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第1课时基因工程的发展历程和工具学习导航明目标、知重点难点○1了解基因工程的概念、诞生及发展。
○2掌握限制酶及DNA连接酶的作用。
（重、难点）○3理解载体需具备的条件。
（难点）一、阅读教材P7～9第三段完成基因工程发展历程的相关问题1．理论与技术基础(1)沃森和克里克建立了DNA分子双螺旋结构模型。
(2)科恩伯格及其合作者首次在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶。
(3)梅塞尔森和斯塔尔发现了DNA半保留复制的机理。
(4)克里克提出了描述遗传信息流向的中心法则。
(5)尼伦伯格和霍拉纳等破译了全部64种遗传密码。
(6)罗思和赫林斯基发现细菌拟核外的质粒具有自我复制能力，并能在细菌细胞之间转移。
(7)在大肠杆菌细胞中发现了DNA连接酶。
(8)特明和巴尔的摩发现了逆转录酶，证明遗传信息也可以从RNA反向传递到DNA。
(9)史密斯等人分离到第一种特异性很强的限制性核酸内切酶。
2．基因工程(1)概念：在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，并使重组基因在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术，又称为DNA重组技术。
(2)诞生事件：1973年，斯坦福大学科学家科恩等将两种不同来源的DNA分子进行体外重组，并首次实现了重组DNA分子在大肠杆菌中的表达。
(3)发展阶段：1973～1976年为开始期；1977年生产出生长抑制素释放因子，到1981年为发展期； 1983年通过农杆菌转化法培育出世界上首例转基因植物——转基因烟草，以后为迅猛发展期。
二、阅读教材P9第四段～P12分析基因工程的工具——酶与载体1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(1)能识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。
(2)在合适的反应条件下使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
(3)切割出黏性或平口末端。
2．“分子针线”——DNA连接酶连接两个DNA片段形成两个磷酸二酯键成为一个重组DNA。
高中生物第一单元生物技术与生物工程第一章基因工程和蛋白质工程第2节基因工程的应用学案中图版选修31、举例说出基因工程的应用及取得的丰硕成果。
(重点)2、了解基因工程在农业和医学等方面的应用。
(难点)基因工程在农业上的应用1、抗虫棉(1)目的基因：苏云金杆菌的毒蛋白基因。
(2)培育过程：通过基因工程的四步操作将毒蛋白基因导入棉花细胞并且在棉花细胞内成功表达出毒蛋白。
(3)意义：抗虫作物的培育和种植，不但降低了作物的生产成本，使作物能稳产、高产，还降低了农药的使用，减少对环境的污染。
2、金米(1)目的基因：有关胡萝卜素合成的酶的基因。
(2)培育过程：通过基因工程的四步操作将有关胡萝卜素合成的酶的基因导入水稻细胞中，并诱导它们在水稻细胞内得以表达，使水稻中的双香叶素二磷酸转化成β胡萝卜素。
(3)作用：人们食用“金米”后，其中的β胡萝卜素在人体内转化成维生素A，为深受维生素A缺乏症之苦的人们带来了“金色希望”。
科学家通过基因工程的方法，将苏云金杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株抗虫棉。
其过程大致如下图所示。
探讨：Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有TDNA中是利用TDNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。
探讨：Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为什么？提示：转化。
探讨：将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的方法是什么？提示：农杆菌转化法。
探讨：目的基因能否在棉株体内稳定遗传的关键是什么？提示：目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上。
1、抗虫转基因植物(1)方法：将从某些生物中分离出的具有杀虫活性的基因导入农作物中，使其具有抗虫性。
(2)杀虫基因种类：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。
(3)成果：抗虫棉、抗虫水稻等。
(4)意义：减少化学农药的使用，降低生产成本，减少环境污染，降低了对人类健康的损害。
第1课时 基因工程的发展历程和工具1．简述基因工程的发展历程。
2．掌握限制性核酸内切酶和DNA 连接酶的作用、特点。
(重、难点) 3．掌握质粒的含义、特性及其在基因工程中的作用。
(重、难点)知识点一| 基因工程的发展历程和概念1．理论与技术基础的发展1953年：沃森和克里克建立了DNA 分子双螺旋结构模型。
↓1957年：科恩伯格等首次发现DNA 聚合酶。
↓1958年：梅塞尔森和斯塔尔发现DNA 半保留复制的机理。
克里克提出中心法则。
↓1961～1966年：尼伦伯格等破译遗传密码。
↓1967年：罗思和赫林斯基发现运转工具质粒。
同年，科学家在大肠杆菌细胞中发现DNA连接酶。
↓1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA 病毒中发现逆转录酶。
史密斯等人分离到限制性核酸内切酶。
↓1977年：桑格首次完整基因组的测序工作。
2．重组DNA 技术的发展 (1)1972年科学家伯格等实验。
①过程：⎦⎥⎥⎤猿猴病毒SV40的DNA ↑同一种限制性核酸内切酶 ↓λ噬菌体的DNA――――→DNA 连接酶重组的杂种DNA 分子②成就：世界上首次DNA 分子体外重组。
(2)1973年科学家科恩等实验。
⎦⎥⎥⎤大肠杆菌质粒DNA （含卡那霉素抗性基因） ↑同一种限制性核酸内切酶 ↓大肠杆菌质粒DNA （含四环素抗性基因）――――――→DNA 连接酶重组DNA 分子――→转化大肠杆菌―→子代大肠杆菌(双重抗性) (3)不同物种间DNA 重组实验。
①过程：非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA 片段＋大肠杆菌质粒→重组DNA→转入大肠杆菌→转录出相应 mRNA 。
②成就：打破了传统的种间遗传物质不能交换的重重壁垒，开创了基因工程。
3．基因工程的概念[合作探讨]使大米拥有某些细菌才具有的抗虫基因能够减少化学杀虫剂的使用量，既高产又环保。
请你结合以上内容探究下列问题。
探讨1：你知道拥有某些细菌抗虫基因的大米是通过何种技术培育出来的吗？ 提示：基因工程。
第3课时导入、检测和鉴定目的基因[学习导航] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。
2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。
[重难点击] 1.目的基因导入受体细胞的方法。
2.检测和鉴定目的基因的方法。
方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取及基因表达载体的构建。
在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。
由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。
方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。
这是基因工程的第四步工作。
以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。
因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。
检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
一、导入目的基因将目的基因导入受体细胞的方法和过程受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射法感受态细胞法过程将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组的基因表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子1．农杆菌转化法的分析(1)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？答案基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。
第一章 基因工程和蛋白质工程 第一节 基因工程的原理
1．简述基因工程的诞生。 2．简述基因工程的原理及技术。(重点) 3．尝试DNA的提取与鉴定。(难点)
基 因 工 程 的 诞 生 与 操 作 工 具 1．诞生历程 时间 科学家 事件 1967年 发现了DNA连接酶
1970年 史密斯等 首次提取出核酸限制性内切酶 提取了T4DNA连接酶 1972年 伯格等 构建了世界首例体外重组的杂合DNA分子 1973年 科恩等 成功培育出双重抗性大肠杆菌 2.操作工具 (1)核酸限制性内切酶——“基因手术刀”
(2)DNA连接酶——“基因缝纫针” ①作用：将两个DNA片段连接起来，修复被限制性内切酶切开的切口，拼接成新的DNA分子。 ②种类：T4DNA连接酶(把限制性内切酶切开的黏性末端的缝隙“缝合”起来)。 (3)载体——“分子运输车” ①载体的特点 ⅰ.外源DNA的插入不影响载体在宿主细胞内的自我复制。 ⅱ.有适宜的限制性内切酶酶切位点，最好是对多种限制性内切酶有单一切点。 ⅲ.具有某些标记基因。 ⅳ.载体应对受体细胞无害。 ②载体的种类： ⅰ.质粒：它是细菌中独立于细菌DNA之外的小型环状DNA分子。 ⅱ.噬菌体或其他一些病毒。 [合作探讨] 探讨1：下图表示限制性内切酶切割某DNA分子的过程，从下图中可知，该限制性内切酶能识别的碱基序列及其切割位点是什么？ 提示：GAATTC，切点在G和A之间。 探讨2：结合DNA复制的过程分析，限制性内切酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同？ 提示：限制性内切酶作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于两个碱基之间的氢键。 探讨3：如图，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生了下述变化，则X酶是什么？ 提示：DNA连接酶。 [思维升华] 1．核酸限制性内切酶 (1)来源和种类 切割DNA的工具是核酸限制性内切酶，又叫限制酶，这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今已分离出的约有4 000种。 (2)作用 限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 (3)识别序列的组成 一般由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成。 (4)作用结果 当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。 【特别提示】 ①限制酶作用的结果通常有两种形式——黏性末端或平末端； ②限制酶的作用特点体现了酶的专一性。 2．DNA连接酶 (1)分类 根据DNA连接酶的来源不同，可以将这些酶分为两类： ①从大肠杆菌中分离得到的DNA连接酶，称为E·coli DNA连接酶； ②从T4噬菌体中分离出来的DNA连接酶，称为T4DNA连接酶。 (2)作用 这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 【特别提示】 E·coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来， 不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。 3．载体 (1)常用载体——质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的小型环状DNA分子。 (2)载体的条件 ①能够在宿主细胞中稳定地保存，并能够复制，以便提供大量的目的基因； ②具有多个限制酶切割位点，便于与外源基因结合； ③具有标记基因，便于进行检测和筛选。 (3)其他载体 在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 1．下列关于限制酶和DNA连接酶的理解正确的是( ) A．其化学本质都是蛋白质 B．DNA连接酶可以恢复DNA分子中的氢键 C．在基因工程操作中可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶 D．它们不能被反复使用 【解析】 限制酶和DNA连接酶的化学本质均为蛋白质，DNA连接酶的作用是将两个DNA片段连接起来，DNA聚合酶的作用是把单个脱氧核苷酸连成脱氧核苷酸链。 【答案】 A 2．核酸限制性内切酶 Ⅰ 的识别序列和切点是—G↓GATCC—，核酸限制性内切酶 Ⅱ 的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶 Ⅰ 的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶 Ⅱ 的切点。 (1)请画出质粒被限制酶 Ⅰ 切割后所形成的黏性末端。 (2)请画出目的基因两侧被限制酶 Ⅱ 切割后所形成的黏性末端。 (3)在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后的片段是否可以连接？为什么？ 【解析】 本题考查核酸限制性内切酶切割DNA的方式，将限制酶能识别的序列写出，再将限制酶切点处标出，可用虚线画出，然后可沿着虚线将片段一分为二，这样便能正确画出核酸限制性内切酶将DNA切出的黏性末端了。若限制酶切割后产生的黏性末端能互补配对，形成的黏性末端便能连接，否则不能。
【答案】 (1)—G↓GATC C——C CTAG↑ G—――→用酶Ⅰ切割 —G GATCC——CCTAG G— 目的基因
(2)—↓GATC—……—↓GATC——CTAG↑—……—CTAG↑—――→用酶Ⅱ切割 目的基因 — GATC—……— GATC——CTAG —……—CTAG — (3)可以连接；因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的(或是可以互补的)。 基 因 工 程 的 概 念 与 一 般 程 序
1．概念 基因工程是指按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外剪切，并与特殊的运载工具进行重新组合，然后转入另一种生物的体内进行扩增，并使之表达产生所需蛋白质的技术。它可以在分子水平上定向改造生物的遗传性状。 2．一般程序 (1)目的基因的获得 ①目的基因：在基因操作中使用的外源基因。 ②获取方法 ⅰ.直接分离法：直接从基因组中获取目的基因，最常用的方法是“鸟枪法”，又称“霰弹法”。 ⅱ.人工合成法：主要包括反转录法和化学合成法两种。 (2)重组载体的构建 ①方法：用同一种限制性内切酶分别切割质粒和目的基因，再用DNA连接酶将它们连接起来。 ②重组载体的作用：携带外源DNA分子片段进入受体细胞。 (3)重组载体的导入和筛选 ①转化：将带有目的基因的重组载体与相应的受体细胞放在一起培养，通过一定的方式进行诱导，使之进入受体细胞的过程。 ②转化方法 ⅰ.运用载体进行转化。 ⅱ.基因枪法。 ⅲ.显微注射法。 ⅳ.花粉管通道法。 ③筛选方法：利用选择培养基培养转化后的受体细胞。 (4)目的基因的表达和鉴定 通过检测转化的生物有没有显示出目的基因控制的性状来进行鉴定。 [合作探讨] 探讨1：依据某一蛋白质的氨基酸序列合成的目的基因，其脱氧核苷酸序列是否是唯一的？ 提示：不是。因为一种氨基酸可能有多种密码子来决定。 探讨2：采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的有哪些？ ①将毒蛋白注射到棉受精卵中 ②将编码毒蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 ④将编码毒蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵 提示：③④。 探讨3：如何检测抗虫棉中的毒蛋白基因是否表达？ 提示：让棉铃虫取食抗虫棉，若棉铃虫食后死亡，说明毒蛋白基因表达。 [思维升华] 1．目的基因的获取 (1)从基因文库中获取目的基因 ①基因组文库：如果一个基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库就叫做基因组文库。 ②部分基因文库：如果一个基因文库中只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库就叫做部分基因文库，如cDNA文库。 (2)人工合成目的基因有两个途径： ①反转录法：就是以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成单链DNA，再合成双链DNA。 ②直接合成法：就是以已知蛋白质的氨基酸序列为基础，推出mRNA的核苷酸序列，再推出目的基因序列，然后进行人工合成。 (3)利用PCR技术扩增目的基因 PCR技术扩增目的基因与DNA复制的比较 PCR技术 DNA复制
相同点
原理 碱基互补配对
原料 四种脱氧核苷酸 条件 模板、ATP、酶 不同点
解旋方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 场所 体外复制 细胞核内 酶 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 细胞内含有的DNA聚合酶 结果 在短时间内形成大量的DNA片段 形成整个DNA分子 【特别提示】 从基因文库中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基因时，目的基因已存在。人工合成目的基因时，目的基因从无到有。 2．重组载体的构建 (1)构建目的 其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)构建零件及其作用 ①目的基因 ②启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 ③终止子：相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。 ④标记基因：其作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。 【特别提示】 由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的。 3．重组载体的导入与筛选 (1)转化：将带有目的基因的重组载体导入受体细胞的过程。 ①过程图解 【特别提示】 上图中b与a相比，b会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是：在进行细胞分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性；而a细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因，其优越性在于能有效预防基因污染。 ②不同细胞转化的比较 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细体细胞 受精卵 原核细胞
