【生化实验】氨基酸薄层层析

氨基酸的薄层分析实验报告一、实验目的本实验旨在通过薄层分析（TLC）技术对氨基酸进行分离和鉴定，熟悉TLC的操作流程，掌握氨基酸在不同溶剂系统中的迁移行为，以及利用显色剂进行定性检测的方法。

二、实验原理薄层分析是一种快速、简便的分离和分析技术。

其原理是基于混合物中各组分在固定相（通常是硅胶或氧化铝）和流动相（展开剂）之间的分配系数不同，从而实现分离。

氨基酸是两性化合物，在不同的pH条件下具有不同的离子形式。

在本次实验中，选择合适的展开剂和显色剂，使氨基酸在薄层板上得以分离，并通过显色反应显现出来。

三、实验材料与仪器（一）材料1、氨基酸标准品：丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）。

2、样品溶液：未知氨基酸混合液。

3、硅胶G板。

4、展开剂：正丁醇乙酸水（4:1:1，体积比）。

5、显色剂：茚三酮溶液。

（二）仪器1、层析缸。

2、毛细管。

3、电吹风。

4、喷雾器。

5、紫外灯。

四、实验步骤1、硅胶G板的制备称取适量硅胶G粉末，置于研钵中，加入一定量的蒸馏水，充分研磨成均匀的糊状。

将糊状硅胶均匀涂布在干净的玻璃板上，厚度约为 025 05mm。

室温下晾干，然后在 105℃烘箱中活化 30 分钟，取出后置于干燥器中备用。

2、点样用毛细管分别吸取氨基酸标准品溶液和样品溶液，在硅胶G板的一端约 1cm 处轻轻点样。

点样斑点直径应小于 2mm，且每个斑点之间应保持一定的距离。

3、展开将点样后的硅胶G板放入预先装有展开剂的层析缸中，使展开剂液面低于点样线。

盖上盖子，让展开剂通过毛细作用沿板上升，当展开剂前沿上升至距板顶端约 1cm 处时，取出硅胶G板，标记展开剂前沿位置，晾干。

4、显色将晾干的硅胶G板放入装有茚三酮溶液的喷雾器中，均匀喷雾显色。

用电吹风轻轻加热，使显色反应充分进行。

氨基酸斑点呈现出紫红色。

5、观察与记录在紫外灯下观察显色后的硅胶G板，记录氨基酸标准品和样品的斑点位置、颜色和形状。

氨基酸的薄层层析[原理 ]氨基酸薄层层析属于吸附层析，主要根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同进行分离或提纯的一种方法。

将硅胶（吸附剂—作为固定相的支持剂）均匀地铺在玻璃片上，并将氨基酸样品点于吸附剂上。

在密闭容器中，由于吸附剂的毛细管作用使展开剂上行将样品展开。

被分离的氨基酸因结构不同，在吸附剂上的吸附亲和力也不同。

吸附力大的就容易被吸附剂吸附，而较难被溶剂所冲洗（即解吸）；吸附力小的就容易被溶剂携带至较远的距离。

氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次的进行吸附和解吸附，从而使不同的氨基酸达到分离的目的。

[试剂 ]（一）硅胶G（二） 0.2%羧甲基纤维素钠称取羧甲基纤维素钠1g 溶于蒸馏水100 ml中，在沸水浴中煮沸至无气泡，冷却，置冰箱储存，临用前稀释至0.2%。

（二）氨基酸溶液制备下列各氨基酸的异丙醇（90%）溶液各10ml。

1． 0.01mol/L 精氨酸精氨酸15.9mg溶于90%异丙醇10ml中。

2． 0.01mol/L甘氨酸甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇10ml中。

3． 0.01mol/L酪氨酸酪氨酸18.1mg溶于90%异丙醇10ml中。

将上述溶液各取出1ml ，混合均匀作为氨基酸混合溶液。

（三）展开剂按4：1：1体积比例混合正丁醇，冰乙酸及水。

临用时配置。

（四） 0.5%茚三酮丙酮溶液茚三酮0.5g溶于无水丙酮100ml 中。

[ 主要器材 ]（一）玻璃板（4× 10cm）（二）层析缸。

（三）喷雾器。

（四）长颈漏斗。

（五）玻璃毛细管。

（六）恒温干燥箱。

[ 操作步骤 ]（一）薄板的制备1．称取硅胶G 0.5g 放入研钵中，加 1.5ml0.2% 羧甲基纤维素钠，研磨成均匀的稀糊状。

2．将上述糊状物倾倒在4× 10cm 的玻璃片（图11）上，使之均匀地布满于玻片，将玻片轻轻地晃动，使硅胶 G 均匀分布，表面平坦，光滑，无水层及气泡，然后水平放置在空气中使其自然干燥。

氨基酸的薄层层析（TLC）【实验原理】聚酰胺薄膜层析是60年代以后发展起来的一种新的层析方法，特别适用于氨基酸及其衍生物的分析。

具有灵敏度高、分辨率强、操作方便快捷等特点。

聚酰胺是一类化学纤维素原料，即锦纶（尼龙）。

由乙二酸和乙二胺聚合而成的，称锦纶66。

由于分子中含有大量的酰胺基团，故称聚酰胺。

聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶制成的。

聚酰胺对许多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的-C=O和 -NH- 能与被分离物质的一定基团形成H键。

如酚类（黄酮类、鞣质）和酸类（氨基酸、核苷酸）能以其羟基与酰胺键的羰基形成H键。

在层析过程中，当样品随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生H键吸附能力的强弱不同，从而可将样品中各成分分离。

物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在滤纸上的移动速率，用Rf来表示。

在一定条件下，每个物质都有特定的Rf值，因此，用Rf可鉴定不同的物质。

无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外照射）或显色法鉴定。

氨基酸层析图谱常用茚三酮作显色剂。

本实验利用单向上行层析法鉴定氨基酸。

【实验试剂和器材】(一) 试剂1. 氨基酸标准液(10mg/ml)：三种氨基酸是赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸，分别配成上述浓度的溶液。

2. 氨基酸混合液（每种氨基酸5mg/ml）3. 展层剂：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V）4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。

(二) 器材聚酰胺薄膜，毛细管，层析装置，电吹风机，喷雾器，塑料手套等。

【实验方法】(一) 薄膜的剪裁取薄膜（7cm×10cm）一张，在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一直线，在此直线上每隔1厘米作一记号为点样处（外侧两点距边缘2c m）。

(二) 点样氨基酸的点样量以5ul为宜。

点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与薄膜垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径最大不超过2mm。

点样过程中，必须在第一点样品干后再点第二滴。

薄层板的制备
薄层板选择
选择适合氨基酸分离的薄层板，如硅胶板、氧化铝板等。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ薄层板的活化
对薄层板进行活化处理，使其表面具有较好的吸附性能。
点样
点样工具选择
选择适当的点样工具，如微量注射器或点样模板。
点样位置和量
在薄层板上标记点样位置，并控制点样量，以便于后续的展开和分离。
展开
展开溶剂选择
选择适合氨基酸分离的展开溶剂，确保 能够将氨基酸充分展开。
氨基酸的鉴定
斑点颜色
不同氨基酸在薄层层析后呈现不同的颜色，可初 步判断氨基酸的种类。
斑点Rf值
不同氨基酸在薄层层析后的迁移率不同，得到的 Rf值也不同，可用来鉴定氨基酸的种类。
斑点质谱分析
对薄层层析后的斑点进行质谱分析，可确定氨基 酸的分子量和结构，进一步确定氨基酸的种类。
定量分析
斑点面积法
通过测量薄层层析后斑点的面积，计算斑点中氨基酸的含量。该方法简单易行，但误差 较大。
在生物科学研究中的应用
氨基酸薄层层析在生物科学研究中常 用于分离和鉴定蛋白质和多肽，是研 究蛋白质组学和生物大分子相互作用 的重要手段之一。
通过氨基酸薄层层析技术，可以分离 出不同蛋白质组分，进一步进行质谱 分析和功能研究，有助于深入了解生 物体内蛋白质的种类、结构和功能。
在医学和临床诊断中的应用
分离效果的评价
分离度
层析后各氨基酸斑点的清晰度和 分离度，可用分离度数值表示。 分离度数值越大，分离效果越好
。
分辨率
层析后各氨基酸斑点间的距离和清 晰度，分辨率越高，分离效果越好 。
重复性
层析实验的重复性，包括多次层析 结果的重复性和同一份样品多次层 析结果的重复性。重复性越好，分 离效果越稳定。