RNA干扰及其应用

・１４６・　西南国防医药２００９年第１９卷第１期　

ＲＮＡ干扰的研究及其应用　

李媛　，杨举伦　，王丽　，陈明　，王力　，赵稳兴　，李学锋’　

（１．成都军区昆明总医院病理科，云南昆明６５００３２；２．昆明医学院研究生部，云南昆明６５００３１）　

关键词ＲＮＡ干扰；ｓｉＲＮＡ；应用　

中图分类号Ｒ　３４　文献标识码Ａ　文章编号１００４—０１８８（２００９）叭一０１４６—０３　

ＲＮＡ　ｒ扰是近几年才兴起的一种新技术，它是由双链核　

糖核酸引起的抑制基　表达的一种现象。从提出至今，虽然　

只有短短几年时间，但这项技术已应用于多个领域，并取得了　

突飞猛进的发展。人们发现，ＲＮＡ干扰在许多牛命科学领域　

都发挥着重要的作用。ｆＨ是同时，ＲＮＡ十扰的应用还存在着　

许多问题和限制，这些都有待于研究解决。本文就有关ＲＮＡ　

干扰的研究现状及应Ｈｊ予以综述。　

１　ＲＮＡ干扰的机制　

在正常生物体内，细胞内的双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ，３８个碱基　

以上）在依赖ＡＴＰ的情况下，被核糖核酸蛳Ｄｉｃｅｒ切割成双链　

小十扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，１９～２３个碱基）　ｓｉＲＮＡ这个结构对基　

因沉默效应卜分关键。（１）ｓｉＲＮＡ中有两条链，一条为　义　

链，一条为反义链，其中反义链可与多种核酸酶结合形成沉默　

复合物（ＲＩＳＣ）　，同时由于反义链与某一种ｍＲＮＡ的编码　

是同源的，因此可与此编码区互补结合，随之引导ＲＩＳＣ结合　

ｍＲＮＡ，然后通过依赖于ＡＴＰ的解螺旋酶解开ｓｉＲＮＡ的舣链，　

并将其正义链与靶ｍＲＮＡ置换，即ｍＲＮＡ取代『Ｆ义链＿卜反义　

链瓦补，继而核酸酶将ｍＲＮＡ切割成２１～２３　ｎｔ的小片段，切　

断部位大约在与ｓｉＲＮＡ反义链配埘序列的中部，于是ｍＲＮＡ　

发生降解，从而导致基因表达的沉默，干扰了靶琏因的表达。　

（２）ＲＩＳＣ　ｆ｝１的ＲｄＲＰ（ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶）以ｓｉＲＮＡ反　

义链作为引物，以靶ｍＲＮＡ为模板合成新的ｄｓＲＮＡ，然后由　

RNA干扰技术的原理与应用

󰀀 󰀀 RNA干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰 RNA ( small

interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特异性降解, 从而使基因转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作用。由于 RNAi可以作为一种简单、 有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域的研究步伐。

1󰀀 RNAi现象的发现及发展

1995年, Guo等用反义 RNA阻断秀丽新小杆线虫的 part 󰀀1基因的实验中发现, 正义和反义 RNA都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义 RNA技术的解释相反。1998年 2月卡耐基研究院的 F i re等将双链 RNA ( double󰀀stranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶基因的 mRNA发生了降解,证实高度纯化的 ds RNA 可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链 RNA至少高 2个数量级,首次揭示了 Guo等遇到的现象,即为 RNAi。

随后研究发现, RNAi现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制, RNAi技术作为一种重要的研究手段大大加速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。

在短短几年中,对 RNAi的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人振奋的报道相继出现, 2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功应用 RNAi技术抑制基因表达, 开创了 RNAi技术应用于高等生物基因功能研究的先河; 2002年, K ay研究小组首次报道了应用 RNAi技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围 RNAi研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组 siRNA文库新技术和应用基因组 siRNA文库,从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量 RNAi研究。这些研究成果愈来愈表明, 生物体基因转化的最终产物不仅仅是蛋白质,还包括相当一部分 RNA。

沈阳医学院学报Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈｅｎｙａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ第ｌ０卷第３期２００８年９月　

ＲＮＡ干扰及其应用　

王杰　（沈阳医学院基础医学院，辽宁沈阳１１００３４）　［关键词］ＲＮＡ干扰；基因功能；应用；研究　［中图分类号］Ｒ３６４．３　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００８—２３４４（２００８）０３—０１２９—０４　ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒ—　ｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是指在进化　过程中高度保守的、由双链　ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ，　ｄｓＲＮＡ）诱发的、同源ｍＲ—　ＮＡ高效特异性降解的现象。　由于ＲＮＡｉ技术可以特异性剔　除或关闭特定基因的表达，　所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性　疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。　１　ＲＮＡｉ的机制　ＲＮＡｉ是将内源性ｍＲＮＡ互补的ｄｓＲＮＡ导人　细胞后，引起该ｍＲＮＡ特异性的降解，导致ｍＲ．　ＮＡ编码的基因不能表达，发生基因沉默¨　。在　自然界中，ＲＮＡｉ有很重要的生物学作用，它能够　保护基因对抗由转座子和重复序列引起的不稳定　性，对抗病毒等外源性物质的侵入，同时，在内　源基因调控方面也有重要作用　Ｊ。　ＲＮＡｉ的作用机制被认为包括起始阶段、效应　阶段、扩增和扩散阶段　（图１）。　起始阶段是较长ｄｓＲＮＡ在ＡＴＰ参与下被　ＲＮａｓｅ　ｌｌＩ样的特异核酸酶切割加工成２１～２３ｎｔ的由　正义和反义链组成的小干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）。　ｓｉＲＮＡ的两条单链末端为５一磷酸和３：羟基，　且３　端均有２～３个突出的核苷酸。果蝇中的　ＲＮａｓｅ　ｍ样核酸酶称为Ｄｉｃｅｒ。Ｄｉｃｅｒ有解旋酶活性　并含有ｄｓＤＮＡ结合域和ＰＡＺ结构域。Ｄｉｃｅｒ的类　似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体　中被发现。　效应阶段是ｓｉＲＮＡ在ＡＴＰ参与下被ＲＮＡ解　［基金项目］辽宁省教委Ａ类项目（Ｎｏ．０７１．０９８）　［作者简介］王杰（１９６４一），男（汉）教授，硕士生导师．研　究方向：痛症发生机制和基因治疗药物开发及应用．　旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成ＲＮＡ　诱导的沉默复合体（ＲＮＡ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｎ—　ｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）。活化的ＲＩＳＣ在单链ｓｉＲＮＡ引导下　识别互补的ｍＲＮＡ，并在ＲＩＳＣ中的核酸内切酶作　用下从ｓｉＲＮＡ引导链中心所对应的靶基因位置切　割靶ｍＲＮＡ，最后可能再被核酸外切酶进一步降　解，从而干扰基因表达。ＲＮＡｉ能高效特异的阻断　基因的表达，在线虫，果蝇体内，ＲＮＡｉ能达到基　因敲除的效果。　扩增和扩散阶段是指ｓｉＲＮＡ不仅可引导ＲＩＳＣ　切割靶ＲＮＡ，而且可作为引物在ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ　聚合酶（ＲｄＲＰ）作用下以靶ｍＲＮＡ为模板合成新　的ｄｓＲＮＡ。新合成的长链ｄｓＲＮＡ同样可被ＲＮａｓｅ　Ⅲ样核酸酶切割、降解而生成大量的次级ｓｉＲＮＡ。　次级ｓｉＲＮＡ又可进入合成一切割的循环过程，进　一步放大ＲＮＡｉ作用。这种合成一切割的循环过程　称为随机降解性ＰＣＲ（ｒａｎｄｏｍ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ　ＰＣＲ）。　

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●综述与讲座　Ｇｕａｒｔｇｘｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｏｃｔ．２００７，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．１０　

ＲＮＡ干扰及其在医学中的应用▲　

杨益超　

（广西壮族自治区疾病预防控制中心，南宁市５３００１８）　

【关键词】　ＲＮＡ干扰；基因治疗　

【中图分类号】　Ｒ　３９４．８　【文献标识码】　Ａ　【文章编号】０２５３－４３０４（２００７）１０—１５４６－０３　

１９９５年，Ｇｕｏ等　在用反义ＲＮＡ阻断线虫基因表达的试　

验中发现，反义和正义ＲＮＡ都阻断了基因的表达，他们对这　

个结果百思不得其解。直到１９９８年，Ｆｉｒｅ等　研究发现这种　

抑制并不是单独正义链的作用，而是正义链中污染了反义链　

后形成的双链ＲＮＡ所致。他们称此为ＲＡＮ干扰（ＲＮＡｉ），　

ＲＮＡｉ是指在进化过程中高度保守的、由双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）诱　

发的、同源ｍＲＮＡ高效特异性降解的现象。这种ＲＮＡ干扰现　

象是生物体进化过程中抵御外来基因和病毒感染的进化保守　

机制，在维持基因组的稳定方面发挥了重要作用，由于使用　

ＲＮＡｉ技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技　

术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基　

因治疗领域。近年来，ＲＮＡ干扰技术为后基因组时代的基因　

功能和基因治疗研究提供了新的方法。　

１　ＲＮＡｉ的可能机制　

物体内的双链ＲＮＡ可来自于ＲＮＡ病毒感染、转座子的　

转录产物、外源导人的基因等，这些来源的双链ＲＮＡ诱发了　

细胞内的ＲＮＡｉ机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻　

断，外源导人基因表达被阻断，与其同源的细胞基因组中的基　

因表达也被阻断　Ｊ。当病毒基因、人工转入基因、转座子等　

外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞　

进行转录时，常产生一些ｄｓＲＮＡ，宿主细胞对这些ｄｓＲＮＡ迅即　

产生反应，其胞质中的核酸内切酶Ｄｉｃｅｒ将ｄｓＲＮＡ切割成多个　

具有特定长度和结构的小片段ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），ｓｉＲＮＡ是ＲＮＡ