当前位置：文档之家 › 转基因小鼠肿瘤模型的研究进展

转基因小鼠肿瘤模型的研究进展

  • 格式：doc
  • 大小：612.00 KB
  • 文档页数：7

下载文档原格式

  / 7

合集下载

乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠模型的生物学特性及病理学研究

乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠模型的生物学特性及病理学研究

乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠模型的生物学特性及病理学研究佘锦雯;亓翠玲;杨永霞;张敏;唐富天;吴晓云;张希敏;王尽淘;王丽京【摘要】目的研究乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠的生物学特性及病理学改变.方法 MMTV-PyMT小鼠饲养于SPF级环境中,观察小鼠的繁育情况.观察小鼠乳腺癌的数目、体积及生存率,研究MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的生物学特性.通过组织病理学切片,观察MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的病理学变化、肺转移情况、细胞增殖和血管形成情况.结果乳腺癌MMTV-PyMT小鼠已经成功繁育9代,共产仔约400只.小鼠乳腺9周即可触摸到肿瘤,并随着周龄的增加,肿瘤的数目逐渐增加,体积逐渐增大,最多可达10个;大部分11周出现肺转移;通常最长生存时间为15周.乳腺癌MMTV-PyMT小鼠为浸润性导管癌,PCNA免疫组化结果显示乳腺癌有较多的增殖细胞;vWF结果表明乳腺癌有明显的新生血管.结论乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠已被成功保种和扩群,可稳定自发性乳腺癌,其生物学特性和病理学改变与人乳腺癌相近,可作为研究乳腺癌发生发展的经典动物模型.%Objective To investigate the biological features of the transgenic mouse model and the pathological changes during its life span. Methods The MMTV-PyMT mouse raised in SPF conditions, and the mice breed was recorded everyday. Mast adenoma of MMTV-PyMT mice have been observed by counting and measuring the tumors, and H&E staining for pathological development. Results MMTV-PyMT mice were well bred in our lab for nine generations and totally 400 offspring were obtained. The tumor biological feature was obvious in MMTV-PyMT mice, palpable Mast adenoma occur in 9 week old and pulmonary metastasis was occur in 11 weeks old.Number and size of tumors increased when the mice grow up. Conclusions The MMTV-PyMT transgenic mouse model was well kept and bred, breart tumors can be spontaneuos stably. This can be a typical animal model for breast carcinoma research.【期刊名称】《广东药学院学报》【年(卷),期】2011(027)002【总页数】5页(P178-182)【关键词】乳腺癌;MMTV-PyMT转基因小鼠;动物模型;生物学特征;病理学改变【作者】佘锦雯;亓翠玲;杨永霞;张敏;唐富天;吴晓云;张希敏;王尽淘;王丽京【作者单位】广东药学院血管生物学研究所,广东,广州,510006;广东药学院血管生物学研究所,广东,广州,510006;广东药学院血管生物学研究所,广东,广州,510006;广东药学院血管生物学研究所,广东,广州,510006;广东药学院血管生物学研究所,广东,广州,510006;广东药学院血管生物学研究所,广东,广州,510006;广东药学院血管生物学研究所,广东,广州,510006;广东药学院血管生物学研究所,广东,广州,510006;广东药学院血管生物学研究所,广东,广州,510006【正文语种】中文【中图分类】R737.9;R965.1癌症是当今世界上引起死亡的一个重要因素,并且发病率有逐渐升高的趋势[1]。

肿瘤移植(TT)小鼠模型具体方法及步骤

肿瘤移植(TT)小鼠模型具体方法及步骤

肿瘤移植(TT)小鼠模型具体方法及步骤原型物种人来源黑色素瘤B16细胞导致的肿瘤肝转移及肺转移模式动物品系SPF级C57BL/6小鼠，健康，雄性，4~6W，体重为18g~20g。

实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组。

实验周期4-6 weeks建模方法恶性黑色素瘤(malignant melanoma MM)的发病率较低, 但恶性度高, 转移早而广泛，且对常规放疗有较强抗性，临床治疗颇为棘手，目前尚无有效的治疗方法，其常规治疗主要有免疫治疗、化疗、生物治疗、近距放射疗法和外束放射疗法等。

近年恶性黑素瘤发病率和死亡率明显上升，肿瘤侵袭及转移是其治疗失败的主要原因，很大一部分肿瘤病人在初治时已有微小的或潜在的转移病灶。

为了能彻底治愈癌症，控制肿瘤侵袭和转移是治疗的关键。

黑色素瘤B16细胞株是生长在C57BL/6小鼠耳根部的自发性肿瘤，C57BL/6小鼠的B16移植瘤和转移瘤模型是肿瘤研究的常用模型之一。

小鼠成瘤实验：取对数生长的细胞，胰酶消化后培养基重悬收集细胞，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞密度备用。

选用C57BL/6J 小鼠建立B16 细胞肿瘤转移模型，每组10 只。

试验组小鼠尾静脉注射浓度为5×10 6 /L 的B16 细胞悬液0.1ml，每组于接种细胞次日起腹腔注射药物，10 日后改为隔日注射一次。

于第21天，处死动物，取肝脏及肺组织，解剖镜下计数转移的结节数量，数码相机拍照，并对各组小鼠肺转移结节的数目进行统计学分析。

应用肿瘤转移疾病模型模型评价各组小鼠尾静脉注射接种肿瘤细胞后，生长良好，体重无明显变化，组间无明显差异。

第21 天时处死小鼠，取肝脏及肺组织，解剖镜下观察，可发现肝脏及肺组织有明显转移的结节。

解剖镜下计数转移的结节数量，可见给药组小鼠肝脏及肺结节数目明显低于阴性对照组。

取材：1.实验结束后每组取肝组织、肺组织和肿瘤组织，每个组织从瘤体中央分为2份，一份置于甲醛固定；另一份液氮冷冻置于-80度保存，用于分子生物学和WB检测等等。

黑色素瘤小鼠模型研究进展

黑色素瘤小鼠模型研究进展

2021年2月第31卷　第2期中国比较医学杂志

CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINEFebruary,2021Vol.31　No.2

王峥,苗晋鑫.黑色素瘤小鼠模型研究进展[J].中国比较医学杂志,2021,31(2):120-127.WangZ,MiaoJX.Thecurrentstateofmousemodelinginmelanomaresearch[J].ChinJCompMed,2021,31(2):120-127.

doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2021.02.019

[基金项目]河南中医药大学科研启动经费(RSBSJJ2018-36);河南中医药大学实验室建设与人才培养(38103009-2020-2);河南省高等学校重点科研项目(21A360021)。[作者简介]王峥(1996—),女,硕士研究生,主要从事过敏性疾病及动物模型的研究。E-mail:150****1835@163.com[通信作者]苗晋鑫(1986—),男,博士,助理研究员,主要从事转基因动物及肿瘤防治研究。E-mail:jinxin.miao@yahoo.com

黑色素瘤小鼠模型研究进展王　峥,苗晋鑫∗(河南中医药大学,中医药科学院,郑州　450000)

【摘要】　黑色素瘤占皮肤恶性肿瘤的第三位,由于其发病率和死亡率增加迅速,已成为全球健康负担。与其

他恶性肿瘤相比,黑色素瘤治疗的总体成功率仍然是最差的之一。动物模型是研究其发病机制、预防、治疗方案并鉴定潜在治疗靶点及生物标志物的重要工具。黑色素瘤小鼠动物模型可以分为诱发性模型、移植性模型、转基因模型。然而,没有一种黑色素瘤小鼠模型与人类疾病一致。本文总结近20年黑色素瘤小鼠模型研究,总结和比较黑色素瘤小鼠模型的制备、优缺点及适用范围,为优化黑色素瘤小鼠模型与药物和疫苗评价提供了有价值的资料,可资借鉴。【关键词】　黑色素瘤;动物模型;诱发性;转基因;移植性【中图分类号】R-33 【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856(2021)02-0120-08

小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意义的研究

小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意义的研究

小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意义的研究项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【摘要】目的:探讨用肝癌H22细胞建立小鼠肝癌原位移植模型.方法:将肝癌H22细胞注入小鼠腹腔内,建立异位移植模型;抽取腹水中癌细胞接种于小鼠肝实质内,建立原位移植模型.结果:移植后10d可扪及肿瘤生长,模型成功率94.4％;晚期自发转移率79.4％,腹水产生率35.3％,无自发消退;移植瘤保持甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(DCP)高分泌及γ-氨基酰转氨酶(γ～GT)同工酶阳性的特点;模型平均自然生存期28d.结论:小鼠肝癌原位模型成功率高,易于制作,生物学特征符合模拟人类肝癌在体内发生发展的全过程,可成为今后人类研究肝癌的重要动物模型.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2015(038)006【总页数】2页(P48-49)【关键词】肝癌;H22细胞;原位移植模型;小鼠【作者】项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【作者单位】佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003【正文语种】中文【中图分类】R735.7肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，因其发病率高、恶性程度高、死亡率高，素有“癌中之王”的称号[1]。

目前已有大量研究为肝癌临床的治疗提供基础依据，而肝癌动物模型一直是肝癌临床与基础研究工作的重要工具。

目前有关人肿瘤转移模型大多是用裸大鼠、裸小鼠,动物肿瘤则多数是用Wistar或SD大鼠建立的,而用小鼠建立原位肿瘤移植模型国内外报道较少。

小鼠作为一种更经济，易饲养，易获得的实验研究载体，在发挥其普遍应用性方面有着重大的作用。

小鼠肝癌原位移植模型作为一种新型的动物模型是否能更好地模拟人肝癌在体内发生、发展、侵袭及转移的过程，本实验将研究报道如下。

小鼠结肠癌肝转移模型的构建

小鼠结肠癌肝转移模型的构建

小鼠结肠癌肝转移模型的构建杨扬;李乃卿【摘要】目的建立适合基因表述谱研究的小鼠结肠癌肝转移模型.方法将小鼠结肠癌细胞(C26)悬液接种于BALB/C小鼠脾内,分为切脾组和保脾组,观察小鼠生存时间及腹腔内肿瘤生长情况.结果切脾小鼠自然生存期11～15d,平均(13.05±0.71)d,保脾小鼠自然生存期9～15d,平均(11.64±1.49)d.小鼠肝脏转移率均为100%.切脾小鼠肝各叶完全被肿瘤占据,保脾小鼠脾内肿瘤巨大,肝内转移多为散在的米粒大小瘤结节转移.结论用于基因表达谱研究的小鼠结肠癌肝转移模型应采用脾内注射切脾法.【期刊名称】《中国医药指南》【年(卷),期】2010(008)017【总页数】2页(P53-54)【关键词】结肠癌;肝转移;动物模型【作者】杨扬;李乃卿【作者单位】广东省中山市人民医院,528400;北京中医药大学东直门属医院,100700【正文语种】中文【中图分类】R-332随着分子生物学的深入研究，基因芯片作为基因组及后基因组时代的主要研究技术，已成为揭示药物作用机制的重要方法。

基因芯片检测技术的前提是成功而适用的动物模型，首先需要获得足够的RNA检测量，所以成功的造模方法是研究课题成败的关键所在。

下面就我们近期进行的结肠癌肝转移的造模方法总结如下。

1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物4～6周龄体质量20～24g的BALB/C小鼠雄性（♂）81只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：京动许字（2000）第004号总049号，在Ⅱ级动物实验室饲养。

1.1.2 瘤株小鼠结肠癌C26细胞株（美国引进，广安门医院肿瘤实验室惠赠）。

经3次皮下接种传代后，无菌条件下摘取瘤体，生理盐水洗涤，剪成小块，匀浆，离心后取沉淀，反复3次，培养于10%新生牛血清和RPMI1640培养液（含青霉素100U/mL、链霉素100U/mL），置37℃、含5%CO2培养箱中3d，每日换液。

基于Cre-LoxP系统构建一种新的时间特异性突变NLRP3转基因小鼠模型

基于Cre-LoxP系统构建一种新的时间特异性突变NLRP3转基因小鼠模型

网络出版时间：２０２３－０３－１０１０：２２：５５　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３０３０８．１８１０．０５６．ｈｔｍｌ◇实验方法学◇基于Ｃｒｅ ＬｏｘＰ系统构建一种新的时间特异性突变ＮＬＲＰ３转基因小鼠模型杨熙癑，周永婷，叶菜英，朱　蕾（中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院药理系，北京　１００００５）收稿日期：２０２２－１０－１２，修回日期：２０２２－１２－２１基金项目：中国医学科学院医学与健康科技创新工程（Ｎｏ２０２１ Ｉ２Ｍ１ ００５，２０１６ Ｉ２Ｍ １ ００２）；中国医学科学院医学表观中心基金（Ｎｏ２０１７ＰＴ３１０３５，２０１８ＰＴ３１０１５，２０１９ＰＴ３１００１７）作者简介：杨熙癑（１９９８－），女，硕士生，研究方向：抗炎免疫药理学，Ｅ ｍａｉｌ：ｙａｎｇｘｉｙｕｅ１０１９＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ；朱　蕾（１９７９－），女，博士，教授，博士生导师，研究方向：抗炎免疫药理学，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｌｅｉｚｈｕ２００４＠１２６．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０７０２４文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０３－０５９４－０５中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３６３ ３３２；Ｒ３６４ ５；Ｒ３９４ ２摘要：目的　应用Ｃｒｅ ＬｏｘＰ系统构建一种新的时间特异性ＮＬＲＰ３点突变转基因小鼠模型并对其进行鉴定。

方法　利用Ｃｒｅ ＬｏｘＰ技术，构建ＮＬＲＰ３基因Ｔ３４６Ｍ点突变的ｆｌｏｘ杂合子（ＮＬＲＰ３ｆｌｏｘ／＋）小鼠。

将该小鼠与广谱表达Ｃｒｅ重组酶工具鼠（ＣＡＧ Ｃｒｅ／ＥＲＴ２，ＣｒｅＴ）杂交繁育，获得基因型ＮＬＲＰ３ｆｌｏｘ／＋ＣｒｅＴ＋／－小鼠，后者与ＮＬＲＰ３Ｔ３４６Ｍ的ｆｌｏｘ纯合子（ＮＬ ＲＰ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）小鼠进一步交配获得ＮＬＲＰ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＣｒｅＴ＋／－（ＫＩ／ＫＩ）和ＮＬＲＰ３ｆｌｏｘ／＋ＣｒｅＴ＋／－（ＫＩ／ＷＴ）小鼠，于６～８周时经他莫昔芬的诱导实现ＮＬＲＰ３Ｔ３４６Ｍ突变基因的时间特异性敲入。

基因敲除小鼠技术

基因敲除小鼠技术

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。

尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。

同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

转基因动物应用的研究现状与发展前景

转基因动物应用的研究现状与发展前景

3、生物反应器：转基因动物可以作为生物反应器，生产具有重要价值的生 物制品，如药物、工业原料等。
然而，要实现这些目标，还需要在政策、技术和社会接受度等方面取得更多 的支持。
三、关键技术
转基因动物应用的关键技术包括基因编辑技术和合成生物学等。基因编辑技 术可以通过对动物基因进行精确的改造，实现对动物性状的改良。合成生物学则 通过设计和构建新的生物部件，实现对动物基因组的全面改造。这些技术的不断 发展，为转基因动物的应用提供了更多的可能性。
结论
总的来说，转基因动物的发展前景是广阔的。虽然仍存在一些技术和社会层 面的挑战，但随着科技的不断进步和应用的深入挖掘，转基因动物将在未来生物 科技领域发挥越来越重要的作用。通过国际合作、政策推动和公众教育，我们可 以期待转基因动物在未来的发展中实现更多的突破和创新。
引言
转基因动物研究是生物技术领域的一项重要前沿课题，旨在通过改变动物的 遗传信息来提高其性能、增强其抗性或用于疾病治疗等。随着科学技术的不断进 步，转基因动物研究取得了显著的成果，从提高畜禽生产效率到治疗人类疾病等 方面，转基因动物都有着广泛的应用前景。本次演示将介绍转基因动物的研究进 展及未来发展趋势。
为了实现这些目标，需要科研人员继续深入研究转基因动物的机制和安全性 问题，并加强国际合作和技术交流。同时，需要制定更加科学、严格的法规和伦 理指导原则，以确保转基因动物研究的安全性和可持续性。
结论
转基因动物研究是生物技术领域的一项重要技术，具有广泛的应用前景和巨 大的价值。在过去的几十年中，科研人员已经在提高畜禽生产性能、增强抗性、 构建疾病模型等方面取得了显著的成果。然而，仍需转基因动物的安全性、法规 和社会接受程度等问题。未来，随着科研技术的不断进步和法规体系的不断完善， 转基因动物研究将有望为人类社会的发展做出更加重要的贡献。

转基因超级鼠的结论

转基因超级鼠的结论

转基因超级鼠的结论转基因技术是一种现代生物技术，通过人工干预生物基因组的方法，使得生物体的某些性状得到改变。

近年来，转基因技术被广泛应用于农业、医疗、环保等领域，其中最受关注的便是转基因食品。

然而，在科学家们的努力下，转基因技术的应用范围正在不断拓展，最新的研究成果之一就是“转基因超级鼠”。

转基因超级鼠是指经过基因改造的实验室小鼠，这些小鼠拥有超强的免疫力和抗肿瘤能力，能够对人类疾病的研究提供重要的帮助。

在这里，我们将探讨转基因超级鼠的研究成果以及其应用前景。

一、研究成果转基因超级鼠的研究始于上世纪90年代，当时科学家用基因工程技术将人类免疫系统的基因导入小鼠体内，使其免疫系统得到增强。

随着技术的不断提高，研究人员陆续开发出了多种转基因超级鼠，包括抗癌鼠、抗病毒鼠、人类免疫系统移植鼠等。

最近，一项名为“人类免疫系统移植鼠”的研究引起了广泛关注。

研究人员通过基因工程技术将人类免疫系统的基因导入小鼠体内，使其免疫系统与人类相似。

这些转基因超级鼠可以用于研究人类疾病的发病机制、疾病的治疗方法等问题。

此外，研究人员还利用转基因技术制造出了一种名为“肿瘤猎手”的超级鼠。

这种转基因超级鼠的免疫系统能够识别和攻击肿瘤细胞，从而有效抑制肿瘤的生长和扩散。

这项研究成果被认为是一种革命性的癌症治疗方法。

二、应用前景转基因超级鼠的出现，为人类疾病的研究和治疗提供了新的思路和方法。

这些转基因超级鼠可以用于研究癌症、病毒感染、自身免疫性疾病等多种人类疾病，为疾病的早期诊断和治疗提供了有力的支持。

此外，转基因超级鼠还可以用于药物研发和安全性评价，为新药的开发提供了有力的保障。

除了在医学领域的应用，转基因超级鼠还可以用于环境保护。

例如，利用转基因技术制造出的超级鼠可以用于检测环境中的有毒物质，为环境监测提供了新的方法。

然而，转基因技术的应用也面临着一些争议和挑战。

首先，转基因技术可能对生态环境造成不可逆的影响，从而引发生态风险。

抑癌基因PTEN转基因小鼠的构建及表型初步分析_李洪昌

抑癌基因PTEN转基因小鼠的构建及表型初步分析_李洪昌

.
形成多种肿瘤 要作用!
［024 01 ］
中国生物工程杂志 !"#$% &#’()*"$’+’,!./0. 年， Y%E*#% 等［0Z］ 对 =>?@ 转
X’+8 21 @’8 3 ./01
小鼠) 置于高压灭菌后的 08 1D+ 离心管底!取 0// "+ 鼠 ./ "D’+ 9 [ ?5>F) 加 尾裂解液 F 液( .1 DD’+ 9 [ @%6a， N1c 水浴 O/D#$ ， 入离心管， 加入 0// "+ 鼠尾裂解液 & !+ ) ， 2 ///E 9 D#$ 离 心 液( O/ DD’+ 9 [ >E#B4 震 荡 ./ 次， 0/D#$ ， 取 S/ "+ 上清作为 5@F 模板， 用于 =!G 鉴定， 同 时选取野生型 !1S&[ 9Z 小鼠基因组 5@F 作为阴性对 1Zc 照!反应条件: NOc 预变性 2 D#$ ; NOc 变性 2/B， S.c 延伸 2/B， 21 个循环， 退火 2/B， 最后 S.c 延伸 0/ D#$ ! =!G 产物用 08 1d 琼脂糖凝胶电泳检测!=>?@" *’$(E’+ 的扩增片段大小分别为 OOZ ;A " 0N. ;A ! 08 .8 2 胚胎成纤维细胞的分离与培养 取妊娠期 0. 天的孕鼠为实验材料， 颈椎脱臼法处死孕鼠， 放于盛有 S1d 酒精的烧杯中消毒， 拿到超净工作台上解剖! 取 出子宫， 置于装有 =&_ 的培养皿中洗去表面血迹， 随后 取出胎鼠， 在 =&_ 中洗涤数次! 去除头" 尾" 内脏和四 肢， 仅留躯干部 ( 尾与四肢用于提取基因组 5@F 进行 基因型鉴定 ) ， 在 =&_ 中充分漂洗， 去除红细胞! 在新 的培养皿中加入少量 =&_ ， 放入躯干， 用眼科剪刀剪成 0DD2 以下的组织块碎片! 加入 1D+ /8 .1d 胰蛋白酶， 培养箱中消化 01D#$ ， 消化结束后加入等体积的 K?H K)C#ID［ 0/d 胎 牛 血 清，双 抗 ( 青 霉 素 9 链 霉 素 ) ， . DD’+ 9 [ [4 ,+I(%D#$)， 0d @?FF］ 终止消化反应， 轻轻吹 0///E 9 D#$ ， 打， 使细胞分散! 将收集的细胞悬液离心， OD#$ ， 弃上清， 加入红细胞裂解液 ( 1 倍体积的细胞体 积) ， 轻轻吹打 0D#$ ， 离心除上清!重悬细胞， 过滤( .// 目筛 网 ) 并 收 集 滤 液， 再 次 离 心， 去 上 清! 用 K?H K)C#ID 洗涤沉淀， 离心除上清， 重悬细胞， 铺板! 置于 2Sc 1d !6. 饱和湿度培养箱中培养! 第二天换液， 随后每 . 天换液一次! 培养 . b OC 后， 当 K?H 接近汇 合， 即可按 0e 2 的比例传代培养! 08 .8 O 克隆形成实 验 取 对 数 生 长 期 的 >Y 与 L> K?H 细胞， 分别用 /8 .1d 胰蛋白酶消化并吹打成单个 细胞， 并把细胞悬浮在 0/d 胎牛血清的 5K?K 培养液 中备用!每组细胞均以每孔 0/// 个细胞的浓度分别 接种于含 2Sc 预温培养液的 0. 孔板中! 轻轻转动， 使 1d !6. 及饱和湿度的细胞培 细胞分散均匀!置 2Sc ， 养箱中培养! 经常观察， 当培养皿中出现肉眼可见的 克隆时， 终 止 培 养! 弃 去 上 清 液， 用 =&_ 小 心 浸 洗 . 次!加 Od 多聚甲醛固定细胞 01D#$ ! 然后去固定液， 加 1// "+ 的 /8 0d 结晶紫染色液， 静置 ./D#$ ， 然后用流 水缓慢洗去染色液， 空气干燥! 08 .8 1 L)B()E$ ;+’((#$, 检测 =>?@ 在转基因小鼠中的

转移性乳腺癌建模

转移性乳腺癌建模
转基因小鼠 （转移性乳腺癌建模）
1.ERBB2/NEU transgenic models （类似于人类HER2+乳腺癌）
ERBB2(也称为HER2和大鼠同源基因Neu)属于EGFR家族。
由Leder实验室和Jolicoeur实验室研究发现的转基因小鼠表达一种MMTV启
动子控制下激活Neu基因的老鼠，这种转基因小鼠能帮助阐明ErbB2过表达在 乳腺肿瘤发生中的作用。 MMTV-neu转基因小鼠发生局灶性乳腺肿瘤，潜伏期8- 12个月，随后发生肺 转移。 激活Neu的过表达可能足以有效地转化转基因小鼠的乳腺上皮细胞。
但肿瘤仍可观察到。此外,雌激素受体α -null老鼠肿瘤形成延迟潜伏期增加。
与另一种致癌基因成纤维细胞生长因子3 (FGF3)合作，Wnt-1显示出更高的 致瘤能力。
Wnt肿瘤具有肿瘤血管生成的上调。
p53突变的MMTV-Wnt1yVmT transgenic models
Wnt
在跨膜区域有缬氨酸-谷氨酸置换的大鼠中观察到Neu的本构激活。这种突变稳 定了受体的二聚作用，导致酪氨酸激酶的本构性活性。值得注意的是，在人类 ERBB2阳性乳腺癌中还没有检测到类似的激活突变，其中野生型ERBB2主要通 过基因扩增过度表达。因此，使用野生型neu生成了更接近人类乳腺癌的转基 因模型。 在MMTV或WAP启动子的转录控制下表达ErbB2的转基因小鼠说明了ErbB2在 诱导乳腺肿瘤中的重要性。然而，这些强启动子的使用会导致ErbB2表达的非 生理水平升高。 Akt丢失影响MMTV-Neu小鼠模型肿瘤的发展。
在MMTV-Neu转基因小鼠中，使用β-半乳糖苷酶报告基因，ß-catenin / TCFdependent转录升高。
2. Wnt-1 transgenic models

小鼠肿瘤模型 (1)

小鼠肿瘤模型 (1)

肿瘤模型我们一般常用的就是小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。

其中用得最多的是皮下模型，另外还有腹水（或者尾静脉注射）以及原位模型，其他的模型很少用，就不提他们了。

小鼠模型分三大类：第一类是以S180、EAC、H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用KM，可产生腹水，也可在皮下成瘤。

多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接踵后第二天开始给药，给药7到10天，接种10天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。

1. 关于构建瘤种可以用体外细胞株培养后，用PBS悬浮至1~3×106/mouse，接种即可，最好用6号左右的针头，就是常用的2ml一次性注射的针头。

2. 关于腹水传代观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约8~9天左右），可以传代，传代时取1ml注射器，用2ml 注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个就可以了，不用离心，直接用P BS3~6倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整，第二代以后，尽量6~7天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。

三代后可用于试验。

3. 关于接种进行试验这个时候抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。

然后进过一定的稀释后，接种到小鼠的腋下。

关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数。

接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。

接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。

TSC1转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究

TSC1转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究

TSC1转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究王红;蒋莉;王岩;许振凯;王威平;方航;孙鹏;白晓春【摘要】目的为探讨mTOR信号通路在骨骼发育过程中的机制作用,建立骨骼发育相关的TSC1转基因小鼠,提供稳定的动物模型.方法取8周龄健康清洁级TSC1flox/flox小鼠分别与肢芽干细胞特异性重组酶(Prx-1-Cre)小鼠、软骨细胞特异性重组酶(Col2al-Cre)小鼠及成骨细胞特异性重组酶(Osx-Cre)小鼠进行杂交.将繁殖出的小鼠继续与TSC1flox/flox小鼠回交,并对其子代小鼠的基因型进行鉴定及mTOR活性检测.结果杂交后分别获得肢芽干细胞特异性TSC1敲除小鼠、软骨细胞特异性TSC1敲除小鼠和成骨细胞特异性TSC1敲除小鼠各8只.与正常组比较,上述3种转基因小鼠p-S6均比正常组升高(P<0.05).结论本实验成功应用Cre/loxP系统构建肢芽干细胞特异性TSC1敲除小鼠、软骨细胞特异性TSC1敲除小鼠、成骨细胞特异性TSC1敲除小鼠,均提示mTOR活性增高,有明显TSC1敲除效果,为mTOR信号通路研究骨与软骨发育的机制作用提供实验基础.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2019(023)007【总页数】6页(P1239-1244)【关键词】基因敲除小鼠;骨发育;TSC1;mTOR信号通路【作者】王红;蒋莉;王岩;许振凯;王威平;方航;孙鹏;白晓春【作者单位】南方医科大学附属第三医院,广东广州 510630;广东省骨科研究院,广东广州 510630;广东省骨科医院,广东广州 510630;吉林大学第一医院急诊科,吉林长春 130021;吉林大学中日联谊医院科学研究中心,吉林长春 130033;南方医科大学,广东广州 510515;南方医科大学,广东广州 510515;南方医科大学附属第三医院,广东广州 510630;广东省骨科研究院,广东广州 510630;广东省骨科医院,广东广州 510630;中山大学肿瘤防治中心麻醉科,广东广州 510060;华南肿瘤学国家重点实验室广东广州 510060;肿瘤医学省部共建协同创新中心,广东广州 510060;南方医科大学附属第三医院,广东广州 510630;广东省骨科研究院,广东广州510630;广东省骨科医院,广东广州 510630;南方医科大学,广东广州 510515【正文语种】中文【中图分类】Q786结节性硬化复合物1(Tuberous sclerosis complex1,TSC1)，是人类的一种抑癌基因，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(The mammalian target of rapamycin，mTOR)有着密切的联系。

裸鼠的肿瘤移植模型研究

裸鼠的肿瘤移植模型研究

裸鼠的肿瘤移植模型研究肿瘤是一种常见的疾病，也是医学研究的一个重要领域。

随着科学技术的不断发展，人们对肿瘤的认识也在不断深入。

其中，裸鼠的肿瘤移植模型研究是一种常用的实验手段。

一、裸鼠是什么裸鼠是一种没有毛发的实验小动物，通常被用来进行肿瘤移植研究。

这种小动物一般来自人工培育的遗传变异株，因为它没有毛发，所以被称为裸鼠。

这种小动物体型小、活力强，非常适合作为实验对象。

二、肿瘤移植模型的意义肿瘤移植模型是一种通过将人类肿瘤细胞移植到裸鼠体内来模拟肿瘤生长和发展的实验方法。

这种实验方法能够为生物医学研究人员提供宝贵的研究材料，用于发现和开发新的抗肿瘤药物和治疗方法。

同时，肿瘤移植模型还能够为临床医学研究提供重要的参考，帮助医生们更好地了解肿瘤生长和发展的规律，找到控制肿瘤的有效方法。

三、裸鼠肿瘤移植模型的基本步骤1. 建立肿瘤细胞株首先，需要建立一种稳定的肿瘤细胞株。

一般来说，肿瘤细胞株可以从患者的体内或者文献报道中获取，然后通过培养和筛选，筛选出能够稳定生长的肿瘤细胞株。

2. 准备裸鼠裸鼠一般都需要进行体表消毒和饲养管理等操作。

在进行实验前，需要将裸鼠的体表消毒，避免外来细菌对实验结果的影响。

此外，裸鼠的饲养、环境、温度、湿度等也需要进行精心管理，确保实验的准确性和有效性。

3. 移植肿瘤细胞将准备好的肿瘤细胞接种到裸鼠的体内，一般是通过皮下注射或者腹腔注射的方式进行。

移植后，需要观察肿瘤的生长和发展情况，并及时进行处理、剖解和测量等操作。

四、裸鼠肿瘤移植模型的优缺点优点：1. 易于建立：裸鼠的肤色和体毛特征明显，容易观察，建立肿瘤移植模型相对容易。

2. 可控性强：通过各种手段可以有效控制实验的变量，确保实验结果的可靠性和准确性。

3. 结论可靠：通过对裸鼠肿瘤移植模型的研究，可以得到比较可靠的实验结论，从而为后续的研究提供重要参考。

缺点：1. 模拟程度低：由于裸鼠与人体存在较大的生物学差异，因此在某些肿瘤特征的模拟程度上会存在一定的局限性。

呼吸道疾病的动物模型和研究进展

呼吸道疾病的动物模型和研究进展

呼吸道疾病的动物模型和研究进展呼吸道疾病是指影响呼吸系统的疾病，包括感染、慢性阻塞性疾病、肺癌等多种疾病。

为了更好地理解这些疾病的发病机制以及开发新的治疗方法，研究人员经常使用动物模型进行实验研究。

本文将介绍一些常用的呼吸道疾病动物模型，并探讨目前研究的进展。

一、哮喘动物模型哮喘是一种常见的呼吸道疾病，其特点为气道高反应性以及慢性炎症。

研究人员通常使用小鼠和大鼠作为哮喘的动物模型。

通过暴露动物于过敏原或特定化学物质，可以诱导气道炎症和收缩，进而模拟哮喘的临床症状。

此外，基因敲除技术也被广泛应用于哮喘模型的研究。

通过敲除特定基因，在动物体内还原或加强特定信号通路的功能，进一步研究哮喘的分子机制。

二、肺纤维化动物模型肺纤维化是一种由异常的修复反应导致的慢性肺部疾病，其特点为肺组织中纤维结缔组织的过度沉积。

大多数研究都使用小鼠模型来研究肺纤维化。

通过暴露动物于特定致纤维物质，如漫酸胺，或使用基因调控技术，可以诱导肺纤维化的发生。

研究人员还利用转基因小鼠模型，敲除或过表达与肺纤维化相关的基因，来研究这些基因在疾病发生发展过程中的作用。

三、肺癌动物模型肺癌是一种恶性肿瘤，其发生与多种因素相关，如吸烟、空气污染以及遗传因素等。

研究人员使用多种动物模型来研究肺癌的发生机制和潜在治疗方法。

小鼠模型是最常用的肺癌模型之一。

通过基因工程技术，研究人员可以敲除或过表达与肺癌相关的基因，在小鼠体内模拟肺癌的发生。

此外，近年来越来越多的研究开始探索犬或猫等动物作为肺癌模型的应用，这些动物的肺癌具有与人类肺癌相似的遗传和生物学特征，为肺癌的研究提供了新的途径。

此外，除了上述常见的呼吸道疾病动物模型，还有其他动物模型用于研究诸如COPD（慢性阻塞性肺病）、肺衰竭等疾病。

这些动物模型的使用有助于更好地理解呼吸道疾病的发病机制，并且为寻找新的治疗方法提供了重要线索。

总结起来，呼吸道疾病的动物模型对于了解疾病的发病机制、开发新的治疗方法以及评估潜在的药物疗效具有重要意义。

分析野生型p53转基因小鼠对移植肿瘤的感受性

分析野生型p53转基因小鼠对移植肿瘤的感受性

分析野生型p53转基因小鼠对移植肿瘤的感受性
谢卫兵;陈汉源;余焱林;曾位森;罗琛
【期刊名称】《解剖科学进展》
【年(卷),期】1997(0)3
【摘要】分析野生型ｐ５３转基因小鼠对移植肿瘤的感受性谢卫兵陈汉源余焱林曾位森罗琛（第一军医大学组胚教研室细胞生物学实验室）野生型ｐ５３为隐性抑癌基因，限制细胞分裂增殖，阻遏细胞转化和动物致瘤。

相反地突变型ｐ５３丧失原有功能，成为显性致癌基因，现已查明约有一半...
【总页数】2页(P32-33)
【关键词】转基因;移植肿瘤;野生型p53;小鼠;受精卵;感受性;隐性抑癌基因;透明质酸;促性腺激素;基因打靶
【作者】谢卫兵;陈汉源;余焱林;曾位森;罗琛
【作者单位】第一军医大学组胚教研室细胞生物学实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R-332
【相关文献】
1.前列腺癌研究模型的进展：从转基因小鼠到肿瘤异种移植模型 [J], 黄月皎;陈苗苗;吕秀芳;张永辉;张冲
2.人脑肿瘤组织块裸小鼠原位移植方法研究及移植瘤的亲本特征分析 [J], 王中勇;刁艺;黄强;李如军;吴自成;王爱东;董军;兰青
3.显微注射法建成野生型p53转基因小鼠 [J], 谢卫兵
4.单倍体相合细胞移植诱发小鼠移植物抗肿瘤效应的分析 [J], 林浩;叶韵斌;李晓峰;陈强
5.人α-甘露糖苷酶Man2c1转基因对移植性肿瘤在小鼠体内生长和转移的影响[J], 蒋东东;朱立平;刘玉琴;顾蓓;向志光;田云;周异群;鞠吉雨;刘音;张连峰
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

小鼠人源化模型的建立及其应用

小鼠人源化模型的建立及其应用

小鼠人源化模型的建立及其应用近年来，疾病研究领域的新突破源源不断，而其中小鼠人源化模型的建立和应用更是备受关注，成为当前研究的重要方向。

本文将简要介绍小鼠人源化模型的建立方法及其应用，以期为相关科研人员提供帮助。

一、小鼠人源化模型的建立方法人体疾病的研究中，经常需要研究许多保护机制、生化通路和药物效果等重要的生理过程。

而小鼠人源化模型的建立方法主要分为以下两种。

1、转基因小鼠转基因小鼠即通过外源性基因转移技术，将人类基因植入小鼠的基因组中，使其具有与人体相似的生理功能和代谢途径。

这种方法可以实现体内药效评价，例如癌症药物的耐受性测定。

2、人源化小鼠人源化小鼠是将人体的组织和细胞植入到小鼠体内，从而实现人体功能的模拟。

这种方法可以有效模拟肝、胰岛、中枢神经系统等人体组织和器官，用于药物毒理学和人体生理学研究中。

二、小鼠人源化模型的应用1、药物筛选小鼠人源化模型可用于新药物的筛选，通过比较小鼠人源化模型与人体组织的相似度，使药物的疗效得到更客观的评估。

不仅能够预测药物的药效，还可以预测药物的毒性，避免药物的不良反应。

2、疾病研究小鼠人源化模型可以模拟大部分人类疾病，例如肿瘤、血液病、感染病等。

通过对小鼠人源化模型的研究，可以更好地理解疾病的发病机制并寻求新的治疗方法。

3、再生医学小鼠人源化模型可以应用于再生医学的研究，如实现胰岛细胞的移植、肝细胞的再生等。

通过小鼠人源化模型的建立，可以更好地探究人体的再生机制，有望为再生医学的发展提供新的思路和方法。

4、医学教育小鼠人源化模型可以用于医学教育中，帮助医学生更好地理解疾病的发病机制和药物治疗的实践。

通过模拟人体生理状况，医学生可以更好地理解并应用相关医学知识。

三、小鼠人源化模型的局限性小鼠人源化模型具有许多优点，但其中也存在一些局限性。

例如，在转基因小鼠中，不同基因的作用和相互作用需要进一步研究。

在人源化小鼠中，人体组织在小鼠体内的存活时间和制备难度也是局限性之一。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

1 转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂， 侯晓骏 [摘要] 动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常

规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词] 肿瘤，小鼠模型，转基因

肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。

1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag 转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP 2

启动子和SV40 大T 抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA 突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML) 的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl 和crkl 双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl 参与了bcr-abl 所致的白血病。尽管相关的研究已经很多，然而常规转基因本身固有的缺陷如基因拷贝数的不可控性（因为是在小鼠胚胎时期植入转基因，所以无法知晓其复制的数目）以及转入的基因整合在宿主基因组的位点随机性增加了其表型分析的难度，因此现在已较少单独采用常规转基因技术来制作肿瘤动物模型。 2．可诱导表达的转基因（inducible transgene expression） 常规转基因技术通过特定启动子的选择实现了转基因的组织特异性表达，在此基础上，人们又开发了许多可诱导表达模型用以调控基因表达的时相。目前，最常用的是反式因子rtTA与四环素衍生物强力霉素结合后激活四环素操纵子表达的方法（tet-on），而tTA与强力霉素结合则起抑制四环素操纵子表达的作用7（tet-off）。这样，tet-on转基因小鼠可以通过摄入四环素的方法激活癌基因的表达；tet-off转基因小鼠则持续表达癌基因，直至因强力霉素的摄入而被特异性抑制。应用此系统已构建了可诱导性Hras-G12V小鼠黑色素瘤8,c-myc可诱导表达T细胞淋巴瘤9等肿瘤模型。Fisher等10利用四环素诱导系统建立了在肺细胞定向表达、带有K-Ras4b(G12D)癌基因的小鼠模型。在此种转基因小鼠饮食中加入强力霉素，诱导癌基因K-Ras表达，7天后肺细胞增生，2个月后小鼠肺组织中相继形成腺瘤、腺癌，并向胸膜扩散。撤去强力霉素后，K-Ras mRNA水平急剧下降, 增生细胞和肿瘤细胞凋亡，3天后肿瘤肿块迅速缩小，1个月后检测不到肿瘤组织。 四环素诱导系统的优点在于可以对转基因的表达进行精确的调控，转基因的表达呈四环素药物剂量依赖性反应并可具有组织特异性，而只须停止给药就可恢复到对照条件。 3．基因打靶或基因删除(gene targeting) 从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。1981年Evans11等从小鼠胚胎中成功分离得到胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES)，即从着床前胚胎(孕3～5天)分离出内细胞团(Inner cell mass，ICM)细胞并摸索出维持其全能性的体外培养条件，在此基础上建立了胚胎干细胞技术。1984年，Bradly等12成功应用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。随后不久，同源重组现象被发现并很快用于内源性基因的精确修饰。1987年，Utah大学Kirk 13领导的研究小组根据同源重组的原理，实现了导入外源基因的定点整合，这一技术称为“基因打靶”。 基因打靶是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因目的的一种技术14。1988年，Mansour等15通过建立一套正负双选 3

择标记系统（PNS）来筛选基因组内同源重组正确发生的ES细胞克隆。该载体上含有正负选择基因各一，正选择基因为neo基因（neomysine），位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达；负选择基因为HSV-TK基因（herpers simplex virus-TK），在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端。同源重组时，TK基因将被切除而丢失，而在随机整合时，所有的序列（包括TK）均保留。（图1）当加入G418和GANC后，HSV-TK由于表达的胸苷激酶可使GCV（ganciclovir）转变为毒性氨基酸，使含此基因的转染细胞死亡。同源重组后，因HSV-TK基因位于构建的打靶载体目的基因同源序列之外，所以可用GCV来筛选随机整合的阳性克隆细胞。因此经过正负双选择系统的筛选可得到同源重组已发生的阳性克隆细胞。

图1 正负双选择标记系统 基因打靶技术的出现为在体内研究抑癌基因的功能提供了可能。基因敲除或称基因打靶，对象是胚胎干细胞（ES），注入ES细胞的基因片段与靶基因发生同源重组后可使该位点上的一个等位基因发生突变，携带有突变的等位基因的ES细胞重新注射到正在分裂的囊胚中，再移植到假受孕体鼠，其F1代产生的是嵌合体小鼠，近交F2代中就会产生纯合子后代。利用此方法，最先建立的抑癌基因动物模型是p53-/-小鼠16。P53-/-小鼠自发肿瘤发生早，且经化学致癌物诱发的肿瘤生长速度明显加快，这些结果提示p53具有抑癌功能。除p53基因外，相继建立的抑癌基因剔除小鼠模型还涉及Rb、Apc、Nf1和Nf2、Brcal和Brac2等基因17。p21、p16、p15等抑癌基因的突变也与多种恶性肿瘤的发生有着密切的关系，黑素瘤就是其中之一18。Shapiro19在实验中发现，p16缺失的NSCLC细胞株中出现Rb持续磷酸化，转染p16后恶性生长受到抑制，表明p16对肿瘤生长具有抑制作用。Sharpless20等发现，p16缺失的小鼠自发性或致癌物诱导性肿瘤的发生率明显增高。以上模型在应用于抑癌机理的探索过程中，常有出乎意料的结果，这可能是由于人和小鼠之间许多基本的生物学差别所造成。 4. 条件性基因打靶(conditional gene targeting) 常规的基因打靶技术无法控制靶基因的表达，外源基因的表达不具组织特异性，且许多抑癌基因的纯合缺失容易导致早期胚胎死亡。此外，在培养纯系小鼠的过程中，有些基因的互补效应也增加了表型分析的复杂性。而条件性基因打靶则是在常规的基因打靶基础上，利用重组 4

酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“开关”，从而使对小鼠基因组修饰的范围和时间处于可控状态。条件性基因打靶技术有效地克服了常规基因打靶的上述缺点，因而能更加真实地模拟体内抑癌基因的失活过程。

(图2)条件性打靶的示意图 条件性基因打靶的结果是使靶序列被删除或倒置。目前使用得最广的是噬菌体P1的Cre和酵母flp重组酶。它们分别识别34bp的LoxP和48bp的Frt位点。早在1983年，CoxMM就发现大肠杆菌内flp基因所表达的flp重组酶可以特异性地让其质粒DNA发生置换，此后人们利用这项发现开展了一系列条件性基因打靶研究。1993年，Gu等21以Cre-LoxP系统为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性，从而在LoxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰的目的(图2)。人们可以通过诱导剂给予时间预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制，以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。Johnson等22利用噬菌体Cre-loxP系统建立了在转基因小鼠肺组织中特异表达Ras基因的模型。此模型种，Ras癌基因一侧连接了LoxP单元和一个终止信号，并将其导入小鼠基因组中。只要终止信号存在, Ras基因就没有活性。当小鼠吸入一种含有Cre基因的重组腺病毒之后，腺病毒感染肺细胞，Cre基因与LoxP单元发生重组，LoxP单元与终止信号从Ras基因侧翼被切下, 失去终止信号的Ras基因就在腺病毒感染的肺细胞中表达了。通过控制吸入腺病毒的数量, 来控制Ras