基因工程考试复习

2012级《基因工程》考试复习

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一

基因工程是指将一种或多种生物体 (供体) 的基因或基因组提取出来, 或者人工合成的基因, 按照人们的愿望, 进行严密的设计, 经过体外加工重组, 通过一定的方法, 转移到另一种生物体 (受体) 的细胞内, 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术.

基因工程 是指在体外将目的基因插入病毒、质粒或者其他载体分子中、构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原来没有这些基因的寄主细胞内，且能稳定的遗传。

基因工程三要素：供体 受体 载体

基因工程的操作步骤：切→接→转→检

基因工程研究的内容：

基因的分离与克隆 转化体的筛选 [书本]:（GE克隆载体的研究

载体的选择与构建 外源基因整合和表达的检测 GE受体系统的研究

基因转化受体系统的建立 外源基因在细胞中的表达调控 目的基因的研究

基因转化技术 外源基因的遗传 GE工具酶的研究

GE新技术的的研究）

基因工程诞生的理论基础及技术基础

1)理论基础

20世纪40年代，确定了遗传信息的携带者是DNA而不是pro,从而明确了遗传物质的基础问题。 50年代，DNA双链和DNA结构的双螺旋模型和DNA半保留复制机理解答了DNA的自我复制和遗传信息传递问题。

50年代末和60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了基因遗传信息的流向和表达方式。

2）技术基础

限制性核酸内切酶的发现

DNA连接酶的发现

GE载体的发现

转化（导入）方法

基因表达

6如何正确看待基因工程(正反两方面）

虽然GE解决了生产生活中的一些问题，如：

①红色GE:指的是医疗部门的GE，涉及的基因改造的细菌产生的基因药物如胰岛素。

②白色GE:包括环境微生物学，环境技术和其他技术或工业应用。

③绿色GE:在农业上的应用，用在作物育种的主要重点是植物的不敏感的害虫和疾病。

但是基因工程的安全性引起了强烈的关注和质疑：

问题1用于筛选的标记基因或报告基因是否会对人畜有害，同时导致病原菌抗药性的提高。问题2抗除草剂基因会不会使转基因植物变成不可控制的杂草，或漂移到杂草上使杂草泛滥。

问题3外源基因插入的位置效应是否会引起有害的沉默基因的表达。

问题4转基因动物是否会演变成对人类有极大威胁的新物种。

问题5基因治疗是否对人体的正常功能产生不良影响。

二

DNA提取（基因组，质粒DNA，噬菌体）

原核基因组DNA提取方法：苯酚氯仿抽提法。

植物组织中DNA 的提取CTAB的 作用 :

CTAB[十六烷基三甲基溴化铵]是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液[0.7mol/LNaCl]中是可溶的，当降低盐溶液的浓度到一定程度[0.3mol/LNaCl]时从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与合算的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。

动物组织中DNA 的提取SDS的 作用 :

溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；

溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；

对RNase、Dnase有一定的抑制作用； SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。

载样缓冲液的作用①增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.

质粒DNA提取的两种方法：氯化铯密度梯度离心法,利用碱变性法提取质粒DNA方法及原理）p91

氯化铯-EtBr密度梯度离心法是根据“在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子质量的细菌染色体DNA易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子质量较小、结构紧密，仍能保持完整的状态”这种差别建立的纯化质粒DNA的技术。

原理：当将含有溴化乙锭EtBr的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合大量的EtBr分子，直至达到饱和（每个碱基对大约结合一个溴化乙锭分子）。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子，由于在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入，EtBr分子的结合数量相对较少。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯中的浮力密度也有所不同。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越来越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同位置。取出DNA，用异丙醇抽提溴化乙锭，再用缓冲液透析除去残余氯化铯，最后用两倍体积冷乙醇沉淀，就得到了纯化的质粒DNA。

碱变性法提取质粒DNA方法及原理

碱变性法提取质粒DNA方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH12.0~12.5时，线性的DNA会完全变性分开，甚至出现断裂；而共价闭合环状质粒DNA虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开。通过冷却或恢复中性pH使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，在离心时，大部分主染色体与细胞碎片、杂质等缠绕在一起被沉淀，通过离心即可除去线性染色体，而可溶性的cccDNA留在上清液中，将含有cccDNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。

DNA样品浓度的测定方法

a,在琼脂凝胶上用荧光染料进行标准比对。

b，利用分光光度计测吸收值。A260.

DNA Concentration（浓度） Measurement

Comparison with a standard using a fluorescing dye （荧光染料）on an agarose-gel琼脂糖胶凝 .

Using absorption of DNA in a UV-spectrophotometer分光光度计

DNA纯度的测定

DNA在260纳米处有最大吸收峰，但蛋白质核酸的主要污染源在280nm处有最大吸收峰，A260/A280适合纯度测定。

纯DNA=A260/A280=1.8

纯RNA=A260/A280=2.0

低于1.8含苯酚或蛋白质，高于1.8含RNA和单核苷酸。

DNA纯化的方法：

a 氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法（CsCl-EB）适合纯化大剂量DNA。

b 阴离子交换层析法

c 琼脂糖凝胶电泳洗脱法，适合小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收纯化。

d 基因纯试剂盒

核酸杂交类型：

A转移印迹

southren杂交：检测DNA

Northren杂交：检测RNA

Western杂交：检测蛋白质

B 点印迹、狭缝印迹[dot blotting /slot blotting ]

C 原位杂交[in situ hybridization]

质粒特性：

1什么叫质粒

一类存在于细菌或真核细胞中，独立于染色体之外能自主复制的裸露的双连环状（少数为线状和RNA）DNA分子，是与细菌或真核细胞共生的遗传成分。

2质粒的构型，及不同构型的大小迁移顺序

绝大多数质粒是环状双链，其分子具有3种不同的构型：

1）当其两条多核苷酸链均保持着完整的环状构型时，成为共价闭合环形DNA，即cccDNA。这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型。

2）如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环状结构，另一条出现一至数个缺口时，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型。

3）若质粒DNA经过适当的限制酶切割后，发生双链断裂而成线性分子（L-DNA)，通称L构型。

在正常的电泳条件下，不同构型的质粒DNA，尽管分子质量相同，但是仍然具有不同的电 泳迁移率，其大小顺序为：cccDNA(scDNA)>L-DNA(线性DNA）>OC-DNA>D-DNA(二聚体DNA）>T-DNA（三聚体DNA）。

经过合适的限制酶处理后所有结构的DNA都转化为线性分子。

3质粒的大小差异大，最小的不到1kb,最大的甚至超过500kb。

4宿主细胞在标准培养条件下，一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。

5理论上讲，几乎所有的细菌都含有质粒。

几乎所有的质粒都会带有一个至多个基因，而这些基因的表达常常赋予细胞有用的特性。

6质粒DNA都含DNA的复制起始点，这使得质粒可在宿主细胞中独立复制，分子质量小一点的DNA可利用宿主细胞中的DNA复制酶来进行自身的DNA复制；分子质量大一点的DNA本身含有DNA复制时所用酶的基因，质粒DNA复制时所用的DNA复制酶是自身DNA基因表达的产物，还有一些质粒DNA能将自身的DNA插入到寄主细胞染色体上，随寄主染色体复制而复制。

常用电泳缓冲液种类及特点

TAE 50×

242gTris

57.1ml冰乙酸

100ml0.5mol/L EDTA(pH8.0) 双链DNA分子的泳动速率比另两者快10%，超螺旋在其中电泳时更符合实际分子质量，回收DNA片段时首选，大片段分离效果好，缓冲容量小，过夜电泳不可选用。

TBE 5×

54gTris

27.5硼酸

20mol0.5mol/L EDTA pH8.0

小片段（＜1kb）分离效果好，回收率差，不宜用于回收电泳。缓冲容量大，过夜电泳适合

TPE 10×

108gTris

15.5ml磷酸（85%，1.679g/ml)

40ml 0.5mol/L EDTA pH8.0 磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀，也不适合回收电泳，缓冲容量大，过夜电泳适合

电泳缓冲液组成及其作用

类型 6×缓冲液 储存温度

I 0.25%溴酚蓝

4℃ 0.25%二甲苯氰FF

40%蔗糖水溶液

II 0.25%溴酚蓝 室温

0.25%二甲苯氰FF

15%聚蔗糖水溶液

III 0.25%溴酚蓝 4℃

0.25%二甲苯氰FF

30%甘油水溶液

作用：

增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔中；

在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳速度和位置；