Vo.l27高等学校化学学报No.12 2006年12月 CHEM I CAL J OUR NAL OF CH I NESE UN I VERSITIES 2266～2270基于核酸适配体的新型荧光纳米生物传感器用于凝血酶的测定徒永华1,程圭芳1,林 莉1,郑 静1,吴自荣2,何品刚1,方禹之1(1.华东师范大学化学系,2.生命科学学院,上海200062)摘要 利用凝血酶的两条核酸适配体与凝血酶的高亲和力构建了三明治结构,利用磁性纳米颗粒的磁性分离技术,设计并制作了一种新型的荧光纳米生物传感器,用其检测凝血酶.此法对凝血酶的响应线性范围为2.24×10-11～4.03×10-9mo l/L,其线性方程为I=0.9758×1011c-2.628,检出限为1.0×10-11m o l/L,对浓度为2.68×10-10m ol/L的凝血酶检测10次,其RSD为2.56%,测得的荧光信号稳定,24h后测定并无衰减,具有很高的检测特异性和灵敏度.关键词 核酸适配体;凝血酶;磁性纳米颗粒;荧光中图分类号 O652 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2006)12-2266-04肿瘤组织对周围组织的侵袭、转移的形成以及肿瘤组织和肿瘤患者血液本身的变化均可导致病人凝血机制的改变,产生不同程度的出血倾向.凝血酶是一种重要的生理蛋白酶,在血液凝固、炎症和创伤愈合等生理及病理过程中发挥重要作用,因此检测凝血酶在医学上具有重要意义.凝血酶(Thro m bin)的浓度及活性是衡量凝血机制的重要指标,对揭示肿瘤的发生机制,或作为早期诊断、分子分型、疗效及预后判断具有重大意义[1].传统上直接测定凝血酶的方法主要有发色底物法[2]和荧光法[3].发色底物法利用凝血酶切断其与发色肽的作用点精氨酰与对硝基苯胺相连的肽键,使对硝基苯胺游离出来.当对硝基苯胺与肽链相连时,其溶液为无色液体,当它游离存在时,显浅黄色,溶液在405～410n m波长处对光有最大吸收,据此可进行定量测定[4].该法简单易行,但灵敏度不高,不宜进行微量分析.荧光法是将荧光底物与凝血酶结合,通过测定荧光强度可以得出凝血酶的含量.单纯使用荧光法需要用荧光底物标记凝血酶,操作步骤繁琐,荧光背景不易降低,灵敏度低.核酸适配体(Apta m er)是通过SELEX技术[5]筛选出来的,可以特异性结合目标分子如蛋白质、氨基酸、有机小分子及一些无机离子的核酸序列片断.核酸适配体和蛋白质等目标分子的结合与抗体和抗原结合相类似[6],具有很强的专一性和选择性[7～10].由于不是所有的蛋白都能找到与之一一对应的抗原或抗体,而标记蛋白往往会造成蛋白的活性降低甚至失活,传统的免疫蛋白分析不能适应发展需要.而由人工合成的核酸适配体不依赖于动物或细胞,容易获得,可方便地在适配体的特定位置用荧光、酶或生物素分子等功能团加以标记.相对抗原或抗体来说,适配体的稳定性和耐受变性好,且其变性是可逆的,并可长期贮存和在常温下运输[11].近年来,核酸适配体作为一种分子识别元件,越来越受到关注[12,13].目前,应用核酸适配体荧光检测蛋白主要是基于适配体与目标蛋白作用后产生的荧光偏振度[14～16]或荧光强度[17～21]的改变来检测蛋白.核酸适配体荧光检测凝血酶也主要采用这两种方式.由于适配体与核酸作用结合后其分子量发生变化,从而引起偏振角度变化,用其检测蛋白,其信号变化范围较小,线性范围较窄,并且荧光偏振对非均相溶液的测定存在一定的局限性.也有人设计分子信标[17～19]或分子开关[16,20,21]与核酸适配体收稿日期:2005-11-25.基金项目:国家自然科学基金(批准号:20675031)资助.联系人简介:方禹之(1931年出生),男,教授,博士生导师,主要从事化学传感器、生物传感器、电化学及光谱电化学等方面的研究.E-m ail:yzfang@che 作用,其荧光强度在核酸适配体与目标蛋白结合前后产生变化(主要是由于分子间距离变化产生的荧光猝灭或是分子开关微环境变化产生的自猝灭作用),通过荧光强度的改变量来测定蛋白.这类方法也是通过荧光信号的改变量来测定目标蛋白的,荧光背景较大,线性范围不宽,对于低浓度的蛋白测定存在一定困难.本文将一条5′端带氨基修饰核酸适配体通过酰胺化反应固定于磁性纳米颗粒上,利用核酸适配体与凝血酶的强结合作用捕捉凝血酶分子,通过磁性分离技术去除杂蛋白干扰.另一条带荧光标记的核酸适配体结合凝血酶的另一位点,用以测定凝血酶的量.由于纳米颗粒载体有巨大的表面能,其表面有多个结合位点,因此具有较强的DNA 携带能力.磁性纳米颗粒(MNPs )除了具有一般纳米颗粒的特性外,还具有超顺磁性.在外加磁场的作用下,可较好地分离富集样品.选用无机材料制成的纳米颗粒作为基因载体[22],对细胞毒性小,不易被体内各种酶消化,是目前最有前景的基因载体材料之一.本文设计的类似三明治结构的传感器以凝血酶的两条核酸适配体为目标分子识别元件,利用磁性纳米颗粒的磁性分离作用消除了共存蛋白的非特异性吸附影响,在提高测定选择性和专一性的同时,降低了荧光背景,提高了测定的灵敏度,采集到的荧光信号稳定,满足了微量分析的要求.1 实验部分1.1 试剂与仪器5′端氨基修饰的核酸适配体Ⅰ(H 2N -a ta GGTT GGTGTGGGTTGG -3′)和核酸适配体Ⅱ(H 2N -cta tc -AGTCCGT GGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT -3′)购自上海申能博彩生物科技有限公司.其它化学试剂和罗丹明B 均购自国药集团化学试剂有限公司,所用试剂均为分析纯.EDAC [1-E t h y l -3-(di m e t h y la m in -opropy l )-car bodii m ide hydrochlori d e ]购于瑞士Fluka 公司.羧基修饰的磁性纳米颗粒参照文献[23]的方法合成.凝血酶和牛血清白蛋白(BSA )购自北京鼎国生物技术有限公司.PBS 生理缓冲液(0.1m ol /L ,p H =7.3);Tris 缓冲液(0.02mo l /L ,pH =7.4),其中含0.001m ol /L M gC l 2,0.001m ol /L C a C l 2,0.14m o l /L N a C l 和0.005m ol /L KC.l 实验用水为超纯水(艾科浦公司生产的实验室级超纯化水),比电阻达到13M Ψ c m.透析袋(MWCO7000,北京鼎国生物技术有限公司),C ar y50紫外-可见分光光度计(美国瓦里安技术中国有限公司),F -4500荧光分光光度计(H itach ,日本).1.2 实验过程1.2.1 核酸适配体的固定及标记 将核酸适配体Ⅰ用EDAC 经酰胺化反应共价键合到磁性纳米颗粒表面.通过测定溶液在紫外光谱中的吸收来定量检测固定在磁颗粒表面的核酸适配体.同理,用罗丹明B (RHB )通过酰胺化反应标记核酸适配体Ⅱ.反应后用透析袋去除溶液中游离的罗丹明B ,采用荧光检测透析后留下的溶液,可观察到罗丹明B 较强的荧光,表明此时核酸适配体Ⅱ已标记了荧光分子.通过测定溶液中DNA 在260nm 处的吸光度可以确定已标记了罗丹明B 的核酸适配体的浓度.F i g .1 Schemat i c representa ti on of fl uorescen t d etec ti on for thro mb i n1.2.2 荧光检测凝血酶 按图1所示的过程,先将固定了核酸适配体Ⅰ的磁性纳米颗粒与凝血酶在2267 N o .12 徒永华等:基于核酸适配体的新型荧光纳米生物传感器用于凝血酶的测定Tris缓冲溶液中于37℃恒温培育20m in,然后进行磁性分离,洗涤磁性纳米颗粒3次,去除共存蛋白.再将标记了罗丹明B的核酸适配体加入到溶液中恒温培育20m i n,然后洗涤5次,磁性分离未键合上的带荧光标记的核酸适配体.通过检测洗涤后溶液的荧光强度,可对凝血酶进行定性和定量分析.2 结果与讨论2.1 检测条件优化2.1.1 缓冲溶液的选择 凝血酶是一种重要的生理蛋白酶,保持其活性的介质环境为接近体液的生理环境.保持凝血酶正常生理活性的温度为37℃.PBS(0.1m o l/L,p H=7.3)缓冲液及Tris (0.02m o l/L,p H=7.4)缓冲液均可用作培育凝血酶与核酸适配体的介质环境[24].如图2所示,凝血酶在PBS(其中含有和Tris缓冲液相同的M g2+,C a2+离子浓度)和Tris缓冲溶液中与核酸适配体共同培育,都可产生相互的亲和作用.实验测得凝血酶在Tris缓冲液中的荧光信号更强.凝血酶两条核酸适配体以G四分体结构特异性地与凝血酶不同作用位点结合[18,21,25,26].缓冲溶液中的M g2+,Ca2+,N a+和K+等离子的浓度对G四分体结构的形成有影响[24].Fig.2 T he i n fl u ence of d ifferen t bu ffes on th e de tection re s u lts of th ro m b i nc(Apta m erⅠ)=2.80×10-10m ol/L;c(Apta m erⅡ)=2.50×10-10m ol/L.F i g.3 Select i vity of op ti m um ti m e for i n cubationc(Th ro m bin)=1.85×10-10mo l/L;c(Ap ta merⅠ)=3.30×10-10m ol/L;c(Ap ta merⅡ)=2.77×10-10m ol/L.据文献[22]报道,当缓冲溶液中含有0.001m o l/LM gC l2,0.001mo l/L C a C l2,0.14m o l/L Na C l和0.005m o l/L KC l时,凝血酶结合核酸适配体的比例较大.由于PBS磷酸缓冲液中的H P O2-4会与M g2+和Ca2+结合形成难溶的分子,造成缓冲溶液中的M g2+和C a2+离子浓度降低,使核酸适配体的G四分体结构受到影响,凝血酶与核酸适配体键合量较少,测得的荧光信号较小.而T ris缓冲液不存在此问题,溶液中的M g2+和C a2+离子浓度不受影响,则测得的荧光信号较大.因此,选择含0.001m o l/L M g2+和Ca2+离子的Tris缓冲液作为培育的介质环境.2.1.2 培育时间的选择 以Tris缓冲液为培育介质进行最佳培育时间的选择试验,结果如图3所示.在培育初期,随着培育时间的逐渐增加,荧光强度慢慢增强,说明凝血酶结合核酸适配体的量逐渐增加.培育约20m in后荧光强度趋于稳定,在该浓度下,荧光强度基本达到饱和状态,此时凝血酶与核酸适配体的结合作用基本完成,因此选择20m in为核酸适配体与凝血酶的培育时间.2.2 凝血酶检测的选择性比较蛋白质检测的选择性是衡量该检测方法优劣的重要因素之一.当以任意DNA系列代替检测中的一条核酸适配体时,则不能形成三明治结构,在溶液中不能检测到荧光[图4(A)曲线b和c],仅当溶液中存在与凝血酶两个作用位点特异性结合的两条核酸适配体时才能形成三明治结构[图4(A)曲线a],这也说明了凝血酶与其特异性核酸适配体一一对应的关系.当溶液中存在的是牛血清白蛋白时,不能观察到荧光[图4(B)a],即使在凝血酶溶液中共存1000倍的牛血清白蛋白,也不影响凝血酶的测定,所检测到的荧光强度无明显变化[图4(B)b和c].表明核酸适配体(Ⅰ和Ⅱ)是特异性选择结合凝血酶,溶液中荧光强度的大小仅取决于凝血酶的浓度大小,证明用此传感器检测凝血酶具有很高的选择性.2268高等学校化学学报 V o.l27 F i g .4 Spec ific i n terac tion b etween ap ta m er s and thro mb i n(A )Th ro m bin b i nd i ng to s pecific apta m ers .a .Ap t a m er Ⅰ-M NPs +t h ro mb in +ap t a m er Ⅱ-R M B ;b .rando m DNA -M NPs +thro m b i n +apta m er Ⅱ-R M B ;c .ap t a m er Ⅱ-M NP s +t h ro m bin +random DNA -R M B.c (Ap t a m er Ⅰ)=9.5×10-10m ol /L ,c (Apta m er Ⅱ)=9.0×10-10m ol /L .(B )Apta m ers s pecifi call y b i nding to thro m b i n .a .In t h e ab sence of t h r omb i n ;b .in t he presence of t h r omb i n ;c .i n t h e p res en ce of t h ro m bin and BSA (×1000).c (Thro m b i n )=1.20×10-11m ol /L ,c (Apta m er Ⅰ)=2.10×10-11mo l /L ,c (Ap t a m er Ⅱ)=2.00×10-11m ol /L ,c (BSA )=120×10-11m ol /L .2.3 凝血酶的定量测定采用选定的实验条件定量测定凝血酶,结果如图5所示.凝血酶的浓度在2.24×10-11～4.03×F ig .5 T he cali b rati on p l ot of thro mb i n d etec tio n c (A pta m er Ⅰ)=1.2×10-8m ol /L ,c (A pta m er Ⅱ)=1.2×10-8m ol /L .10-9m o l /L 之间时,荧光强度与凝血酶浓度呈线性关系,其线性方程为I =0.9758×1011c -2.628,相关系数r 为0.9974,检出限为1.0×10-11m o l /L .用此方法检测的凝血酶的线性范围较宽,接近2个数量级,是目前报道的检测凝血酶最灵敏的方法之一[18,22].用该方法平行测定浓度为2.68×10-10m o l /L 的凝血酶样品10次,其相对标准偏差为2.56%.24h 后荧光信号并无衰减,说明用该方法检测凝血酶具有很强的稳定性.综上所述,运用核酸适配体与目标蛋白凝血酶的强亲和力构建基于磁性纳米颗粒的三明治结构荧光检测凝血酶取得了满意的效果.用核酸适配体检测目标蛋白保留了原免疫反应检测的高专一性和选择性的特点.由于适配体的化学合成具有极佳的准确性和重复性,有很高的纯度,几乎消除了适配体制备的批间误差.荧光、酶或生物素分子等功能团可很容易地接合在适配体的特定位置上,因此,用核酸适配体检测蛋白比用免疫反应检测蛋白更具有优势.在生物蛋白检测分析中,往往需要修饰蛋白,但修饰对蛋白活性影响较大,而且有相当一部分蛋白根本不能修饰.三明治结构则不需要修饰蛋白,两条识别不同结合位点的核酸适配体的协调运用使此传感器具有极佳的选择性.磁性纳米颗粒的采用,可极大地消除非特异性吸附影响,大大降低了荧光背景,同时在检测上起到了富集蛋白的作用,因此该生物传感器具有高特异性和高灵敏度.磁性纳米颗粒与多聚阳离子聚合物相比较,几乎没有细胞毒性[27].该纳米生物传感器的检测线性范围宽,重现性好,检测信号稳定,如果选择合适的核酸适配体还可以用于对其它目标蛋白的识别及检测,有望直接应用于疾病的诊断和治疗,对临床医学和药理学研究具有重要的意义.参 考 文 献[1] HUANG Song -Yin (黄松音),DUAN C hao -H u i (段朝晖),LI ANG M u -X i ng (梁穆兴)et a l ..Ch i n ese Jou r n al ofTh ro mbosis and H e m o -stasis (血栓与止血学)[J ],2002,8(4):156—157[2] H er m an R .P ..Thro m b Hae m os t [J ],1979,41:544—547[3] Z HANG Ying (张 莹),W E IW en -N i ng (魏文宁).Ch i nese Jou rnal ofM icrocircu l ation (微循环学杂志)[J ],2005,15(2):70—72[4] YAN 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