基因工程复习资料

基因工程复习指导

第一章 绪论

1、基因：就是存在于DNA上承载遗传信息的核苷酸序列，是位于染色体上呈直线排列的遗传物质的最小单位，也是携带遗传信息的结构单位和控制遗传性状的功能单位。

2、基因工程：又称重组DNA技术，分子水平进行遗传操作，将任何生物体（供体）的基因或基因组提出来，或通过人工合成的目的基因，按照先设置好的蓝图，插入质粒或病毒复制子（载体），而形成一杂合分子（DNA重组体），然后将重组体转移到复制子所属的宿主生物体复制，或转移到另一生物体（受体）的细胞内（原核或真核），使之在受体细胞内遗传并使受体细胞获得新的性状。

3、基因工程的三要素：供体、载体、受体

4、基因工程的基本流程：

（1）DNA的制备包括从供体生物的基因组分离或人工合成，以获得带有目的基因的DNA片段。

（2）在体外通过限制性核酸内切酶分别分离得到的外源DNA和载体分子进行定点切割，使之片段化或线性化

（3）在体外将含有外源基因的不同来源的DNA片段通过DNA连接酶到载体分子上，构建重组DNA分子。

（4）将重组DNA分子通过一定的方法引入到受体细胞进行扩增和表达，从培养细胞中获得大量细胞繁殖群体。

（5）筛选和鉴定转化细胞，剔除非必需重组体，获得引入的外源基因稳定高效表达的基因工程菌或细胞，即将所需要的阳性克隆挑选出来。

（6）将选出的细胞克隆的基因进一步分研究，并设法使之实现功能蛋白的表达。

第三章 基因工程工具酶

1、基因工程中常用的工具酶：限制酶、连接酶、聚合酶、修饰酶

2、细菌的限制—修饰系统（简称R—M体系）：细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统

R-M体系说明的问题和作用：R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。

个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。

1 基因工程复习资料

一．基因工程：在体外对不同生物的遗传物质进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（质粒、病毒、噬菌体DNA）插入微生物、植物、动物细胞内进行无性繁殖、并表达出基因产物。

二．

一）1.同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。

同裂酶的类型：

1)同序同切酶：识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ 和Hsu I。

2)同序异切酶：识别位点相同，但切点不同。如Kpn I 和 Acc65 I。

3)同功多位酶：许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。

4）其他：有些限制酶识别的序列交叉。

2 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。

3. 限制性内切酶的命名：

1）用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。

2. ）用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。

3） 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I。

EcoR I: E, 属名的第一个字母; co种名的头两个字母;R, 菌株或型号; I,序号；Eco为斜体，R为正体。

4.限制性内切酶产生的末端：

1）产生匹配黏端：即黏性末端，识别位点为回文对称结构的序列经限制性内切酶切割后产生的末端。

2）产生平末端：回文对称轴上同时切割DNA的两条链。

3）产生非对称突出末端：识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物末端是不同的。

5、 常用的DNA聚合酶的：

1.） 共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3‟—OH端。

2. ）主要区别：

（1）持续合成能力和外切酶活性不同。

（2）T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。

（3）其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。

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第一章核酸的制备

1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表

2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为

础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

第二章基因工程工具酶

1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。2.限制性内切核酸酶：

定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），

并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和

种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。

3.dna连接酶：

定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。

种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。4.dna片段的相连接方法：

①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。

②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。 ③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。5.dna聚合酶：

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一、知识点

1.根据基因工程的定义，能替代基因工程的术语。

2. 含有II型限制性内切酶切位点的DNA 片段的特点。

3.已知一双链DNA分子，分别用限制酶Ⅰ、限制酶Ⅱ切割单独切割得到不同片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到另外的片段，据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况。

4．质粒分子生物学的描述。

5．在植物基因工程中广泛使用的载体。

6．质粒带有互补的 lacZ 标记基因，那筛选培养基中加入显色底物和诱导物分别为？

7．载体常用的选择性标记：抗生素、生化标记、营养缺陷型标记的包括哪些 （要能区分缩写符号）。

8．DNA双链是靠什么化学键维持？

9．能有效区分重组子与非重组子的是方法有哪些？

10．离体cDNA 合成中所涉及的工具酶是有哪些？

11．强化基因转录的元件是哪些？

12．基因调控元件中属于负调控顺式作用元件的是哪些？

13．关于包涵体的叙述。

14. 在单子叶、双子叶植物及动物的遗传转化过程中，应用最成功的间接转化法分别是什么

15. 在对转基因植物进行分子鉴定时，检测外源基因的整合、表达、转录，分别可以采用哪些方法？

16．细菌存在限制-修饰的现象，其生理意义是什么？

17．Taq DNA 聚合酶的发现使得 PCR 技术的广泛运用成为可能，是利用其哪个特点？

18．关于柯斯质粒（cosmid）描述。

19．Cosmid、-DNA 、 Plasmid几种常用载体的装载量大小比较

20．载体质粒 pBR322上的两个选择性标记： Apr 、 Tcr。它们分别含有一个单一酶切位点： Pst I 、 Sph I。若将一外源基因插入Apr中的Pst I位点，那么转化子和重组子如何筛选，若插入Sph I又如何筛选？

21．DNA-DNA,DNA-RNA分子杂交的化学原理是什么（靠什么维持其双链稳定性）？

22．cDNA 法获得目的基因的特点表现为？