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载体双酶切技术是分子生物学领域常用的实验技术之一，它通过利用两种不同的限制性内切酶作用于同一个质粒DNA，从而实现对目标DNA片段的精确剪切和克隆。
本文将从载体双酶切技术的原理、应用和优缺点等方面进行详细介绍。
一、原理载体双酶切技术的原理主要基于两种不同的限制性内切酶对DNA的特异性切割。
首先，选择两种能够在同一质粒上切割出相互兼容的黏性末端的内切酶，并确定其最佳反应条件。
然后，将目标DNA片段与质粒进行双酶切反应，使得目标DNA片段的末端与质粒的末端具有互补的黏性末端。
最后，通过DNA连接酶的作用，将目标DNA片段与质粒连接成重组质粒，实现目标DNA片段的克隆插入。
二、应用载体双酶切技术在分子生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于重组质粒的构建，将外源基因插入到质粒中，用于基因克隆、表达和功能研究。
其次，还可以通过双酶切技术对质粒进行定向修饰，如引入点突变、插入序列或者删除特定片段等，用于研究基因的结构与功能。
此外，载体双酶切技术也被广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因组编辑等领域。
三、优缺点1. 优点（1）精准：通过双酶切技术可实现对DNA片段的精确切割和定向连接，保证了重组质粒的稳定性和可靠性。
（2）灵活：可以根据实验需要选择不同的限制性内切酶组合，实现对DNA的多样化操作。
（3）高效：相比传统的单酶切技术，载体双酶切技术能够提高DNA片段的连接效率和克隆成功率。
2. 缺点（1）操作复杂：双酶切技术需要充分考虑两种内切酶的选择、反应条件的优化及连接方法的调整，操作过程较为复杂。
（2）局限性：某些情况下可能无法找到适合的双酶切位点，导致目标DNA片段无法有效插入到质粒中。
（3）成本较高：需要购买多种限制性内切酶和连接酶，增加了实验成本。
综上所述，载体双酶切技术作为一种重要的分子生物学工具，在基因工程和分子生物学研究中发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和完善，相信它将在更多领域展现出其巨大的潜力和价值。
四、双酶切鉴定㈠双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“seq”标注。
㈡连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表■ 说明使用二种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer 之前表示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■ 注意◇1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可能。
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DNA限制性内切酶——双酶切反应时通用缓冲液的选用
■当酶切位点确定后，最好购买同一家公司生产同一类型的内切酶（若酶切Buffer相同，这样有时候可以省去后期去需找酶切反应通用缓冲液）
■说明
使用两种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer之前表示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可能。
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Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应 (Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer之前表示的 [数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可
能。
双酶切步骤
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲双酶切步骤。
你可别小瞧这双酶切，
它就像是一场精细的手术，每一步都得小心翼翼，不然可就出岔子啦！
首先呢，你得准备好你的“手术工具”，也就是各种试剂和酶啦。
这
就好比厨师要准备好食材和调料才能做出美味佳肴一样。
然后，就是要把你的 DNA 片段给找出来。
这 DNA 片段就像是一个宝贝，得好好对待它，不能让它有一点点损伤哦。
接下来，把酶和 DNA 放在一起，让它们开始“亲密接触”。
这时候
你就得像个守护天使一样，在旁边好好看着，确保一切都按计划进行。
在这个过程中，温度可很重要哦！就像人洗澡水不能太烫也不能太
冷一样，得恰到好处。
不然酶宝宝可不高兴，就不好好工作啦。
时间也是关键啊！不能太短，太短了酶切不完全；也不能太长，太
长了可能会有其他问题出现。
这就好像烤蛋糕，时间掌握不好，蛋糕
不是没熟就是烤焦了。
等酶切结束后，可不能就不管啦。
得检查检查，看看切得怎么样。
这就像是考试结束后要检查一遍试卷一样，可不能马虎。
要是切得好，那当然开心啦，就像考了个好成绩一样。
要是切得不好，也别灰心，找找原因，下次再来。
总之，双酶切步骤虽然听起来有点复杂，但只要你认真对待，就一
定能做好。
就像学骑自行车一样，一开始可能会摔倒，但多练习几次
就会啦。
所以啊，大家别怕困难，大胆去尝试吧！相信自己，一定能掌握好
双酶切步骤，在生物学的世界里畅游无阻！这双酶切啊，真的是很神
奇的一个过程，能让我们看到生命的奥秘一点点被揭开。
大家加油哦！。
③双酶切处理目的片段和带有GFP的质粒并纯化一、实验原理1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，他们的功能类似动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。
现已发现几百种限制性内切酶，他们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH，由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术上受到广泛应用。
在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。
2.DNA的酶切反应II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。
3.DNA的连接在T4 DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。
DNA连接酶的作分三步：①T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。
②酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷化③产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
二、实验器材与处理方法（参照）1、限制性内切酶酶BUFFER GFP质粒2、T4 DNA连接酶连接酶缓冲液3、电泳缓冲液（0.5×TBE或1×TAE）10×电泳加样缓冲液4、溴酚蓝琼脂糖溴化乙锭（工作浓度0.5ug/ml）EcoR I5、酚氯仿无水乙醇70%乙醇灭菌双蒸水6、1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）电泳仪电泳槽紫外检测仪摄影设备7、恒温水浴槽三、实验步骤先将步骤②扩增的目的片段进行纯化（柱层析或电泳割胶法）1.酶切反应（按情况加大反应体系）取GFP质粒（DNA）样品于合适的离心管中，按照表1加入试剂↓混匀；4000rpm离心30s,甩至管底↓37℃（限制性内切酶最适水温）,保温1~3h酶切（酶切过夜则建议用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多酶切体系各组分浓度改变过大，记得根据不同酶切位点加保护碱基）↓65℃，保温10-20min使限制性内切酶失活↓电泳(检测酶切反应结果)用紫外投射仪检测↓加入ddH2O （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）颠倒混匀，12000r离心10 min↓吸取上清，1/10体积3M NaAc，两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分钟以上↓12000g 4℃冷冻离心15分钟↓倒去上清，75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10 ml ddH2O（0.5ml tube中），质粒溶于20 ml ddH2O（1.5ml tube中）↓继续柱纯化（Wizard少量DNA 纯化系统或碱法纯化）↓-20℃保存待用表1 酶切反应成分（单位：μl）DNA样品待定酶切缓冲液待定EcoR I 待定无菌水待定总体积待定（反应体系根据酶酶切位置确定，适当增加反应试剂）注：1、可以设置3对照一个双切（最佳缓冲液），另两个分别单切，两种先后顺序(一组正常从盐浓度低的开始切) 根据结果好坏采取恰当的操作1、双酶切可以适当延长时间，比如过夜，但可能效果也不太好；2、按次序切的话，那切完第一种酶后，跑个小样看看切的如何，切好了的话，就按照提质粒的方法纯化：a、将酶切体系补到500ul，b、然后加等体积酚：氯仿抽提一次，转移上清；c、等积极氯仿抽提一次，转移上清；d、1/10体积的3M NaOAc 和2倍体积的100%乙醇沉淀0.5~1h；e、70%乙醇洗盐；g、适当无菌水溶解；h、以溶解后的回收体积再做另一种酶切反应。
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法,用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验,谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要,尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率.选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：http://img.。
..。
cn/upload/2006/08/13/31219184。
pdf。
双酶切时间及其体系:需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要,我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升.纯化问题:纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶,影响纯化效率.现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此,酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例,其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中,30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U）。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外,该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去,只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0。
03pmol，后者取0。
3pmol.pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA:（X pmoles×长度bp×650)/ 1,000，000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量)所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套。
1pmol 1000bp DNA=0。
66μg，如载体是5380bp，则0。
03pmol为0.03×5.38×0.66=0。
106524µg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1。
8-2。
0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER 每个条带约50ng。
连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为:在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA—Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时,有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U）.而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。
连接酶容易失活，注意低温操作,最好在冰上。
时间3个小时足已。
3、转化:a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后,再在冰中放置1分钟.c、加入890 μl AMP阴性培养基,37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板.也可离心后余100μl几个非常重要的问题1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时，16度.2 对含有AMP—RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55—60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度.铺板前后注意用吹风机吹干3对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照：A 酶切反应时加各单酶分别切，两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功。
做转化时,也要进行对照.设4个：A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常’的情况下.B。
酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.4。
所有的试剂切记低温保存。
一步一个脚印。
不要偷懒，图省事最后却更费事。
注意设立对照。
经PCR鉴定,克隆90％-100%的阳性率,所以在后面的挑克隆中,我只挑选4个就足够了。
然后双酶切鉴定,测序。
希望大家不断补充.Ding一下，和我的方法差不多。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min,马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase.springwel wrote:用2周重组了 14个质粒。
这个效率非常不错！佩服！smartkevin wrote：Ding一下，和我的方法差不多。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min,马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。
这个操作是什么原理？为什么要选择45C？其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点)的打开绰绰有余.分子克隆3的经典操作,个人认为主要目的如下:插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配,如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开.由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
springwel wrote:酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
［color=red］但是公司给推荐的一般都是2.0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶,在20ul只加0。
5ul酶，切的也很好。
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
smartkevin wrote：其实也不一定45度,估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下:插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。
由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配,从而提高连接效率。
如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用.不知道还有没有其他的解释?我倒是没有仔细看过分子克隆。
mybbff wrote:如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大,对于同源粘性末端可能有作用.不知道还有没有其他的解释?我倒是没有仔细看过分子克隆。
刚才查了一下分子克隆3，只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合"（中文版p71)。
其实如果是粘性末端酶切的话都是有用的，无所谓非同源和同源末端，就算是非同源末端，载体和载体，片段和片段也能聚合.对于平末端应该就没有什么作用了。
autumnsun wrote:但是公司给推荐的一般都是2.0ul体系加1ul,其实我有的时候为了省酶,在20ul只加0。
5ul酶，切的也很好。
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了,会省好多钱啊，尤其是有的酶,一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管,不知道有人试过没有。
如果100ul里的DNA太多了也不行啊,酶和DNA还是要匹配的我不明白的是,我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切,如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
其实除了考虑酶浓度（每微升多少个单位)以外，还应该考虑这种酶在lamda DNA上的酶切位点数目.比如用HincII和XbaI双切pUC118，这两个酶在pUC118上都只有一个酶切位点，而在lamda DNA上的酶切位点分别是35个和1个。
根据酶活性的定义，相同单位的HincII和XbaI对pUC118的酶切效率是35比1,所以在双酶切体系中，所用的HincII显然应该要少很多。
好！！!真实用！！！“回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ,一般取前者0.3pmol，后者取0。
03pmol。
”是不是应该前者0。
03，后者0。
3啊？精华！投你一票！msher wrote：好！！！真实用！！!“回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0。
3pmol,后者取0。
03pmol.”是不是应该前者0。
03，后者0。
3啊？已经改了,谢谢!昨天14个测序结果出来,全部是阳性克隆。
两边是载体的序列，中间是插入的目的片段。
回顾自己的实验现补充几点。
做转化时,也要进行对照。
设4个：A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆，则证明双酶切成功,当然要保证感受态，培基,连接酶都’正常’的情况下.B。
酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C。
设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误。
D。
AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况。
就上面的对照简要说一下我的结果。
转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆，约100个左右，我用的是直径6cm的板子,所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接用100微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的,长得克隆较大，很好挑选。
