荚膜多糖解聚酶终结版

酶解法改善燕麦β葡聚糖溶解性能一、燕麦β葡聚糖概述燕麦β葡聚糖是一种存在于燕麦中的天然多糖，以其独特的健康益处而闻名。

这种多糖主要由β-1,3和β-1,4糖苷键连接的葡萄糖分子组成，形成复杂的三维结构。

燕麦β葡聚糖因其在降低胆固醇、控制血糖和改善肠道健康方面的潜在功效而被广泛研究。

然而，燕麦β葡聚糖的溶解性能限制了其在食品工业中的应用。

为了提高其溶解性和功能性，酶解法作为一种有效的技术手段被提出并研究。

二、酶解法的基本原理酶解法是一种利用酶的催化作用来分解大分子物质的方法。

在燕麦β葡聚糖的改善中，酶解法通过特定的酶类，如β-葡聚糖酶，来切断β葡聚糖分子间的糖苷键，从而降低其分子量和改善其溶解性。

酶解过程中，酶的选择性作用于特定的糖苷键，使得燕麦β葡聚糖的分子结构发生变化，进而影响其物理和化学性质。

2.1 酶的选择与作用机制选择合适的酶是酶解法成功的关键。

β-葡聚糖酶是一类能够特异性作用于β葡聚糖的酶，它们能够识别并切断β-1,3和β-1,4糖苷键。

这些酶的作用机制涉及酶活性位点与底物的结合，以及随后的催化反应，导致糖苷键的断裂。

酶的种类、来源和活性对酶解效果有显著影响。

2.2 酶解条件的优化酶解条件，包括pH值、温度、酶浓度和底物浓度等，对酶解效果有着重要影响。

优化这些条件可以提高酶的催化效率和选择性，从而获得理想的酶解产物。

例如，不同的β-葡聚糖酶可能在不同的pH值和温度下表现出最佳活性，因此需要通过实验来确定最佳条件。

2.3 酶解产物的分析酶解后，燕麦β葡聚糖的分子量、分子结构和溶解性等特性都会发生变化。

通过凝胶渗透色谱(GPC)、高效液相色谱(HPLC)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)等技术可以对酶解产物进行分析，以评估酶解效果。

三、燕麦β葡聚糖溶解性能的改善通过酶解法改善燕麦β葡聚糖的溶解性能，可以提高其在食品工业中的应用潜力。

以下是一些具体的改善措施和效果。

3.1 降低分子量酶解法通过切断燕麦β葡聚糖分子间的糖苷键，降低其分子量。

工具酶总结第1篇GlySERIAS是一种特异性酶切G4S柔性Linker或PolyG的酶，可以用于表征多功能蛋白结构域的融合蛋白。

最近做的一个项目就使用了该酶进行表征，用来推测linker两端的蛋白结构域的翻译后修饰。

这个酶比GinsKHAN还贵，2000u一万多块钱，用的我肉疼。

肽图分析用酶肽图分析是根据蛋白质分子量大小及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特定的位点将蛋白裂解成多个小片段，通过一些分离手段形成特征性指纹图谱，是治疗性抗体及融合蛋白等一级结构鉴定的“金标准”方法。

下表中列出了常见肽图分析用酶的酶切位点及优缺点，供参考。

参考文献：M, Khalili H. Soluble Papain to Digest Monoclonal Antibodies; Time and Cost-Effective Method to Obtain Fab Fragment. Bioengineering (Basel). 2022 May 12;9(5):209. doi: . PMID: 35621487; PMCID: PMC9137653.工具酶总结第2篇PNGase F(肽N-糖苷酶F)是一种酰胺水解酶，主要由脑膜炎脓杆菌等革兰氏阴性菌分泌。

PNGaseF可以裂解由天冬酰胺连接的高甘露糖及杂合和复杂的寡糖糖蛋白。

PNGaseF的切割位点为糖蛋白内侧N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基之间的酰胺键，同时将酶解后蛋白上的天冬氨酰转化为天冬氨酸。

PNGase F不会去除常见植物糖蛋白上含有核心α-(1,3)-岩藻糖连接的寡糖。

工具酶总结第3篇3C蛋白酶是切割小RNA病毒科非结构蛋白的关键酶，在病毒复制过程中发挥着重要作用。

人鼻病毒3C蛋白酶具有高度的酶切特异性，能特异切割位于Gln-Gly之间的肽键，识别位点为 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro。

葡聚糖内-1,3-β-葡糖酶葡聚糖是一种多糖，由许多β-葡萄糖分子组合而成。

这种多糖在自然界广泛分布，包括植物、真菌、细菌和动物中。

葡聚糖在这些生物中具有多种重要功能，如提供结构支持、膜层保护、细胞间信号传递和免疫应答等。

葡聚糖内-1,3-β-葡糖酶（PG）是一种能够降解葡聚糖的酶类。

它可以催化葡聚糖的水解反应，将其分解成低聚糖和单糖。

目前，许多真菌中的PG已被分离和鉴定，其中以酵母菌的PG最为广泛研究。

PG对于细胞生长和分化、细胞壁合成和重组、藻类和真菌的招募、植物抵御病原菌的作用等有重要影响。

PG的生物学功能也被广泛研究和应用于医药和农业领域。

近年来，PG的研究是一个非常热门的课题。

研究人员通过分子生物学和基因工程技术得到了大量的PG基因序列。

同时，PG的表达也受到广泛关注，特别是在微生物发酵、细胞壁结构和医药领域。

在微生物发酵中，PG可以通过控制其基因表达来产生大量低聚糖和单糖。

这些产物对某些工业生产和食品添加剂有广泛的应用，比如说肉制品和面包。

在真菌和植物内，PG对于细胞壁合成和重组起着重要作用。

在细胞壁合成中，PG可以加速和协调细胞壁的合成。

在细胞壁重组中，PG的表达可以加快细胞壁的降解和合成，使细胞获得更好的结构和保护。

在医药领域，PG被广泛研究，用于治疗某些疾病。

例如，PG可以作为免疫调节剂，增强宿主对病原菌的抵御能力。

它也可以用作抗肿瘤药物，破坏肿瘤细胞壁，促进细胞凋亡。

总之，PG在生物界中是起着重要作用的酶类。

它拥有丰富的生物学功能和广泛的应用价值。

我们期待在未来的研究中能够更深入地了解PG的作用机制，扩大它的应用范围，并进一步应用于医药和农业领域。

木葡聚糖内转葡糖基酶
木葡聚糖内转葡糖基酶（endo-1,4-β-xylanase）是一类具有广泛分布和高度多样性
的酶。

它们能够水解木葡聚糖（xylan），是植物细胞壁中最主要的多糖之一。

木葡聚糖内转葡糖基酶能够将木葡聚糖分解成较小的寡聚糖或单糖，从而为后续的降解提供了可利用
的碳源。

木葡聚糖内转葡糖基酶的催化机理主要包括两个阶段：先是切断1,4-β-葡萄糖苷键，形成一个间断的寡糖链；然后是通过内切酶作用，将间断处的另一个糖基上的1,4-β-葡
萄糖苷键切断，使产生一个单糖，同时在链的两端形成两个新的还原末端。

目前已经从多种来源（如细菌、真菌和植物）中分离和鉴定出许多木葡聚糖内转葡糖
基酶。

这些酶在物种间存在着广泛的差异，包括催化机理、催化效率等方面。

一般认为，
木葡聚糖内转葡糖基酶可以通过筛选、扩增和克隆等方式，从自然界中分离出并得到提
纯。

木葡聚糖内转葡糖基酶在许多工业领域中有着广泛的应用。

例如，在食品工业中，它
们可以被用于提高酵母发酵速度、改进面包品质以及发酵葡萄酒等；在制药工业中，它们
可以被用于生产多糖和抗肿瘤药物等；在纸浆和造纸工业中，它们可以被用于提高木材的
脱木素性能、改进纤维素韧性等。

此外，木葡聚糖内转葡糖基酶在环境保护和能源生产等
领域也有广泛的应用，如处理食品、纺织、皮革和纺织化学废水等。

总之，木葡聚糖内转葡糖基酶是一类重要的多功能酶，其在工业生产和科学研究等领
域中具有广泛的应用前景。

它们的研究和应用将为实现生物质资源高效利用和低碳经济的
建设提供技术支撑和保障。

纤维素分解酶分解纤维素的过程
纤维素分解酶是一类能够分解纤维素的酶，常见于真菌、细菌以及某些动物的消化系统中。

纤维素分解酶能够加速纤维素分解，使其变成更小的碎片，最终被微生物或其他生物利用。

纤维素分解的过程包括三个主要的步骤：吸附、水解和解聚。

在吸附阶段，纤维素分解酶会吸附到纤维素纤维的表面上。

这一步骤的目的是为了增加纤维素分解酶与纤维素之间的接触面积，从而提高纤维素降解的效率。

在水解阶段，纤维素分解酶开始将纤维素分解成较小的单糖单元。

这一步骤涉及到多种酶的协同作用，其中一些酶会将纤维素分子切断成较小的碎片，而其他酶则会将这些碎片进一步切割成更小的单糖单元。

解聚阶段是纤维素分解的最后一步。

在这个阶段，纤维素分解酶将分解后的单糖单元从纤维素纤维上解离，从而使其可以被微生物或其他生物利用。

总的来说，纤维素分解酶分解纤维素的过程是一个复杂的过程，涉及到多种酶的协同作用。

这些酶能够将纤维素分子分解成较小的单糖单元，从而促进可生物降解性的产生。

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・研究原著・文章编号:100022790(2008)022*******铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的克隆表达及生物学活性贾　鸣,胡晓梅,孙卫忠,饶贤才,丛延广,胡福泉(第三军医大学基础部微生物学教研室,重庆市微生物工程重点实验室,重庆400038)收稿日期:2007208228;　接受日期:2007211210基金项目:国家自然科学基金(30300295)通讯作者:胡晓梅.Tel:(023)68752239　E mail:hx m03@yahoo .co m.cn;胡福泉.Tel:(023)68752240　E mail:hoofuquan@yahoo .co 作者简介:贾　鸣.硕士,住院医师.Tel:(023)68752239　Email:j m 7818@C lon i n g and expressi on of polys accha 2r i de depoly m era se gene fro m Pseudo 2m onas aeruginosa bacter i ophage PaP3and its b i olog i c acti v ityJ I A M ing,HU X iao 2M ei,SUN W ei 2Zhong,RAO X ian 2Cai,CON G Yan 2Guang,HU Fu 2Q uanDepart m ent of M icr obi ol ogy,Third M ilitary Medical University,Chongqing 400038,China【Abstract 】A I M :To cl one and exp ress the polysaccharidedepoly merase gene fr om Pseudo m onas aeruginosa bacteri ophage PaP3and detect its bi ol ogic activity .M ETHOD S:The gene of polysaccharide depoly merase was a mp lificated fr om the genome of bacteri ophage PaP3by PCR and inserted int o the p las m id pQE 231.The recombinant vect or was transf or med t o E .coli J M109and induced with I PTG .The ressed p r otein was is olated and ana 2lyzed with s odiu m dodecyl sulfate polyacryla m ide gel electr ophore 2sis (S DS 2P AGE ).The tagged p r otein was purified by N i 2NT A af 2finity chr omat ography .Then the degradati on activity of polysac 2charide depoly merase t o Pseudo m onas aeruginosa bi ofil m s was detected .RESU L TS:The gene of polysaccharide depoly merase was successfully a mp lified and cl oned int o pQE 231.The exp res 2si on rate was 25%.The results of S DS 2P AGE showed that the rel 2ative molecular mass (M r )of the exp ressed p r otein was 20.4ku .After s onicati on,most of the fusi on p r otein was secreted int o the supernatant .The purity of recombinant polysaccharide depoly 2merase was up t o 95%after N i 2NT A colu mn affinity chr omat ogra 2phy .The reacti on with exopolysaccharide of bi ofil m s dis p layed that recombinant polysaccharide depoly merase exerted certain deg 2radati on effect on the exopolysaccharide .CO NCL US I O N:The recombinant polysaccharide depoly merase fr ombacteri ophagePaP3has the s pecific degradati on activity in vitro .The p resent work lays the f oundati on f or the further research of bacteri ophage PaP3polysaccharide depoly merase .【Keywords 】p seudomonas aeruginosa;bacteri ophages polysac 2charide depoly merase;bi ofil m s;exopolysaccha 2ride;cl oning,molecular;p r otein exp ressi on【摘　要】目的:克隆表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因并检测其活性.方法:应用PCR 技术从铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组中扩增多糖解聚酶基因,将其克隆于原核表达载体pQE 231中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌J M109,I PTG 诱导表达;采用N i 2NT A 柱亲和层析分离纯化目的蛋白;提取铜绿假单胞菌生物膜胞外多糖,观察目的蛋白对胞外多糖的降解活性.结果:采用PCR 技术成功扩增了铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因,所构建的重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E .coliJ M109后,I PTG 诱导目的蛋白表达率约为25%;S DS 2P AGE 初步测定目的蛋白的相对分子质量(M r )约为20.4×103,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要在上清中以可溶形式表达.经N i 2NT A 柱亲和层析后蛋白纯度大于95%.初步活性检测结果表明重组PaP3多糖解聚酶蛋白对生物膜胞外多糖具有一定的降解作用.结论:重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌的胞外多糖,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.【关键词】假单胞菌,铜绿;细菌噬菌体;多糖解聚酶;生物膜;胞外多糖;克隆,分子;蛋白表达【中图号】R378.2 【文献标识码】A0　引言胞外多糖是细菌生物膜的主要成分.研究表明,噬菌体产生的多糖解聚酶在酶量充足的情况下可以破坏细菌生物膜的整个结构[1],从而有可能成为专门破坏细菌生物膜的“酶学消解剂”.在本室已完成全基因组测序和注释的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3[2]中,p02基因的编码产物被推定为多糖解聚酶家簇的成员,但这种推定需要实验的进一步证实.本研究从噬菌体PaP3基因组中扩增多糖解聚酶基因,并在此基础上建立原核表达和纯化的方法,获得了能够特异降解胞外多糖的重组多糖解聚酶,为深入研究PaP3多糖解聚酶基因的功能奠定了基础.1　材料和方法1.1　材料　表达质粒pQE 231为Q iagen 产品;大肠埃希菌J M109由本室保存;噬菌体PaP3由本室分离自西南医院污水处理站,冻干后于4℃保存.受体菌P A3由新桥医院检验科提供,本室保存.Muller2H in2 t on肉汤(MHB)和Muller2H int on琼脂(MHA)购自北京天坛生物.聚碳酸酯膜片购自Sig ma公司.限制性内切酶H in dⅢ,B am HⅠ购自NEB公司,Ex Taq DNA 聚合酶购自大连宝生物公司,T4DNA连接酶购自Pr omega公司,质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Omega公司.1.2　方法1.2.1　噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的扩增　本室已完成对噬菌体PaP3的全基因组测序,基因组序列和注释已登录Gen Bank(AY078382).根据推定的噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的碱基序列,设计1对引物,上游引物的5′端引入保护碱基(GCT)和B am HⅠ酶切位点,序列为:5′2GCTG↓G AT CCG ATG AAGT2 TCG ACG AAT AC23′;下游引物的5′端引入保护碱基(GCG)和H in dⅢ酶切位点,序列为:5′2GCG A↓AGCTTGTT AAGT CACCGTGCT AC23′.引物由上海生工生物工程公司合成.制备噬菌体PaP3颗粒,提取噬菌体DNA为模板,扩增PaP3多糖解聚酶基因. PCR扩增过程:50μL的反应体系中,上下游引物各2μL,d NTPs(每个2.5mmol/L)1μL,25 mmol/L MgCl24μL,Ex Taq酶0.3μL,PaP3模板DNA0.5μL,双蒸水35μL.混匀后,按照以下的循环参数在PCR仪中进行反应:94℃预变性2m in,然后94℃30s→55℃30s→72℃1m in进行25个循环,最后72℃延伸10m in.反应结束后,电泳检测并回收.1.2.2　目的基因的克隆、转化及酶切鉴定　PCR扩增产物和质粒pQE231经过10g/L的琼脂糖凝胶电泳后,分别回收500bp和3400bp的片段并纯化.纯化后的PCR产物和pQE231质粒分别经过B am HⅠ, H in dⅢ酶切后,进行连接反应.在20μL连接反应体系中,取4μL的PCR产物,加入pQE231载体质粒7μL,10×连接酶缓冲液2μL,T4DNA连接酶(5U/μL)1μL,双蒸水6μL,在16℃连接16h.取6μL连接产物转化感受态细胞J M109,用含有氨苄的LB琼脂平板筛选,37℃孵育18h,挑取转化平板上的菌落增菌后提取质粒,并用B am HⅠ,H in dⅢ进行双酶切鉴定.酶切鉴定无误的重组质粒送北京三搏远志公司进行核苷酸序列测定.测序结果与GenBank 公布序列通过BLAST软件进行比对分析.1.2.3　重组基因工程菌的诱导表达和纯化　将鉴定好的基因工程菌接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振摇培养至A600nm约为0.6时加入I PTG诱导表达5h,收菌进行S DS2P AGE电泳.凝胶扫描仪对电泳凝胶进行扫描,Quantity One软件分析重组蛋白表达率.收集诱导表达的重组菌,在冰浴中超声破菌, 300W,3s,间歇2s,全程30m in.13000g离心1h,收集上清和沉淀,S DS2P AGE鉴定目的蛋白表达形式.随后采用N i2NT A纯化系统对目的蛋白进行亲和层析纯化,并将各步留取的样品作S DS2P AGE电泳分析.将纯化后的目的蛋白浓缩冻干,取冻干产物,用0.01mol/L的P BS溶解.用BCA法测定蛋白浓度后,分装并置于-20℃保存备用.1.2.4　重组噬菌体PaP3多糖解聚酶蛋白的活性检测　根据文献[3]的方法提取生物膜的胞外多糖,取2.5mL过夜培养的铜绿假单胞菌加入50mL MHB 肉汤中,同时加入灭菌聚碳酸酯膜片,37℃孵育24h,即得到已形成生物膜的膜片.用P BS洗涤2次,去除表面的浮游菌细胞.再加入50mL P BS, 120r/m in振摇1m in洗脱生物膜,10000g离心20 m in将细菌沉淀和生物膜多糖(上清)分离,用3倍体积的无水乙醇加入上清中以沉淀胞外多糖成分,将沉淀用无菌蒸馏水再次溶解,制成胞外多糖溶液, -20℃保存备用.将提取的生物膜多糖加入到凝胶中(终浓度2～4g/L),凝胶成分(300g/L丙烯酰胺1.28mL;1.5mol/L Tris・HCl,pH8.81.04mL;100g/L S DS 0.04mL;100g/L过硫酸铵0.04mL;TE MED0.002 mL;胞外多糖0.012mL)凝胶厚度为1.5mm,待凝胶凝固后取下备用.用打孔器在凝胶上依次均匀打孔,然后将多糖解聚酶及P BS(阴性对照)各30μL样品依次加入到孔中,放置于湿盒中37℃孵育16h.加入染色液(0.1g/L K OH,1g/L亚甲基蓝)染色2h,用双蒸水脱色后,观察结果.2　结果2.1　目的基因的扩增和克隆　结果如图1所示, PCR扩增产物的大小约为500bp(见6泳道),与预期大小相吻合.PCR纯化产物和pQE231质粒分别经B am HⅠ,H in dⅢ酶切纯化后,进行连接反应,连接产物转化受体菌J M109.经过氨苄平板筛选后增菌提取质粒.经B am HⅠ,H in dⅢ双酶切后电泳检测,分别在3500bp和500bp左右可见到酶切片段(见1,2泳道),结果与理论预期值一致.核苷酸测序结果表明,重组质粒的序列和阅读框均正确.2.2　重组工程菌的诱导表达　对筛选到的阳性克隆增菌培养,并用I PTG诱导5h后行S DS2P AGE鉴定,结果如图2所示.从图中第3泳道可见阳性重组子在分子量约20ku 处有一条表达蛋白带,此蛋白与理论预期的融合蛋白分子量大小相符,为序列正确的阳性重组子表达产物.薄层扫描分析显示,目的蛋白表达量约为细菌总蛋白的25%.收集表达菌液,超声破菌.在超声破菌的上清和沉淀中均有目的蛋白存在,并且主要存在于上清中,说明目的蛋白主要以可溶形式表达.1～2:阳性重组质粒经B am H I/H in d III 双酶切;3～4:阳性重组质粒;5:pQE 231质粒对照;6:PaP3多糖解聚酶基因的PCR 扩增产物;7:PaP3DNA 模板;M:DNA marker .图1　多糖解聚酶重组质粒及酶切鉴定M:低分子量蛋白marker;1:pQE 231空载体;2:阳性重组质粒;3:超声破菌沉淀;4:表达菌液上清;5:超声破菌上清.图2　重组PaP3多糖解聚酶的表达及表达形式鉴定2.3　目的蛋白的亲和层析纯化　由于目的蛋白主要以可溶形式存在,故用收集的上清行非变性条件下的亲和层析,用分别含10,20,250mmol/L 浓度的咪唑洗脱缓冲液(pH 8.0)依次进行洗脱,在亲和层析的洗脱峰中含分子量约20ku 的目的蛋白,与PaP3多糖解聚酶的理论分子量相符.S DS 2P AGE 电泳显示(图3),洗脱峰中目的蛋白纯度高,基本无杂蛋白的存在,说明采用非变性的亲和层析可以实现重组PaP3多糖解聚酶的一步纯化.纯化后的目的蛋白经分子筛层析去除盐份和多余的咪唑,并用BCA 法测定其浓度,低温冷冻干燥后,用0.01mol/L P BS 溶解,调整浓度为10g/L,-20℃冻存.2.4　重组PaP3多糖解聚酶活性的初步鉴定　活性鉴定的结果显示,在加入重组多糖解聚酶蛋白30μL 的孔中,形成了直径约为1.5c m 的降解圈,而加入P BS (阴性对照)的孔中,无透明降解环的形成,说明多糖解聚酶蛋白对生物膜的胞外多糖具有降解活性,结果见图4.M:低分子量蛋白marker;1:pQE 231空载体;2:阳性重组质粒;3:超声破菌上清样本;4:亲和层析穿过峰样本;5:亲和层析洗脱峰样本.图3　目的蛋白亲和层析纯化的S DS 2PAGE1:多糖解聚酶;2:P BS 缓冲液(阴性对照).图4　挖孔法检测多糖解聚酶对铜绿假单胞菌胞外多糖的降解活性3　讨论细菌生物膜是指被自身产生的外部多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等包裹着的菌细胞的结构群体[4].包被有生物膜的细菌称为被膜菌,而那些游离于生物膜之外独立生长的细菌称为“浮游菌”.被膜菌无论其形态结构、生理生化特性、致病性、还是对环境因子的敏感性等都与浮游细菌有显著的不同[5].医学实践中,与细菌生物膜相关的疾病被称为菌膜病.菌膜病一旦发生,常反复发作,极难彻底治愈,这与被膜菌对药物的耐受性增强密切相关.而胞外多糖被能阻止抗生素渗入生物膜内层菌细胞,是细菌通过生物膜增强耐药性的主要机制之一.因此,如果能够寻找到新的破坏细菌生物膜的措施,无疑对阻断细菌的致病作用以及提高其对药物的敏感性进而杀灭耐药菌都具有重要意义.噬菌体是能够“吃”掉细菌的病毒[6].噬菌体要“吃”掉被膜菌,首先必须突破细菌表面的糖被,因此,噬菌体基因组中必然具有编码分解细菌胞外多糖的多糖解聚酶基因.最近的研究表明,噬菌体的确能够产生多糖解聚酶特异地降解细菌多糖.并且多糖解聚酶基因已在几个噬菌体中发现[7-8].Won 等对噬菌体φ2Ealh 基因组中一个编码胞外多糖解聚酶的基因进行了克隆和表达,表达蛋白对宿主菌的胞外多糖具有降解活性[9].Hughes 等的研究结果表明噬菌体通过产生多糖解聚酶能够特异地降解细菌生物膜,并且只要酶量充足就能完全破坏整个生物膜的结构[10].铜绿假单胞菌胞外多糖聚合物的主要成分是藻酸盐,Geoffrey 等的研究显示,噬菌体F116作用于其宿主菌铜绿假单胞菌NC I M B 10548的生物膜,能够降低藻酸盐的粘度进而杀灭生物膜内的细菌[3].本研究以pQE 231质粒作为表达载体,对PaP3的多糖解聚酶基因进行了克隆和表达,表达的目的蛋白带有6×H is 标签小肽,采用N i 2NT A 非变性亲和柱实现了目的蛋白的一步纯化,纯化后的多糖解聚酶蛋白能够分解铜绿假单胞菌的胞外多糖成分.实验结果一方面验证了噬菌体PaP3p02基因的功能,推动了PaP3功能基因组学的研究,另一方面也为我们深入研究PaP3多糖解聚酶的功能及临床应用前景奠定了基础.【参考文献】[1]Hughes K A,Sutherland I W ,Clark J,et al .Bacteri ophage and ass o 2ciated polysaccharide depoly merases novel t ools for study of bacterial bi ofil m s[J ].J App lM icr obi ol,1998,85(3):583-590.[2]Tan Y,Zhang K,Hu F,et al .W hole genome sequencing of a novelte mperate bacteri ophage of P .aeruginosa:evidence of t RNA gene mediating integrati on of the phage genome int o the host bacterial chr omos ome[J ].CellM icr obi ol,2007,9(2):479-491.[3]Geoffrey W ,Stephen P,Cedric J,et al .Reducti on in exopolysac 2charide viscosity as an aid t o bacteri ophage penetrati on thr ough Pseudomonas aeruginosa bi ofil m s [J ].App l Envir on M icr obi ol,2001,67(6):2746-2753.[4]Costert on J W ,Stewart PS,Greenberg EP .Bacterrial bi ofil m s com 2mon cause of persistent infecti ons[J ].Science,1999,284(5418):1318-1322.[5]Davies D.Understanding bi ofil m resistance t o antibacterial agents[J ].Nat Rev D rug D iscov,2003,2(2):114-122.[6]A lisky J.Bacteri ophages show p r om ise as anti m icr obial agents[J ].JI nfect,1998,36(1):5-15.[7]Petter JG,V i m r p lete nucleotide sequence of the bacteri o 2phage K1F tail gene encoding endo 2N 2acylneuram inidase (endo 2N )and comparis on t o an endo 2N homol og in bacteri ophage PK1E[J ].J Bacteri ol ,1993,175(14):4354-4363.[8]Gerardy 2Schahn R,Bethe A,B rennecke T,et al .Molecular cl oningand functi onal exp ressi on of bacteri ophage PK1E 2encoded endo 2neura m inidase Endo NE [J ].Mol M icr obi ol,1995,16(3):441-450.[9]Ki m W S,Geider K .Characterizati on of a viral EPS 2depoly merase,apotential t ool f or contr ol of fire blight[J ].Phyt opathol ogy,2000,90(11):1263-1268.[10]Hughes K A,Sutherland I W ,Jones MV.B i ofil m suscep tibility t obacteri ophage attack:the r ole of phage 2borne polysaccharide depoly 2merase[J ].M icr obi ol ogy,1998,144(11):3039-3047.编辑　王雪萍・经验交流・　文章编号:100022790(2008)022*******结核性胸膜炎放飞1例李　燕,王昕欣(解放军第451医院空勤科,陕西西安710054)收稿日期:2007211207;　接受日期:2007212202作者简介:李　燕.硕士,主治医师.Tel:(029)84734096【关键词】结核性胸膜炎;飞行员【中图号】R825.6 【文献标示码】B1　临床资料　男性,47岁,某飞行部队领航长,飞行机种:轰26,飞行总时间:3600h .因间断性咳嗽、发热、气短10d,腹痛、黑便3d 入院治疗.患者于入院前10d 受凉出现咽痛不适,随后出现刺激性咳嗽,间断性发作,晨起及晚间睡眠前咳嗽剧烈,起初为干咳,继而出现咯痰,为黄色粘痰,咳嗽时气短、心悸,伴胸闷、胸痛,胸痛为剧烈尖锐的针刺样痛,深呼吸及咳嗽时疼痛更甚,浅呼吸、平卧和左侧卧位时胸痛减轻,无头晕、头痛,伴发热,先后四次体温高达38.5℃,抗感染对症治疗不理想,气短、心悸、胸闷、胸痛症状进行性加重.入院前3天无明显诱因出现上腹部左侧隐痛,阵发性发作,向周围放射,呃逆,无返酸,无恶心、呕吐,黑便.既往患感音性聋(双)16a .查体:急性痛苦病容,体温37.4℃,血压120/80mmHg,呼吸浅快,右侧颌下淋巴结轻度肿大,余浅表淋巴结无肿大.眼睑轻度浮肿,球结膜充血水肿,咽部充血,咽后壁有淋巴滤泡增生,双侧扁桃体无肿大.左侧胸廓稍饱满,无畸形,呼吸运动轻度受限,左侧语颤减弱,左肩胛下角线8肋以下叩诊浊音,呼吸音减弱,右侧无特殊.上腹部轻压痛,无反跳痛,肠鸣音活跃.神经系统查体未发现明确异常.实验室检查:血、尿、便三常规及生化指标均无特殊.血沉快.胸部X 线及胸部B 超示左侧中量胸腔积液,未发现肺内占位性病变.胸水黄绿色,化验为渗出液.心电图正常.腹部B 超示胆囊壁粗糙、囊壁所见多考虑胆固醇样息肉.抗2肺炎支原体I g M 阴性.纤维胃镜示慢性胃炎.肺功能检查及血气分析无明显异常.Hbs Ag 阴性.诊断:①左侧胸腔积液(左侧结核性渗出性胸膜炎);②慢性胃炎.先后进行胸腔穿刺抽液8次,“抗痨治疗”1a 余.复查胸片示:左侧陈旧性胸膜炎(胸膜增厚粘连),肝功正常.结论:飞行合格.随访6mo 无复发.2　讨论　结核性胸膜炎可发生于任何年龄,是儿童和青年最常见的胸膜炎.当机体处于高度变态反应状态时,结核分枝杆菌及其代谢产物通过淋巴、血行或胸膜下肺部结核病灶直接蔓延侵入胸膜,引起细胞介导的免疫反应,产生胸腔积液.该病例即为结核性渗出性胸膜炎.至于本病的病因及发病机理目前认为是胸膜在遭受结核杆菌感染后产生针对其抗原成分的变态反应,免疫调节细胞(CD4+T 淋巴细胞)在胸膜腔内募集,并分泌各类细胞因子,如I F N 2γ,I L 22,T NF 2α,I L 21β,使效应细胞(巨噬细胞)活化,通过吞噬与杀菌作用将病原菌局限、消灭,同时胸膜毛细血管充血、渗出、炎症细胞浸润致胸膜通透性增高,引起胸腔积液.一旦诊断结核性渗出性胸膜炎,必须进行胸腔穿刺及正规抗结核治疗.该飞行人员进行上述两种治疗后达临床治愈.对毒性症状严重、胸腔积液量多的病人,许多专家认为在使用抗结核药物和胸腔穿刺的同时加用糖皮质激素,目的在于减轻机体的变态反应和炎症反应使胸液迅速吸收,减少胸膜粘连增厚.【参考文献】[1]蔡柏蔷.胸腔积液形成的新机制[J ].中华内科杂志,1999,38(12):844.[2]陈灏珠.实用内科学[M ].北京:人民军医出版社,2005:1763.编辑　王雪萍。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910388278.3(22)申请日 2019.05.10(71)申请人 上海瑞宙生物科技有限公司地址 201210 上海市浦东新区中国(上海)自由贸易试验区高科中路1976号1幢B201室(72)发明人 何平　祝先潮　吴运强　刘畅　杜娟　(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332代理人 巩克栋(51)Int.Cl.C12N 7/00(2006.01)C12N 9/18(2006.01)C12N 15/70(2006.01)A61K 35/76(2015.01)A61K 38/46(2006.01)

A61P 31/04(2006.01)

(54)发明名称一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用(57)摘要本发明提供了一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用，所述噬菌体命名为SH-KP152302，具有降解生物被膜的特性，噬菌体的基因组的第42位开放阅读框编码解聚酶，能够特异性降解肺炎克雷伯菌的胞外荚膜多糖，抑制生物被膜的形成，去除生物膜，并在抵抗生物膜的形成过程中表现出剂量依赖的活性，可以作为一种潜在的抗生素替代品。

权利要求书1页 说明书9页序列表5页 附图5页

CN 110079508 A2019.08.02

CN 110079508 A1.一种肺炎克雷伯菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体的基因组的第42位开放阅读框编码解聚酶。2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述肺炎克雷伯菌的wzi分型为K47荚膜型；优选地，所述噬菌体的基因组包括至少28个功能基因。3.一种如权利要求1或2所述的肺炎克雷伯菌噬菌体的分离方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)向污水中加入肺炎克雷伯菌，培养后收集上清液；(2)将上清液点斑于双层琼脂平板上，纯化后得到单一斑块；(3)向单一斑块中加入缓冲液，搅拌后静置，收集液体和上层琼脂；(4)离心取上清，采用PEG-8000富集，氯化铯密度梯度离心1h，得到噬菌体颗粒。4.一种如权利要求1或2所述的噬菌体表达的解聚酶，其特征在于，所述解聚酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；优选地，所述解聚酶的结构域包括T7噬菌体尾丝蛋白、果胶酸裂解酶、含氮氧化酶和右手β螺旋结构域；优选地，所述解聚酶为85kDa。5.编码如权利要求4所述的解聚酶的核酸序列；优选地，所述核酸序列如SEQ ID NO:2所示。6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求5所述的核酸序列。7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求5所述的核酸序列和/或如权利要求6所述的表达载体。8.一种如权利要求4所述的解聚酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1’)采用如SEQ ID NO:3-4所示的引物对，从噬菌体的基因组中扩增得到第42位开放阅读框，并在扩增产物的两端引入SacI和HindIII的限制性位点；(2’)将扩增产物插入pSUMO3的SacI和HindIII酶切位点，转化入大肠杆菌，氨苄青霉素抗性筛选得到重组菌株，并进行IPTG诱导表达；(3’)将表达产物进行组氨酸纯化后得到SUMO-解聚酶融合蛋白，加入SUMO蛋白酶，得到所述解聚酶。9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括解聚酶；优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。10.一种如权利要求1或2所述的噬菌体、如权利要求4所述的解聚酶、如权利要求5所述的核酸序列、如权利要求6所述的表达载体、如权利要求7所述的宿主细胞或如权利要求9所述的药物组合物在制备肺炎克雷伯菌抑制剂、治疗肺炎克雷伯菌感染药物、抗生素替代制剂或消毒剂中的应用。