中IL-8活性水平。
(六)抗体形成法
IL-6可在体外刺激某些B淋巴细胞系产生和分泌免疫球蛋白，常用的指示细胞有分泌IgG的ARH—77和CESS等。
在一定的条件下，待检样中IL-6的水平与培养细胞上清IgG或IgM水平正相关，通过标准IL—6的对照可推出待检样品中IL—6的活性。
二、免疫学检测法
优点：实验周期短；少受抑制物或相似生物学功能因子的干扰；如高特异性抗体可区分不同型或亚型的细胞因子(如IFN)；一次能检测大量标记，易标准化。
缺点：敏感性高，所得结果不能直接表示生物学活性。
细胞因子免疫学检测的方法多采用酶联免疫吸附试验和放射免疫测定(RIA)。
三、核酸标记技术检测法
应用分子生物学技术，如核酸标记、RT—PCR等可对细胞因子或细胞因子受体在核酸水平上进行检测。
RPA是一种高度敏感、特异定量检测一种或多种细胞因子mRNA 的方法。
RPA主要优点是敏感特异，而且可在一份样品的总RNA中同时检测多细胞因子mRNA，便于比较研究。
