1抗菌药物筛选
1.1 菌液的制备
将菌株接种于普通琼脂平板上，置于37℃恒温箱中培养24h，分别挑取单个特征菌落接种于灭菌肉汤培养基中，置37℃恒温箱中过夜培养。取过夜培养的菌悬液100 μL加入到900μL的肉汤培养基中，依次进行稀释，然后选取适当的浓度涂板，每个浓度三个平行。选取平板上菌落数目在30～300之间的进行计数，最后用肉汤或无菌生理盐水配成浓度为5个×107-8CFU/mL的菌液作初筛用。
1.2 琼脂扩散法 (K-B) 抑菌试验
用无菌棉签将浓度为5个×107-8CFU/mL的标准菌液均匀涂布于普通营养琼
脂培养基上，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。然后用直径为6mm的无菌圆形玻璃管打孔，将供试药物浓度为100mg／ml
的药液加入孔中，加满为止，不得溢出。再将培养皿置于37℃恒温箱中培养24h，取出观察，用卡尺测量抑菌圈的直径。每次实验前用大肠杆菌ATCC25922进行
质量控制，设置阴性对照和阳性对照，阳性药物的选择依据美国临床实验室标
准化委员会(NCCLS)公布的标准。
1.3 药敏试验判断标准
按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)，抑菌圈直径d小于等于6 为-；
d小于等于10为+；d小于等于16为++；d小于等于26为+++；d大于26为++++ 。
一般认为++以上具有抑菌活性。
2 抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定
2.1 菌悬液的制备
将细菌菌液接种到麦康凯培养基上进行纯化培养，37℃震荡培养24 h。分别挑取单个特征菌落接种于灭菌肉汤培养基中，置37℃恒温箱中过夜培养。取过夜培养的菌悬液100 μL加入到900μL的肉汤培养基中，依次进行稀释，然后选取适当的浓度涂板，每个浓度三个平行。选取平板上菌落数目在30～300之
间的进行计数，最后用肉汤稀释菌悬液至含菌落数105 ～106 CFU/mL后备用。
2.2 MIC和MBC测定
将1mL的2倍终浓度的药物放到第1管，采用二倍稀释法将药液从第1管
到第10分别稀释。第11管为阴性对照组 (只加菌悬液，不放药物) ，第12管为空白对照组(只加肉汤培养基)，第13管为阳性对照组(加入高敏感性物药和菌悬液)。将调好的菌液1mL分别加入相应的试管内，这将使每一梯度的抗细菌药
物和菌悬液 (2倍终浓度) 分别被1:1 稀释到终浓度。细菌于37℃孵育12小时后
判定MIC和MBC值。每次实验前用大肠杆菌ATCC25922进行质量控制。
2.3 MIC和MBC判定标准
首先在观察阳性对照管长菌呈浑浊状，而阴性对照管不长菌、呈透明状的
前提下，再观察其他试管的浑浊情况。
在不搅动的情况下肉眼判断，溶液清晰透明视为细菌完全不生长，取完全
不生长管的最低药物浓度为MIC。观察药物MIC以上未见细菌生长的各管培养物，分别取0.1mL移种至不含药物的营养琼脂平板上，轻轻推开药液，置于37℃恒温箱中过夜培养，观察有无菌生长，平皿培养基中，无菌落生长者作为该药
物的最低杀菌浓度。
