6-生物信息学-转录调控分析

生物信息学分析引言生物信息学分析是一种重要的研究方法，通过对生物学数据进行收集、整理、分析和解释，从中发现生物学系统的规律性和生物学过程的机制性。

生物信息学分析在基因组学、转录组学、蛋白质组学等领域得到广泛应用，为生物学研究提供了强大的工具。

数据收集生物信息学分析的第一步是收集各种生物学数据。

这些数据可以是基因组序列、转录组测序数据、蛋白质质谱数据等。

基因组测序技术的快速发展使得我们能够获取大量的基因组序列，这为生物信息学分析提供了宝贵的资源。

同时，转录组测序和蛋白质质谱等技术也提供了详细的基因表达和蛋白质信息。

数据整理生物信息学分析的下一步是对收集到的数据进行整理。

这包括数据清洗、数据标准化、数据格式转换等操作。

数据清洗是指对数据中的噪声、错误和缺失值进行处理，以保证后续分析的准确性。

数据标准化是将数据转化为统一的格式，以方便后续的比较和分析。

数据格式转换则是将数据从一种格式转换为另一种格式，以适应不同的分析方法。

数据分析生物信息学分析的核心是数据分析。

数据分析可以基于不同的统计学方法和机器学习算法进行。

常见的分析方法包括基因差异表达分析、基因功能富集分析、蛋白质互作网络分析等。

基因差异表达分析可以帮助我们发现不同实验条件下基因表达的差异，这有助于研究基因调控和疾病机制。

基因功能富集分析可以帮助我们理解一组基因的功能和生物学过程。

蛋白质互作网络分析可以帮助我们研究蛋白质间的相互作用关系，揭示蛋白质网络的拓扑结构和功能模块。

数据解释生物信息学分析的最后一步是对分析结果进行解释。

解释分析结果需要结合先前的知识和文献研究。

通过对分析结果的解释，我们可以进一步理解生物学系统的结构和功能。

同时，解释分析结果还可以提出新的假设和研究方向，为后续的实验研究提供指导。

结论生物信息学分析是一种重要的研究方法，可以帮助我们从生物学数据中发现规律性和机制性。

通过收集、整理、分析和解释生物学数据，我们可以深入理解生物学系统和生物学过程。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(３):７５３￣７６１ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ张久盘ꎬ宋雅萍ꎬ姜㊀超ꎬ等.牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(３):７５３￣７６１.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０３.０１６牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析张久盘１ꎬ宋雅萍２ꎬ姜㊀超２ꎬ王㊀锦１ꎬ魏大为２(１.宁夏农林科学院动物科学研究所ꎬ宁夏银川７５０００２ꎻ２.宁夏大学农学院ꎬ宁夏银川７５００２１)收稿日期:２０２２￣０６￣１５基金项目:宁夏自然科学基金项目(２０２１ＡＡＣ０５００７)ꎻ宁夏重点研发计划项目(２０２０ＢＥＢ０４０１１)ꎻ宁夏青年科技人才托举工程项目(ＴＪＧＣ２０１９０７６)作者简介:张久盘(１９８５－)ꎬ女ꎬ河南商丘人ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ研究方向为动物遗传育种ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｎｇｊｉｕｐａｎ＠１６３.ｃｏｍ通讯作者:魏大为ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗｅｉｄａｗｅｉｗｄｗ＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀本研究旨在探究牛ＬＡＴＳ２基因组织表达规律ꎬ利用相对荧光素酶活性数值确定其启动子核心区域并初步鉴定其核心区域关键转录因子ꎬ以阐明牛ＬＡＴＳ２基因的转录调控机制ꎮ利用ＲＴ￣ｑＰＣＲ检测牛ＬＡＴＳ２基因在心㊁脾㊁肝㊁肾㊁肺㊁背最长肌㊁皮下脂肪㊁皱胃㊁大肠及睾丸等中的相对表达量ꎬ构建ＬＡＴＳ２蛋白进化树ꎮ克隆ＬＡＴＳ２基因５ᶄ端非翻译区上游１.７ｋｂ序列ꎬ利用逐段缺失引物ꎬ巢式扩增其７个启动子区不同截断体缺失片段(－１７９２~＋１７９㊁－１４７５~＋１７９㊁－１０９８~＋１７９㊁－７２７~＋１７９㊁－５１５~＋１７９㊁－２４８~＋１７９和－５６~＋１７９)ꎬ并将不同截断体构建至双荧光素酶报告载体ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ上ꎮ重组的ＬＡＴＳ２基因启动子双荧光素载体分别转染小鼠成肌细胞(Ｃ２Ｃ１２)和小鼠脂肪细胞(３Ｔ３￣Ｌ１)细胞系ꎬ鉴定其启动子核心区域ꎮ进一步借助在线软件ＪＡＳＰＡＲ(ｈｔｔｐ://ｊａｓｐａｒ.ｇｅｎｅｒｅｇ.ｎｅｔ/)和Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍａｔｉｘ.ｄｅ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ//ｍａｔ￣ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ)分析启动子核心区域序列特征ꎬ并预测关键转录因子结合位点ꎮ结果显示ꎬＬＡＴＳ２基因在肝和背最长肌中表达量极显著高于脾(Ｐ<０ ０１)ꎻＬＡＴＳ２蛋白构建的进化树显示反刍动物单独聚为１支ꎬ表明ＬＡＴＳ２基因在反刍动物进化过程中保守性较高ꎻ蛋白质互作分析筛选出的与ＬＡＴＳ２蛋白互作紧密的前１０种蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中的关键蛋白质ꎮＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ预测其启动子核心区域有与肌肉发育相关的转录因子ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁ＭｙｏＧ和Ｍｙｏｄ１的结合位点ꎬ表明ＬＡＴＳ２基因在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎮ以上结果为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中转录调控机制奠定基础ꎮ关键词:㊀牛ꎻＬＡＴＳ２基因ꎻ组织表达ꎻ启动子ꎻ转录调控中图分类号:㊀Ｓ８２３.８＋１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０３￣０７５３￣０９ＰｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅＺＨＡＮＧＪｉｕ￣ｐａｎ１ꎬ㊀ＳＯＮＧＹａ￣ｐｉｎｇ２ꎬ㊀ＪＩＡＮＧＣｈａｏ２ꎬ㊀ＷＡＮＧＪｉｎ１ꎬ㊀ＷＥＩＤａ￣ｗｅｉ２(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＮｉｎｇｘｉａＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＹｉｎｃｈｕａｎ７５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＮｉｎｇｘｉａＵｎｉ￣ｖｅｒｓｉｔｙꎬＹｉｎｃｈｕａｎ７５００２１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅꎬａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｔｓｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎａｎｄｋｅｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓꎬｓｏａｓｔｏｃｌａｒｉｆｙｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｈｅａｒｔꎬｓｐｌｅｅｎꎬｌｉｖｅｒꎬｋｉｄｎｅｙꎬｌｕｎｇꎬｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓｄｏｒｓｉｍｕｓｃｌｅꎬｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｆａｔꎬａｂｏｍａｓｕｍꎬｌａｒｇｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｔｅｓｔｉｓｂｙＲＴ￣ｑＰＣＲꎬａｎｄｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｏｆＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ.Ｔｈｅ１.７ｋｂｓｅｑｕｅｎｃｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅ５ᶄ￣ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｇｉｏｎｓｏｆｓｅｖｅｎｓｅｇｍｅｎｔｓｗｉｔｈ－１７９２－＋１７９ꎬ－１４７５－＋１７９ꎬ－１０９８－＋１７９ꎬ－７２７－＋１７９ꎬ－５１５－＋１７９ꎬ－２４８－＋１７９ａｎｄ－５６－＋１７９ｍｉｓｓｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄꎬａｎｄｔｈｅｄｕａｌ￣ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｖｅｃｔｏｒｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＣ２Ｃ１２ａｎｄ３Ｔ３￣Ｌ１ｃｅｌｌｌｉｎｅｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬａｎｄｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ.Ｗｉｔｈｔｈｅｈｅｌｐｏｆｏｎｌｉｎｅｓｏｆｔｗａｒｅ３５７ＧｅｎｏｍａｔｉｘａｎｄＪＡＳＰＡＲꎬｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｔｏｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｋｅｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｌｉｖｅｒａｎｄｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓｄｏｒｓｉｍｕｓｃｌｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｓｐｌｅｅｎ(Ｐ<０ ０１).Ｒｕｍｉｎａｎｔｓｗｅｒｅｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｏｎｅｂｒａｎｃｈｉｎｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｃｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎꎬｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｗａｓｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｐｒｏｃｅｓｓｏｆｒｕｍｉｎａｎｔｓ.ＴｈｅｔｏｐｔｅｎｐｒｏｔｅｉｎｓｃｌｏｓｅｌｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｔｈｅｋｅｙｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＨｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ.ＴｈｅｃｏｒｅｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗａｓｌｏｃａｔｅｄａｔ－２４８－－５６.Ｉｔｗａｓｐｒｅｄｉｃ￣ｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｈａｄｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓＴＥＡＤ１ꎬＭＥＦ２ＡꎬＦＯＳＬ１ꎬＭｙｏＧａｎｄＭｙｏｄ１ｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｕｓｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.ＩｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅ￣ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｏｖｉｎｅｍｕｓｃｌｅ.Ｔｈｅａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｏ￣ｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｍｕｓｃｌｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｃａｔｔｌｅꎻＬＡＴＳ２ｇｅｎｅꎻｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｐｒｏｍｏｔｅｒꎻｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ㊀㊀骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分ꎬ其生长发育直接影响甚至决定家畜的产肉量ꎬ骨骼肌的生物学特性是衡量家畜潜在经济性能的标准[１]ꎬ另外ꎬ骨骼肌是动物体动作和能量代谢的主要参与者ꎬ在机体的代谢平衡维持中起十分重要的作用[２]ꎮ骨骼肌发生发育过程极其复杂精细ꎬ从静息肌卫星细胞的激活㊁成肌细胞的增殖分化ꎬ到肌纤维形成的终末阶段[３￣４]ꎬ全过程除了受遗传㊁环境及营养水平调控外ꎬ更多取决于基因的控制[５]ꎬ且细胞信号分子㊁转录因子㊁非编码ＲＮＡ等诸多调节因子精准地参与其中复杂的网络调控[６￣１１]ꎮ目前ꎬ为促进骨骼肌的生长发育以改善肉质从而实现肉牛的遗传改良ꎬ基因的功能鉴定和筛选已成为一种热门且有效的手段ꎮ哺乳动物中调节细胞生长的Ｈｉｐｐｏ信号通路十分保守ꎬ通过关键因子Ｓａｌｖａｄｏｒ１(Ｓａｖ１)㊁ＭＳＴ１/ＭＳＴ２㊁Ｙｅｐ等相关基因及大肿瘤抑制基因１/２(ＬＡＴＳ１/ＬＡＴＳ２)调控细胞的增殖㊁分化㊁凋亡以及干细胞的自我更新ꎬ从而实现对器官体积大小的控制[１２￣１３]ꎮＬＡＴＳ２基因作为Ｈｉｐｐｏ信号通路的核心成员之一ꎬ与通路中的其他关键因子共同调控动物体器官的生长发育ꎬ主要表现在影响心脏肌肉的发育[１４￣１５]ꎮ目前ꎬ关于ＬＡＴＳ２基因功能研究主要集中在其参与肿瘤细胞发生及调控细胞增殖的机理方面[１６￣１８]ꎬ但ＬＡＴＳ２基因对动物体骨骼肌生长发育中的调控有重要作用且研究较少ꎮ王利宏等[１９]㊁鲍建军等[２０]发现ＬＡＴＳ２基因多态性与湖羊肌肉生长发育有显著关联ꎬ同时还发现ＹＡＰ１基因在正常表型羊和双肌臀羊中的表达存在差异ꎬ且ＬＡＴＳ１/ＬＡＴＳ２基因可与ＹＡＰ１基因互作抑制肌肉生长发育[２１]ꎮ此外ꎬ我们前期研究发现ＬＡＴＳ１基因在牛背最长肌等多个组织中高表达ꎬ且其核心启动区结合了肌肉生长发育相关的Ｍｙｏｄ１和ＭＥＦ２Ａ转录因子并调控其转录活性ꎬ初步阐明了ＬＡＴＳ１基因参与牛的肌肉生长发育转录调控机制[２２]ꎮＬＡＴＳ２基因与ＬＡＴＳ１基因同属ＬＡＴＳ基因家族ꎬ其分子序列及结构相似ꎬ因此我们推测ＬＡＴＳ２在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎬ但其转录机制不清ꎮ鉴于此ꎬ本研究拟构建ＬＡＴＳ２基因在牛不同肌肉组织或器官中的表达谱ꎬ克隆并鉴定其启动子核心区域ꎬ预测ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域的关键转录因子ꎬ以期为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育过程中的转录调控机制奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验样品采集３头２０月龄秦川牛公牛的肝(右叶)㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺(中叶)㊁肾(皮质)㊁皮下脂肪㊁心(心房)㊁皱胃(胃壁)㊁大肠(盲肠段)㊁脾(实质)和颈部静脉血样ꎬ迅速置于液氮带回实验室备用ꎮ１.２㊀主要试剂ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体㊁ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬＰｒｅｍｉｘ㊁基因组ＤＮＡ提取试剂盒㊁ＤＨ５α感受态细胞㊁ＤＮＡ凝胶回收试剂盒㊁限制性内切酶ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁ＲＮＡ提取试剂盒㊁反转录及荧光定量试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司ꎻ去内毒质粒提取试剂盒购自ＯｍｅｇａＢｉｏ￣Ｔｅｋ公司ꎻＤｕａｌ￣Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ双荧光素酶报告系统购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司ꎻＤＭＥＭ培养基㊁磷酸缓冲盐溶液(ＰＢＳ)㊁ＯＰＴＩ￣ＭＥＭ㊁Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅ￣ａｇｅｎｔ脂质体转染试剂盒及胎牛血清(ＦＢＳ)购自赛默飞世尔科技公司ꎻ双荧光检测试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司ꎻｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ及ｐＲＬ￣４５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期ＴＫ载体㊁小鼠成肌细胞(Ｃ２Ｃ１２)和小鼠脂肪细胞(３Ｔ３￣Ｌ１)为本实验室保存ꎮ１.３㊀ＲＴ￣ｑＰＣＲ检测首先提取不同组织或器官总ＲＮＡꎬ并按照反转录试剂盒说明书将各个ＲＮＡ进行反转录ꎬ检测ｃＤ￣ＮＡ质量ꎮ利用Ｐｒｉｍｅｒ５.０软件设计ＲＴ￣ｑＰＣＲ引物ꎬ以ＧＡＰＤＨ作为内参基因(引物见表１)ꎬ使用７５００ＦａｓｔＲｅａｌＴｉｍｅ仪器(美国应用生物系统公司产品)进行定量ＰＣＲꎮ反应总体系为２０ ０μｌꎬ其中上/下游引物各０ ８μｌ(引物浓度为１０μｍｏｌ/Ｌ)㊁ｃＤＮＡ模板２ ０μｌ(模板质量浓度为５０ｎｇ/μｌ)㊁ＰｒｉｍｉｘＥｘＴａｑⅡ１０ ０μｌ㊁ＲＯＸＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅⅡ０ ４μｌꎬ剩余用ｄｄＨ２Ｏ补齐ꎮＲＴ￣ｑＰＣＲ反应程序为:９５ħ预变性３０ｓꎻ９５ħ变性５ｓꎬ６０ħ退火３４ｓꎬ循环４０次ꎬ生物学重复３次ꎬ采用２－әәＣｔ法处理分析相对表达量数据[２３]ꎬ数据采用ＳＰＳＳ２０.０软件进行单因素差异性分析ꎮ１.４㊀生物信息学分析结合ＮＣＢＩ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ)及ＵＣＳＣ(ｈｔｔｐｓ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/)网站参考牛基因组信息ꎬ确定ＬＡＴＳ２基因启动子区域ꎮ利用Ｕｎｉｐｒｏｔ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｕｎｉｐｒｏｔ.ｏｒｇ/)和ＭＥＧＡ５.０(ｈｔ￣ｔｐｓ://ｗｗｗ.ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ.ｎｅｔ/ｉｎｄｅｘ.ｐｈｐ)构建出ＬＡＴＳ２蛋白进化树ꎬ使用ＥｘｃｅｒｔＳｙＰｒｏｔＰａｒｍ(ｈｔ￣ｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/)在线程序进行蛋白质序列分析ꎬ使用Ｓｔｒｉｎｇ(ｈｔｔｐ://ｓｔｒｉｎｇ￣ｄｂ.ｏｒｇ/)预测与ＬＡＴＳ２蛋白互作的蛋白质ꎮ１.５㊀启动子克隆及逐段缺失片段扩增根据牛ＬＡＴＳ２基因启动子序列信息ꎬ设计其启动子全长扩增引物ＬＡＴＳ２￣ＰＦ/ＰＲ(表１)ꎬ引物长度为１９７２ｂｐꎬ包括－１７９２~＋１７９序列ꎮ以基因组ＤＮＡ为模板ꎬ参考ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬＰｒｅｍｉｘ操作手册进行ＰＣＲꎬ总体系２０ ０μｌꎬ其中ꎬ４ ０μｌｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅꎬ１０ ０μｌ２ˑＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＢｕｆｆｅｒꎬ上/下游引物各０ ８μｌ(浓度为１０μｍｏｌ/Ｌ)ꎬ１ ０μｌＰｒｉｍｅ￣ＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡ聚合酶ꎬ底物１ ０μｌ(质量浓度为５０ｎｇ/μｌ)ꎬ２ ４μｌｄｄＨ２ＯꎮＰＣＲ扩增程序使用３步法:９８ħ１０ｓꎬ６０ħ２０ｓꎬ６８ħ１５ｓꎬ循环３５次ꎮＰＣＲ扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ预期片段纯化回收后与ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体连接ꎬ转化后筛选阳性克隆进行测序鉴定ꎮ根据测序结果ꎬ设计５ᶄ端逐段缺失片段的上游引物(Ｆ１~Ｆ７)和１条固定的下游引物(Ｒ)ꎬ在引物５ᶄ端添加ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切位点(表１)ꎬ以ＬＡＴＳ２基因－１７９２~＋１７９序列为模板进行缺失片段的ＰＣＲ扩增反应(扩增体系㊁程序同上)ꎬ将扩增片段分别连接ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体进行测序鉴定ꎮ得到的逐段缺失片段分别命名为:ＬＡＴＳ２￣Ｐ１㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ２㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ３㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ４㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ５㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ６和ＬＡＴＳ２￣Ｐ７ꎮ表１㊀引物信息Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｓｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ项目㊀引物名称㊀㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)退火温度(ħ)扩增片段长度(ｂｐ)扩增区域收录号荧光定量ＰＣＲＧＡＰＤＨ￣ＦＧＡＰＤＨ￣ＲＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡ６０.０８０３２０~５２１ＮＭ＿００１０３４０３４.２ＬＡＴＳ２￣ＦＬＡＴＳ２￣ＲＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＡＴＣＧＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧ６０.０１３１３２１３~３３４４ＸＭ＿０２５００００９２.１启动子区域克隆ＬＡＴＳ２￣ＰＦＬＡＴＳ２￣ＰＲＡＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＴＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣＴ６５.５１９７２－１７９２~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ１ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＧＡＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＧＡＡＣＴＧＡＡＧ６１.０１９７２－１７９２~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ２ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＡＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＣ６０.５１６５５－１４７５~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ３ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＡＣＣＣ６１.５１２７８－１０９８~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ４ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴ６４.０９０７－７２７~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ５ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣＴＧＡＧＡＡ６２.５６９５－５１５~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ６ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＣ６０.０４２８－２４８~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ７ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧ５９.５２３６－５６~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣ＲＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣＴＮＣ＿０３７３３６.１Ｆ为上游引物ꎬＲ为下游引物ꎬ斜体碱基表示ＫｐｎⅠ(ＧＧＧＧＴＡＣＣ)和ＸｈｏⅠ(ＣＣＧＣＴＣＧＡＧ)酶切位点ꎮ５５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析１.６㊀双荧光素报告载体构建使用内切酶ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ将ＬＡＴＳ２￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣Ｐ７片段和ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体在３７ħ条件下酶切１ｈꎬ酶切完成后进行目的片段纯化回收ꎮ进一步将ＬＡＴＳ２￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣Ｐ７片段分别和ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶(１６ħ条件下)连接１ｈꎮ将产物转化至ＤＨ５α感受态细胞培养后筛选阳性克隆并鉴定ꎬ进一步使用去内毒质粒提取试剂盒提取质粒ꎬ备用ꎮ１.７㊀细胞培养、转染及测定酶活性复苏Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１ꎬ培养基为１０％胎牛血清(ＦＢＳ)＋９０％ＤＭＥＭ培养基ꎬ待其生长状态良好且密度达到７０％~８０％后进行传代培养ꎮ传代生长后选择形态良好的细胞进行２４孔板铺板ꎬ按照Ｌｉｐｏ￣ｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅａｇｅｎｔ脂质体转染试剂盒说明书ꎬ分别将构建好的双荧光素报告载体ＬＡＴＳ２￣ｐＧＬ３￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣ｐＧＬ３￣Ｐ７８００ｎｇ重组质粒和２０ｎｇ内参质粒ｐＲＬ￣ＴＫ共转染至Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１ꎬ进行３次重复ꎬ阴性对照为ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ质粒ꎮ在转染４８ｈ后进行细胞收集ꎬ利用双荧光检测试剂盒进行荧光素酶和海肾荧光素酶活性测定ꎬ计算二者的比值ꎬ确定ＬＡＴＳ２基因的启动子核心区域ꎮ１.８㊀关键转录因子预测通过ＪＡＳＰＡＲ(ｈｔｔｐ://ｊａｓｐａｒ.ｇｅｎｅｒｅｇ.ｎｅｔ/)和Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍａｔｉｘ.ｄｅ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ//ｍａｔ￣ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ)在线软件分析启动子核心区域序列ꎬ预测阈值设置为９０％以上ꎬ选取２个网站预测结果的共同部分ꎬ筛选ＬＡＴＳ２基因的启动子核心区域关键的转录因子结合位点ꎮ１.９㊀数据分析数据结果以平均值ʃ标准差表示ꎬ数据显著性检验使用ＳＰＳＳ１８.０软件进行单因素方差分析(Ｐ<０ ０１为差异极显著ꎻＰ<０ ０５为差异显著)ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＬＡＴＳ２基因组织表达规律㊀㊀ＲＴ￣ｑＰＣＲ结果(图１)显示ꎬＬＡＴＳ２基因在肝㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾中均检测出表达信号ꎬ以脾中的表达量作为对照ꎬ该基因在肝和背最长肌中的表达极显著地高于脾(Ｐ<０ ０１)ꎬ其次在睾丸中高表达(Ｐ<０ ０５)ꎬ在肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾中表达量较低ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎻ∗∗表示差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图１㊀ＬＡＴＳ２基因在牛不同组织或器官中的ｍＲＮＡ相对表达量Ｆｉｇ.１㊀ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｒｏｒｇａｎｓｏｆｃａｔｔｌｅ２.２㊀牛ＬＡＴＳ２基因的结构特征及进化树构建ＬＡＴＳ２基因位于第１２号染色体ꎬ全长５１０９６ｂｐꎬ包括９个外显子和８个内含子ꎬ共转录３０４８ｂｐ的ｍＲＮＡ序列ꎬ可编码１０１５个氨基酸(图２)ꎬＬＡＴＳ２蛋白分子式为Ｃ４８８２Ｈ７６２８Ｎ１４１８Ｏ１４２５Ｓ３５ꎬ其相对分子质量为１１０１１０ꎬ等电点(ｐＩ)为８ ８４ꎮ㊀㊀以ＬＡＴＳ２蛋白序列为对象ꎬ利用ＭＥＧＡ５.０软件构建牛㊁绵羊㊁山羊㊁马㊁猪㊁小鼠等物种的系统进化树(图３)ꎮ构建出的系统进化树表明ＬＡＴＳ２蛋白在牛㊁绵羊㊁山羊㊁马㊁猪㊁小鼠等物种中进化较为保守ꎬ反刍动物在进化过程中单独聚为１支ꎬ上述结果表明ＬＡＴＳ２具有重要功能且在反刍动物进化过程中极度保守ꎮ２.３㊀牛ＬＡＴＳ２蛋白互作分析使用Ｓｔｒｉｎｇ(ｈｔｔｐ://ｓｔｒｉｎｇ￣ｄｂ.ｏｒｇ/)预测与ＬＡＴＳ２蛋白互作的蛋白质ꎬ得到图４所示的蛋白质互作网络ꎮ网络中与ＬＡＴＳ２蛋白互作紧密的前１０种蛋白质分别为ＹＡＰ１㊁ＭＯＢ１Ａ㊁ＭＯＢ１Ｂ㊁ＳＡＶ１㊁ＡＭＯＴＬ２㊁ＷＷＣ１㊁ＷＷＴＲ１㊁ＡＭＯＴ㊁ＡＭＯＴＬ１㊁ＮＦ２ꎬ分析其信息ꎬ与ＫＥＧＧ收录的Ｈｉｐｐｏ信号通路成员及Ｂｉｏｇｒｉｄ收录的与ＹＡＰ１互作的蛋白质进行比对后ꎬ发现筛选出的上述蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中的关键蛋白质ꎮ２.４㊀ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域鉴定通过ＰＣＲ扩增到牛ＬＡＴＳ２基因启动子１.７ｋｂ序列ꎬ根据逐段缺失引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ获得７个逐段缺失的ＬＡＴＳ２基因启动子片段(逐段缺失片段扩增电泳见图５)ꎮ进一步连接ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体ꎬ构建得到了逐段缺失重组质粒ꎬ将其命名为:ｐＬＡＴＳ２－１７９２~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－１４７５~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２６５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期图２㊀牛ＬＡＴＳ２基因结构示意图Ｆｉｇ.２㊀ＴｈｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ图３㊀基于牛ＬＡＴＳ２蛋白序列构建进化树Ｆｉｇ.３㊀ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅ图４㊀牛ＬＡＴＳ２蛋白相互作用预测Ｆｉｇ.４㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＬＡＴＳ２ｉｎｃａｔｔｌｅ－７２７~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－５１５~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９和ｐＬＡＴＳ２－５６~＋１７９ꎮ测序鉴定后ꎬ使用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅａｇｅｎｔ脂质体分别将ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ质粒和７个重Ｍ:ＤＬ４５００ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ泳道１~７分别为ＬＡＴＳ２－１７９２~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－１４７５~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－７２７~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－５１５~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－５６~＋１７９扩增片段电泳图ꎬ片段长度分别为１９７２ｂｐ㊁１６５５ｂｐ㊁１２７８ｂｐ㊁９０７ｂｐ㊁６９５ｂｐ㊁４２８ｂｐ㊁２３６ｂｐꎮ图５㊀牛ＬＡＴＳ２基因启动子逐段缺失片段扩增电泳图Ｆｉｇ.５㊀ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ组质粒转染至３Ｔ３￣Ｌ１和Ｃ２Ｃ１２细胞系ꎬ检测启动子的活性ꎮ相对荧光素酶活性数值(图６)显示ꎬＬＡＴＳ２基因７５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析启动子区域的１ ７ｋｂ序列在Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１细胞系中均有较高的转录活性ꎮ当缺失－１０９８~－７２７片段后ꎬｐＬＡＴＳ２－７２７~＋１７９较ｐＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９酶活性在Ｃ２Ｃ１２细胞系中显著下降(Ｐ<０ ０５)ꎻ进一步缺失启动子片段－２４８~－５６ꎬ发现ｐＬＡＴＳ２－５６~＋１７９较ｐＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９酶活性在Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１细胞系中均极显著下降(Ｐ<０ ０１)ꎬ分别下降了７９ ４％和７５ ６％ꎮ上述研究结果表明ꎬＬＡＴＳ２基因启动子区域的１ ７ｋｂ序列活性较高ꎬ具备调控基因转录活性的功能ꎻ－２４８~－５６为ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域ꎻＬＡＴＳ２基因在Ｃ２Ｃ１２细胞系的转录活性高于３Ｔ３￣Ｌ１ꎮ２.５㊀启动子核心区域的关键转录因子鉴定利用Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ和ＪＡＳＰＡＲ软件对ＬＡＴＳ２基因启动子区和核心区域(－２４８~－５６)进行分析并对潜在的关键转录因子进行预测ꎬ结果(图７)显示ꎬＬＡＴＳ２基因启动子核心区域包含转录增强因子ＴＥＦ１(ＴＥＡＤ１)㊁肌肉细胞特异性增强因子２Ａ(ＭＥＦ２Ａ)㊁ＦＯＳ样抗原１(ＦＯＳＬ１)㊁肌细胞生成素(Ｍｙｏｇ)和生肌决定因子(Ｍｙｏｄ１)ꎬ初步推测转录因子ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１可能对ＬＡＴＳ２基因的转录活性有重要的调控作用ꎮ左边为ＬＡＴＳ２基因启动子双荧光素逐段缺失片段示意图ꎬ右边为酶活性检测数值ꎮＬｕｃ表示双荧光素酶报告载体ꎮＣ２Ｃ１２表示小鼠成肌细胞ꎻ３Ｔ３￣Ｌ１表示小鼠脂肪细胞ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎻ∗∗表示差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图６㊀ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域缺失片段报告载体相对荧光素酶活性Ｆｉｇ.６㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｄｅｌｅｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｒｅｐｏｒｔｅｒｖｅｃｔｏｒ３㊀讨论骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分ꎬ占胴体质量的４０％左右ꎬ其发育程度直接影响甚至决定家畜的产肉量ꎬＬＡＴＳ２基因对细胞的增殖㊁凋亡以及骨骼肌的形成有重要的调控作用ꎬ而调控机制并不清楚ꎮ已有文献报道ꎬＬＡＴＳ１基因[２１]㊁ＬＡＴＳ２基因[１９]与湖羊肌肉生长发育显著相关ꎮ因此ꎬ本试验开展了牛ＬＡＴＳ２基因有关研究ꎬ成功克隆了牛ＬＡＴＳ２基因启动子ꎬ检测了启动子活性并鉴定到启动子核心区域ꎬ预测到该基因启动子核心区域中的重要转录因子ꎬ为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中的转录调控机制奠定基础ꎮ本研究中ꎬ牛ＬＡＴＳ２基因在肝㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾等不同组织或器官中均有表达ꎬ在肝中的表达量最高ꎬ背最长肌其次ꎬ在心㊁肺㊁皮下脂肪㊁肾㊁皱胃㊁大肠和脾等组织或器官中相对表达量较低ꎮ上述研究结果表明ＬＡＴＳ２基因在牛不同组织或器官中的相对表达量有差异ꎬ该基因的高表达可能影响肝以及肌肉组织的８５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期下划线为引物序列ꎬ方框表示相对应的转录因子结合位点ꎬ箭头指示转录起始位点ꎮＦＥＡＤ１:转录增强因子ＴＥＦ１ꎻＭＥＦ２Ａ:肌肉细胞特异性增强因子２ＡꎻＦＯＳＬ１:ＦＯＳ样抗原１ꎻＭｙｏｇ:肌细胞生成素ꎻＭｙｏｄ１:生肌决定因子ꎮ图７㊀牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域的转录因子预测Ｆｉｇ.７㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｃｏｒｅｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ正常发育ꎬ这同ＬＡＴＳ２基因表达量与湖羊肌肉生长发育显著相关[１９]的结果一致ꎮ系统进化树结果显示ꎬＬＡＴＳ２基因在反刍动物进化过程中保守性较高ꎻ预测出的前１０种互作蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中重要的转录调控因子ꎮＨｉｐｐｏ通路的核心是一个激酶级联反应ꎬ其中ꎬＳＡＶ１和ＭＯＢ１形成一种复合体并在细胞质中被磷酸化来调控ＬＡＴＳ１/２表达ꎬ待ＬＡＴＳ１/２被激活后ꎬ其激酶反过来去磷酸化并抑制转录共激活因子ＹＡＰ和ＴＡＺꎮ去磷酸化的ＹＡＰ/ＴＡＺ进入细胞核后与ＴＥＡＤ１￣４等多种转录因子发生互作ꎬ从而抑制凋亡的基因表达并诱导细胞增殖[２４￣２５]ꎮ研究发现ＬＡＴＳ１/２和Ｍｓｔ１/２可通过ＫＩＢＲＡ㊁ＮＦ２㊁ＲＡＳＳＦ等多种上游信号分子调控Ｈｉｐ￣ｐｏ信号通路的活性ꎬ如ＡＭＯＴ等因子通过结合ＬＡＴＳ１/２将ＹＡＰ/ＴＡＺ等因子紧密连接在细胞质中ꎬＹＡＰ/ＴＡＺ的磷酸化可进行细胞信号调控ꎮＹＡＰ/ＴＡＺ和ＬＡＴＳ１/２的稳定性可通过蛋白质泛素化进行调控[２６]ꎮ综上ꎬＬＡＴＳ２基因在细胞信号转导及细胞增殖分化中起重要作用ꎮ通过启动子逐段缺失载体活性检测ꎬ发现牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ进一步预测牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域有ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１等转录因子结合位点ꎮ研究结果表明ꎬＴＥＡＤ１可调控肌肉特异性基因ＴＮＮＴ２㊁Ｍｈｃ㊁α￣ａｃｔｉｎ[２７]和ＣＯＬ１Ａ１[２８]的表达ꎬ在心肌㊁骨骼肌㊁平滑肌的发育方面有至关重要的调控作用[２７￣２９]ꎮＴＥＡＤ１蛋白还可以与Ｈｉｐｐｏ信号通路中ＹＡＰ蛋白形成蛋白质复合物ꎬ从而抑制细胞增殖㊁促进细胞凋亡[３０]ꎮＭＥＦ２Ａ作为肌肉发生的重要核心因子ꎬ对骨骼肌和心肌细胞的增殖和分化有重要调控作用[３１]ꎬ同时能够促进生长因子㊁肌球蛋白重链及胶原对损伤骨骼肌的修复[３２]ꎻ该因子能够特异性识别并结合大多数肌肉基因启动子中的Ａ/Ｔ序列ꎬ从而增强相关基因的表达[３３]ꎮＦＯＳＬ１是转录因子ＡＰ￣１复合体的组分之一ꎬ参与细胞的增殖和分化ꎬ抑制细胞凋亡ꎬ可介导Ｋｒａｓ通路调控细胞周期蛋白质ꎬ诱导骨骼的发育[３４]ꎮＭｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１作为调控肌肉细胞增殖㊁分化及肌纤维形成的关键基因[３５]ꎬ突变会显著影响肌肉纤维和肉质特性[３６]ꎮ其中ꎬＭｙｏｄ１对发育初级阶段肌肉的可塑性和再生起关键作用[３５]ꎬ当Ｍｙｏｄ１与ＰＡＸ７共表达时ꎬ可激活基底膜静息的肌肉卫星细胞使其增殖[３７]ꎻＭｙｏｇ通过调节肌肉肌酸激酶影响骨骼肌的发生发育[３８]ꎬ研究结果表明ꎬ敲除小鼠Ｍｙｏｇ基因后骨骼肌发育受损ꎬ出生后肌肉会出现萎缩现象[３９]ꎮ以上研究结果表明ꎬＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１转录因子在个体生长发育以及肌肉形成过程中起重要作用ꎬ结合本研究关于转录因子结合位点的预测ꎬ我们可以推断出上述５种转录因子对ＬＡＴＳ２基因的转录可能起重要调控作用ꎮ但对于这一推断将来还需要结合定点突变㊁凝胶迁移(ＥＭＳＡ)㊁染色质免疫共沉淀(ＣｈＩＰ)等技术手段进行深入研究ꎮ４㊀结论牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ启动子核心区域预测到ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁９５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１转录因子结合位点ꎮＬＡＴＳ２基因的组织表达规律㊁启动子核心区域的转录因子结合位点预测及ＬＡＴＳ２蛋白互作分析结果均表明ＬＡＴＳ２基因在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎮ以上结果为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中的转录调控机制奠定基础ꎮ参考文献:[１]㊀ＢＥＲＲＹＤＰꎬＷＡＬＬＥꎬＰＲＹＣＥＪＥ.Ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｉｎｄａｉｒｙａｎｄｂｅｅｆｃａｔｔｌｅ[Ｊ].Ａｎｉｍａｌ:ＡｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１４ꎬ８(１):１０５￣１２１. [２]㊀ＨＪＯＲＴＨＭꎬＰＯＵＲＴＥＹＭＯＵＲＳꎬＧÖＲＧＥＮＳＳＷꎬｅｔａｌ.Ｍｙｏ￣ｓｔａｔｉｎｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｐｈｙｓｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｄｙｓｇｌｙｃａｅｍｉａａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｈｕｍａｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ[Ｊ].ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａꎬ２０１６ꎬ２１７(１):４５￣６０.[３]㊀ＦＲＯＮＴＥＲＡＷＲꎬＯＣＨＡＬＡＪ.Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ:ａｂｒｉｅｆｒｅｖｉｅｗｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＣａｌｃｉｆｉｅｄＴｉｓｓｕｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌꎬ２０１５ꎬ９６(３):１８３￣１９５.[４]㊀ＴＡＪＢＡＫＨＳＨＳ.Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｖｅｒ￣ｓｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２００９ꎬ２６６(４):３７２￣３８９.[５]㊀ＢＯＵＫＨＡＡꎬＢＯＮＦＡＴＴＩＶꎬＣＥＣＣＨＩＮＡＴＯＡꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｔｉｃｐａ￣ｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｃａｒｃａｓｓａｎｄｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓｏｆｄｏｕｂｌｅｍｕｓｃｌｅｄＰｉ￣ｅｍｏｎｔｅｓｅｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＭｅａｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１１ꎬ８９(１):８４￣９０. [６]㊀ＷＥＩＤＷꎬＦＥＮＧＬＳꎬＺＨＡＮＧＷＺꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＳＩＸ４:ｒｏｌｅｓｏｆＥ￣ｂｏｘａｎｄＭｙｏＤｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂａｓａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉ￣ｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ２０１８ꎬ４９６(１):４４￣５０. [７]㊀ＷＥＩＤＷꎬＭＡＸＹꎬＺＨＡＮＧＳꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｂｏｖｉｎｅＳＩＸ１ｇｅｎｅ:ｒｏｌｅｓｏｆＭｙｏＤꎬＰＡＸ７ꎬＣＲＥＢａｎｄＭｙｏＧ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７(１).ＤＯＩ:１０.１０３８/Ｓ４１５９８￣０１７￣１２７８７￣５.[８]㊀ＷＥＩＤＷꎬＧＵＩＬＳꎬＲＡＺＡＳＨＡꎬｅｔａｌ.ＮＲＦ１ａｎｄＺＳＣＡＮ１０ｂｉｎｄｔｏｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＳＩＸ１ｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｉｒｅｆｆｅｃｔｓｂｏｄｙｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｉｎＱｉｎｃｈｕａｎｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７(１).ＤＯＩ:１０.１０３８/Ｓ４１５９８￣０１７￣０８３８４￣１.[９]㊀ＲＡＺＡＳＨＡꎬＫＡＳＴＥＲＮꎬＫＨＡＮＲꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｍｉｃｒｏＲ￣ＮＡｓｉｎｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｂｅｅｆｃａｔｔｌｅ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓꎬ２０２０ꎬ１１(３).ＤＯＩ:１０.３３９０/ｇｅｎｅｓ１１０３０２９５.[１０]ＹＵＥＢＬꎬＬＩＨꎬＬＩＵＭꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡ￣ｍｉＲ￣ＮＡ￣ｍＲＮＡｎｅｔｗｏｒｋｔｏｒｅｖｅａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｅＲＮＡｓｉｎｂｏｖｉｎｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１９ꎬ１０.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｇｅｎｅ.２０１９.０００９１.[１１]ＦＵＹＹꎬＬＩＳꎬＴＯＮＧＨＬꎬｅｔａｌ.ＷＤＲ１３ｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ￣ａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓｂｙａｆｆｅｃｔｉｎｇＰＩ３Ｋ/ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌꎬ２０１９ꎬ４３(７):７９９￣８０８.[１２]ＬＩＡＮＬꎬＫＩＭＪꎬＯＫＡＺＡＷＡＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＹＡＰｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｌｆ￣ｒｅｎｅｗａｌａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ￣ｔｉｏｎ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ２０１０ꎬ２４(１１):１１０６￣１１１８. [１３]ＺＨＡＮＧＬꎬＹＵＥＴꎬＪＩＡＮＧＪ.Ｈｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄｏｒｇａｎｓｉｚｅｃｏｎｔｒｏｌ[Ｊ].Ｆｌｙ(Ａｕｓｔｉｎ)ꎬ２００９ꎬ３(１):６８￣７３.[１４]ＹＩＪꎬＬＵＬꎬＹＡＮＧＥＲＫꎬｅｔａｌ.Ｌａｒｇｅｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｈｏｍｏｌｏｇｓ１ａｎｄ２ｒｅｇｕｌａｔｅｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍａｔｕ￣ｒａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈａｎｔａｇｏｎｉｓｍｏｆｔｈｅｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓＹＡＰａｎｄＴＡＺ[Ｊ].Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙꎬ２０１６ꎬ６４(５):１７５７￣１７７２.[１５]ＦＵＲＴＨＮꎬＡＹＬＯＮＹ.ＴｈｅＬＡＴＳ１ａｎｄＬＡＴＳ２ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ:ｂｅｙｏｎｄｔｈｅＨｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬ２０１７ꎬ２４(９):１４８８￣１５０１.[１６]姚春和ꎬ张荣.ｍｉＲ￣３７２靶向ＬＡＴＳ２对结肠癌ＳＷ６２０细胞增殖㊁迁移侵袭的影响[Ｊ].广西医科大学学报ꎬ２０２１ꎬ３８(１０):１９０６￣１９１１.[１７]ＭＣＮＥＩＬＬＨꎬＲＥＧＩＮＥＮＳＩＡ.Ｌａｔｓ１/２ｒｅｇｕｌａｔｅＹａｐ/Ｔａｚｔｏｃｏｎｔｒｏｌｎｅｐｈｒｏｎｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｆｏｒ￣ｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２８(３):８５２￣８６１.[１８]冯瑞军ꎬ郑远航ꎬ盛智梅.外泌体ｍｉＲ￣５７４￣５Ｐ通过下调大肿瘤抑制基因２促进胶质瘤增殖㊁侵袭和迁移[Ｊ].中国生物化学与分子生物学报ꎬ２０２１ꎬ３８(１１):１５２０￣１５２７.[１９]王利宏ꎬ王庆增ꎬ鲍建军ꎬ等.Ｈｉｐｐｏ信号通道中Ｌａｔｓ２基因表达与湖羊肌肉生长发育的关系[Ｊ].南京农业大学学报ꎬ２０１８ꎬ４１(３):５１９￣５２５.[２０]鲍建军ꎬ苏㊀锐ꎬ王庆增ꎬ等.Ｓｍａｄｓ与Ｈｉｐｐｏ通道中ＹＡＰ１基因在湖羊肌肉组织中时空表达研究及关联分析[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０１６ꎬ４９(１１):２２０３￣２２１３.[２１]张玉龙.Ｈｉｐｐｏ信号通道中Ｌａｔｓ１基因对湖羊肌肉生长性状遗传调控的初步研究[Ｄ].扬州:扬州大学ꎬ２０１３.[２２]ＷＥＩＤꎬＲＡＺＡＳＨＡꎬＷＡＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙ￣ｓｉｓꎬｃｌｏｎｉｎｇꎬａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ５ᶄ￣ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ１ｇｅｎｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ９.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｖｅｔｓ.２０２２.８５３８１９.[２３]ＬＩＶＡＫＫＪꎬＳＣＨＭＩＴＴＧＥＮＴＤ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２－әәＣｔｍｅｔｈｏｄ[Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ２００１ꎬ２５(４):４０２￣４０８.[２４]ＢＡＤＯＵＥＬＣꎬＭＣＮＥＩＬＬＨ.ＳｎａｐＳｈｏｔ:ｔｈｅｈｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈ￣ｗａｙ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１１ꎬ１４５(３).ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｃｅｌｌ.２０１１.０４.００９. [２５]ＺＨＡＯＢꎬＴＵＭＡＮＥＮＧＫꎬＧＵＡＮＫＬ.Ｔｈｅｈｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙｉｎｏｒ￣ｇａｎｓｉｚｅｃｏｎｔｒｏｌꎬｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｌｆ￣ｒｅｎｅｗａｌ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ１３(８):８７７￣８８３.[２６]ＯᶄＨＡＹＲＥＭꎬＤＥＧＥＳＥＭＳꎬＧＵＴＫＩＮＤＪＳ.ＮｏｖｅｌｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏＧｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＧｐｒｏｔｅｉｎ￣ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ２７:１２６￣１３５.[２７]ＬＩＵＦꎬＷＡＮＧＸꎬＨＵＧꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴＥＡＤ１ｒｅｐｒｅｓｓｅｓｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙａｂｏｌｉｓｈｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１４ꎬ２８９(６):３３０８￣３３１６.[２８]ＡＭＢＲＯＳＩＮＯＣꎬＩＷＡＴＡＴꎬＳＣＡＦＯＧＬＩＯＣꎬｅｔａｌ.ＴＥＦ￣１ａｎｄＣ/ＥＢＰβａｒｅｍａｊｏｒｐ３８αＭＡＰＫ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎ０６７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ[Ｊ].ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌꎬ２００６ꎬ３９６(１):１６３￣１７２.[２９]ＷＥＮＴꎬＬＩＵＪＨꎬＨＥＸＱꎬｅｔａｌ.ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴＥＡＤ１ｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｖａｓｃｕｌａｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬ２０１９ꎬ２６(１２):２７９０￣２８０６.[３０]ＨＵＲＡＳＫＩＮＤꎬＥＩＢＥＲＮꎬＲＥＩＣＨＥＬＭꎬｅｔａｌ.Ｗｎｔ/β￣ｃａｔｅｎｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇｖｉａＡｘｉｎ２ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄꎬｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈＹＡＰ/ＴａｚａｎｄＴｅａｄ１ꎬａｃｔｉｖｅｉｎＩＩａ/ＩＩｘｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｓ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔꎬ２０１６ꎬ１４３(１７):３１２８￣３１４２.[３１]ＮＩＮＧＬꎬＮＥＬＳＯＮＢＲꎬＢＥＺＰＲＯＺＶＡＮＮＡＹＡＳꎬｅｔａｌ.Ｒｅｑｕｉｒｅ￣ｍｅｎｔｏｆＭＥＦ２ＡꎬＣꎬａｎｄＤｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１４ꎬ１１１(１１):４１０９￣４１１４.[３２]ＳＣＨＩＡＦＦＩＮＯＳꎬＤＹＡＲＫＡꎬＣＡＬＡＢＲＩＡＥ.ＳｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｍａｓｓｉｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙｔｈｅＭＲＦ４￣ＭＥＦ２ａｘｉｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｃＣａｒｅꎬ２０１８ꎬ２１(３):１６４￣１６７. [３３]ＴＡＹＬＯＲＭＶꎬＨＵＧＨＥＳＳＭ.Ｍｅｆ２ａｎｄｔｈｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｄｉｆ￣ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍ[Ｊ].ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０１７ꎬ７２:３３￣４４.[３４]ＶＡＬＬＥＪＯＡꎬＰＥＲＵＲＥＮＡＮꎬＧＵＲＵＣＥＡＧＡＥꎬｅｔａｌ.Ａｎｉｎｔｅ￣ｇｒａｔｉｖｅａｐｐｒｏａｃｈｕｎｖｅｉｌｓＦＯＳＬ１ａｓａｎｏｎｃｏｇｅｎｅｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙｉｎＫＲＡＳ￣ｄｒｉｖｅｎｌｕｎｇａｎｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａ￣ｔｉｏｎｓꎬ２０１７ꎬ８.ＤＯＩ:１０.１０３８/ｎｃｏｍｍｓ１４２９４.[３５]ＺＡＭＭＩＴＰＳ.ＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｙｏｇｅｎｉｃｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓＭｙｆ５ꎬＭｙｏＤꎬＭｙｏｇｅｎｉｎａｎｄＭＲＦ４ｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅꎬｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ７２:１９￣３２.[３６]ＣＯＬＥＳＣＡꎬＷＡＤＥＳＯＮＪꎬＬＥＹＴＯＮＣＰꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｂｏｖｉｎｅｐｒｉｍａｒｙｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｒｅｌａｔｅｔｏｌｉｖｅｗｅｉｇｈｔａｎｄｃａｒｃａｓｅｗｅｉｇｈｔｉｎｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１５ꎬ１０(４).ＤＯＩ:１０.１３７１/ｊｏｕｒ￣ｎａｌ.ｐｏｎｅ.０１２４４６８.[３７]ＢＵＣＫＩＮＧＨＡＭＭꎬＲＩＧＢＹＰＷ.Ｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｓａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｈａｔｃｏｎｔｒｏｌｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔａｌＣｅｌｌꎬ２０１４ꎬ２８(３):２２５￣２３８.[３８]ＸＵＤＱꎬＷＡＮＧＬꎬＪＩＡＮＧＺＺꎬｅｔａｌ.ＡｎｅｗｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃａｔａｌｐｏｌｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｅｎｈａｎｃｉｎｇＭｙｏＤ/ＭｙｏＧ￣ｍｅｄｉａ￣ｔｅｄｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１８ꎬ２０９:３１３￣３２３. [３９]ＢＯＤＩＮＥＳＣꎬＬＡＴＲＥＳＥꎬＢＡＵＭＨＵＥＴＥＲＳꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎｏｆｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅａｔｒｏｐｈｙ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００１ꎬ２９４(５５４７):１７０４￣１７０８.(责任编辑:陈海霞)１６７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析。

第1篇一、背景随着高通量测序技术的发展，转录组分析已成为研究基因表达调控和基因功能的重要手段。

本报告针对某研究项目中的转录组数据进行分析，旨在探究该物种在不同生长阶段的基因表达差异及其生物学意义。

二、实验方法1. 样本采集：在研究项目中对不同生长阶段的样本进行采集，包括幼年期、成熟期和衰老期。

2. RNA提取：采用TRIzol法提取样本总RNA，并进行质量检测。

3. cDNA文库构建：采用SMART-seq2技术构建cDNA文库。

4. 转录组测序：使用Illumina HiSeq平台进行转录组测序。

5. 数据分析：采用HTSeq-count软件对测序数据进行定量，利用DESeq2进行差异表达分析，并使用GSEA进行基因集富集分析。

三、结果与分析1. 数据质量评估：测序数据经过质量控制后，得到有效数据量约为100亿个reads。

2. 基因表达差异分析：在幼年期、成熟期和衰老期三个阶段，共检测到差异表达基因（DEGs）1000个，其中上调基因600个，下调基因400个。

3. 基因功能富集分析：通过对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，发现与细胞周期、代谢、信号转导等生物学过程相关的基因富集显著。

4. 蛋白质互作网络分析：构建DEGs的蛋白质互作网络，发现某些关键基因在转录调控和信号转导过程中发挥重要作用。

四、结论本研究通过对某物种不同生长阶段的转录组数据进行分析，揭示了该物种在不同生长阶段的基因表达差异及其生物学意义。

研究结果为进一步研究该物种的生长发育机制提供了重要参考。

五、展望1. 深入挖掘差异表达基因的功能：通过实验验证差异表达基因的功能，揭示其在生长发育过程中的作用。

2. 分析差异表达基因的调控网络：进一步研究差异表达基因的调控网络，揭示基因表达调控的分子机制。

3. 结合表观遗传学分析：探究表观遗传学因素对基因表达的影响，为研究基因表达调控提供新的思路。

4. 探索转录组分析在植物育种中的应用：将转录组分析应用于植物育种，提高育种效率。

生物信息学中的基因调控及其调节网络基因调控是指细胞内某些外界或内界因素对基因表达的影响，包括影响核酸转录、RNA的剪接、核酸的修饰和蛋白质合成等过程。

基因调控是生物体适应外界环境变化策略的一部分，也是遗传图谱与表型特性之间的桥梁。

基因调控是非常复杂的过程，涉及到众多的分子机制和生物学过程。

随着基因组及转录测序技术的发展，科学家们通过对大量基因表达和DNA甲基化数据的分析和解释，构建了基因调控网络，为疾病发生、进程和预后的解释提供了新的思路和方法。

1.不同的调节类型基因表达的调节方式可以分为两类：转录调控和后转录调控。

转录调控是指转录因子或其他调控蛋白结合到某个区域的DNA序列上，之后通过与调控因子相互作用，改变该基因的转录活动。

后转录调控则是指RNA的剪接、RNA修饰、RNA输运、蛋白质稳定性等后生物学部分发生的调控作用。

此外，基因调控可以通过转录因子、RNA交互和染色质调控等方式共同作用，构建了一个复杂的基因调控网络。

2.转录调控中的基因和调节因子在转录调控中，基因表达受到细胞内各种调控因子的影响。

其中转录因子是基因转录过程中的最重要调控因子之一。

基因组的比较分析，可以鉴定出转录因子的结构域、结构特征和调控模式。

我们可以从模式生物中发现并推广一些基本的结构域、基序和相应的启动子元件，从而帮助我们预测类似结构的转录因子。

在人类基因组中，约有2000个以上的转录因子分别调控着数万个基因的转录。

另外，转录因子的相互作用和相互竞争也是基因调控网络构建的重要因素。

3.基因调控中的RNA和蛋白质除了转录因子之外，RNA和蛋白质也是基因调控网络中非常重要的调控因子之一。

RNA干扰技术使得产生特异性的小RNA逆转录后可以形成大小为22nt的dsRNA，在该过程中通过蛋白质RNA互作，导致该RNA通过与靶基因RNA的互补配对发挥自下而上的调控。

在蛋白质方面，研究表明，蛋白质组大约有10%的蛋白质是转录因子或响应因子，它们在细胞核中通过DNA结合特异性来调控基因转录。

转录因子分析一般常用技术手段转录因子分析是研究转录因子在基因调控中的作用的一个重要领域。

转录因子是一类能结合到DNA上的蛋白质，它们能够直接或间接地影响基因的转录水平。

转录因子分析的目标是确定转录因子与特定基因的相互作用方式，从而揭示基因调控网络的结构和功能。

目前常用的转录因子分析技术手段主要有DNA亲和层析、色谱-质谱联用技术、高通量测定和基因组学方法等。

DNA亲和层析在转录因子分析中得到了广泛应用。

该技术能够通过使用亲和树脂或酶联免疫吸附剂将转录因子与DNA结合，从而将特定的转录因子与DNA序列识别并分离开来。

这种方法可以用于研究转录因子的绑定位置、结合顺序和结合亲和力等特性。

此外，DNA亲和层析还可以用于研究转录因子与其他蛋白质的相互作用以及转录因子在细胞和组织中的定位等。

色谱-质谱联用技术是在DNA亲和层析的基础上发展起来的一种高分辨率分析方法。

它首先使用亲和层析将转录因子与DNA结合，然后将其分离并通过质谱仪进行检测和定量分析。

这种方法可以提供更加精确和可靠的蛋白质与DNA结合的定量信息，并且可以分析转录因子的修饰状态，例如磷酸化和甲基化等。

高通量测定技术是近年来快速发展的一种转录因子分析方法。

它利用高通量测序、芯片或微阵列等高通量技术，对整个基因组范围内开展转录因子的结合位点鉴定以及转录因子与基因表达的关联分析。

这种方法可以同时测定大量的转录因子与DNA的结合位点，并揭示转录因子在基因调控中的全局作用。

高通量测定技术的应用已经使我们对转录因子的功能和调控机制有了更全面的认识。

基因组学方法是一种综合应用多种技术手段对整个基因组范围内转录因子进行全面研究的方法。

包括染色质免疫沉淀、转录因子结合特异性标记和检测以及全基因组高通量测定等技术。

这种方法可以鉴定转录因子的结合位点和基因调控区域，并进一步分析转录因子在基因调控中的作用机制和调控网络。

除了上述技术手段，还有一些生物信息学方法也可以用于转录因子分析，例如转录因子序列分析、转录因子亚细胞定位预测、结构与功能预测等。

核酸和蛋白质序列分析蛋白质, 核酸, 序列关键词：核酸序列? ? 蛋白质序列? ? 分析软件? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ??在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信息，从而指导进一步的实验研究。

通过染色体定位分析、内含子／外显子分析、ORF分析、表达谱分析等，能够阐明基因的基本信息。

通过启动子预测、CpG岛分析和转录因子分析等，识别调控区的顺式作用元件，可以为基因的调控研究提供基础。

通过蛋白质基本性质分析，疏水性分析，跨膜区预测，信号肽预测，亚细胞定位预测，抗原性位点预测，可以对基因编码蛋白的性质作出初步判断和预测。

尤其通过疏水性分析和跨膜区预测可以预测基因是否为膜蛋白，这对确定实验研究方向有重要的参考意义。

此外，通过相似性搜索、功能位点分析、结构分析、查询基因表达谱聚簇数据库、基因敲除数据库、基因组上下游邻居等，尽量挖掘网络数据库中的信息，可以对基因功能作出推论。

上述技术路线可为其它类似分子的生物信息学分析提供借鉴。

本路线图及推荐网址已建立超级链接，放在北京大学人类疾病基因研究中心网站（）,可以直接点击进入检索网站。

? ?下面介绍其中一些基本分析。

值得注意的是，在对序列进行分析时，首先应当明确序列的性质,是mRNA序列还是基因组序列？是计算机拼接得到还是经过PCR扩增测序得到？是原核生物还是真核生物？这些决定了分析方法的选择和分析结果的解释。

（一）核酸序列分析1、双序列比对（pairwise alignment）? ?双序列比对是指比较两条序列的相似性和寻找相似碱基及氨基酸的对应位置，它是用计算机进行序列分析的强大工具，分为全局比对和局部比对两类，各以Needleman-Wunsch算法和Smith-Waterman算法为代表。

由于这些算法都是启发式（heuristic）的算法，因此并没有最优值。

根据比对的需要，选用适当的比对工具，在比对时适当调整空格罚分（gap penalty）和空格延伸罚分（gap extension penalty），以获得更优的比对。

生物信息学分析的相关技术及使用方法生物信息学是通过运用计算机科学和统计学方法来研究生物学数据，以揭示生物学现象和解决相关问题的科学研究领域。

生物信息学技术在遗传学、基因组学、蛋白质组学、转录组学等研究领域中被广泛应用。

本文将介绍生物信息学分析的相关技术及使用方法。

一、序列比对技术序列比对是生物信息学中最常用的技术之一。

它是将两个或多个生物序列进行比较，以找出它们之间的相似性和差异性。

比对结果可以帮助研究者识别基因序列中的各种特征，并推断相似序列之间的进化关系。

常用的序列比对软件包括BLAST、ClustalW、MAFFT等。

二、基因组和蛋白质组注释技术基因组和蛋白质组注释是指对已测序的基因组或蛋白质组进行分析和解释的过程。

该过程包括基因结构预测、功能注释、调控元件识别等。

常用的注释工具有NCBI的基因组注释浏览器、Ensembl、UniProt等。

通过基因组和蛋白质组的注释，研究者可以了解基因的功能、结构和表达特点，进而深入研究生命的本质。

三、基因表达数据分析基因表达数据分析是指对转录组学数据进行处理和解释的过程。

它可以帮助研究者理解基因在不同组织或条件下的表达变化，探索基因调控网络和生物通路等。

基因表达数据分析的常用方法包括差异表达分析、聚类分析、通路富集分析等。

在这一领域，常用的软件和工具有R包（如DESeq2、limma等）、DAVID、KEGG等。

四、蛋白质结构预测蛋白质结构预测是指通过计算模型来预测蛋白质的三维结构。

蛋白质的三维结构对于理解其功能和相互作用至关重要。

常用的蛋白质结构预测方法包括同源建模、蛋白质折叠动力学模拟、蛋白质碰撞力场等。

常用的蛋白质结构预测软件有MODELLER、I-TASSER、Rosetta等。

五、蛋白质-蛋白质相互作用预测蛋白质-蛋白质相互作用是指蛋白质之间的物理或化学交互作用。

预测蛋白质-蛋白质相互作用可以揭示蛋白质功能和细胞信号网络的关键组成部分。

预测方法包括结构基于方法、序列基于方法和混合方法等。

生物信息学分析方法生物信息学是一门综合应用信息学、生物学和统计学等相关知识和技术的学科，旨在通过利用计算机和信息技术处理和分析生物学数据，揭示生物系统的结构和功能，并解决生物学研究中的问题。

生物信息学分析方法主要包括序列比对、基因预测、蛋白质结构与功能预测、基因表达谱分析、基因调控网络构建和演化分析等。

以下将对其中几种常见的生物信息学分析方法进行详细介绍。

1. 序列比对：序列比对是生物信息学中最基本、最常用的方法之一、通过将待比对的序列与已知数据库中的序列进行比对，可以判断序列的相似性和进化关系，从而推断序列的功能和结构。

序列比对方法主要包括全局比对、局部比对和多序列比对等。

常用的序列比对工具有BLAST、ClustalW等。

2.基因预测：基因预测是指通过对DNA序列进行分析和预测，确定其中的基因位置和结构。

基因预测方法主要包括基于序列、基于比对和基于表达等方法。

其中，基于序列的方法依据基因的核苷酸组成、序列保守性和启动子顺应性等特征进行预测；基于比对的方法通过将待预测序列与已知基因进行比对，从而确定基因位置和结构；基于表达的方法则通过分析基因的表达模式和转录组数据，推断基因的存在和功能。

3.蛋白质结构与功能预测：蛋白质结构与功能预测是指通过分析蛋白质序列和结构，预测其二级结构、三级结构和功能。

蛋白质结构预测方法主要包括同源建模、蛋白质折叠动力学和序列匹配等方法。

同源建模是最常用的蛋白质结构预测方法，其基本原理是通过将待预测蛋白质序列与已知结构的同源蛋白质进行比对，并从中找到最佳匹配。

蛋白质功能预测方法主要包括结构域分析、功能域预测和功能注释等方法。

4.基因表达谱分析：基因表达谱分析是通过对基因在不同组织或条件下的表达水平进行比较和分析，揭示基因在生物体内的功能和调控机制。

常见的基因表达谱分析方法有RT-PCR、微阵列和高通量测序等。

RT-PCR是一种常用的基因表达定量方法，可以通过测定特定基因在RNA水平的表达量推断基因的转录水平；微阵列技术则可以同时检测数千个基因的表达水平，从而了解基因在不同组织和条件下的表达情况；高通量测序技术可以对整个转录组进行测序，从而揭示基因的全局表达谱。

生物信息学分析生物信息学是一门集计算机科学、数学和生物学知识于一体的交叉学科，通过对生物学数据的收集、存储、分析和解释，来揭示生物学系统的复杂性和规律性。

生物信息学分析是通过对生物学数据的加工和处理，来获取对生物体内生命现象的深刻理解的过程。

DNA序列分析DNA序列是生物体内最基本的遗传信息载体，通过对DNA序列的分析，可以揭示生物物种的亲缘关系、遗传变异及生物进化等信息。

常见的DNA序列分析包括序列比对、序列注释和基因预测等。

序列比对序列比对是将不同DNA序列进行对比，找出它们之间的相似性和差异性。

常用的比对工具包括BLAST和Bowtie等，通过比对结果可以推断DNA序列的功能和相似性。

序列注释序列注释是将DNA序列上的功能元件进行标注和解释的过程，包括基因结构、编码蛋白质、非编码RNA等。

通过序列注释可以深入了解DNA序列携带的生物学信息。

基因预测基因预测是根据DNA序列特征和统计模型，对DNA序列中的基因进行识别和预测。

基因预测的准确性对于后续的生物学研究和基因功能分析具有重要意义。

蛋白质结构分析蛋白质是生物体内功能最为多样的分子，其结构决定了其功能。

蛋白质结构分析通过对蛋白质的三维结构进行解析，可以揭示其功能及相互作用等信息。

蛋白质结构预测蛋白质结构预测是利用计算方法和实验数据，推测蛋白质的空间结构和构象。

预测蛋白质结构有助于理解蛋白质的功能及相互作用，为药物设计和基因工程提供参考。

蛋白质互动网络分析蛋白质互动网络分析是通过构建蛋白质之间的相互作用网络，揭示蛋白质在细胞内相互影响的关系。

通过网络分析可以发现潜在的药物靶点和生物学通路。

组学数据分析组学是研究生物体内所有组分的整体组成和功能的学科，包括基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等。

通过对组学数据的分析，可以全面了解生物体内的生命活动和调控机制。

转录组数据分析转录组数据分析是对细胞内mRNA的表达谱进行测序和分析，以了解基因在转录水平上的表达情况和调控机制。