平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究

ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＲＩＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２００７ＶＯＬ．１８　ＮＯ．４　时珍国医国药２００７年第１８卷第４期　

平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究　

陈　文　，李丽立　，张平　，姜曼花　，邱细敏ｈ　

（１．湖南师范大学医学院，湖南长沙４１００１３；２．中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南长沙４１００００）　

摘要：目的为开发利用平白术的药用价值提供理论依据，分别提取分离平白术中有效成分多糖和氨基酸，并分别测定平白　

术多糖和氨基酸的含量。方法采用　（３　）实验因素设计实验，苯酚一硫酸法测定白术多糖的含量。以茚三酮为衍生试　剂，采用柱后衍生法测定平白术中氨基酸含量。结果平白术多糖的含量为１５．３％。平白术中至少含有１７种氨基酸，总氨　

基酸含量为７３．７３　ｍｇ・ｇ～。结论方法简单、有效、快速、准确、灵敏，适合于分析测定白术中多糖和氨基酸的含量。　

关键词：平白术；多糖；氨基酸　

中图分类号：Ｒ２８４．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８４）８０５（２００７）０４－０８１５－０２　

Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　

ｉｎ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ　Ｋｏｉｄｚ　

ＣＨＥＮ　Ｗｅｎ　．ＬＩ　Ｌｉ—ｌｉ　，ＺＨＡＮＧ　Ｐｉｎｇ　，ＪＩＡＮＧ　Ｍａｎ—ｈｕａ　，ＱＩＵ　ｘｉ—ｍｉｎ　’　

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＨｕｎａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００６，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉ—　

ｔｕｔｅ　ｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１００００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｐｏｌｙｓａｅｅｈａｒｉｄｅ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅｉｒ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｏｆｆｅｒ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｕｓｉｎｇ　

Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ　Ｋｏｉｄｚ　ｆｒｏｍ　Ｐｉｎｇｊｉａｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｕｓｉｎｇ　（３　）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ，Ｐｈｅｎｏｌ—ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　Ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｔｅｓｔ　

ｐｏｌｙｓａｅｅｈａｒｉｄｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ　ａｎｄ　ｔｏ　ａｓｓａｙ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｕｓｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ　ｐｏｓｔ—ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆＡｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ　Ｋｏｉｄｚ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｅｅｈａｒｉｄｅ　Ｗａｓ　１５．３％ａｎｄ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ａｔ　

ｌｅａｓｔ　１７　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｃｏｎｔｅｎｔ　Ｗａｓ７３．７３　ｍｇ・ｇ～．Ｃｏｎｄｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｑｕｉｔｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎ．　ｔｉｌｉｅａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｅｅｈａｒｉｄｅ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ　Ｋｏｉｄｚ．Ｉｔ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ，ｒａｐｉｄ，ａｅ－　

ｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ　ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ　Ｋｏｉｄｚ；Ｐｏｌｙｓａｅｅｈａｒｉｄｅ；　Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　

白术是传统中药，《中国药典》收载的白术为菊科植物Ａｔｒａｃ－　ｔｙｌｏｄｅｓｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ　Ｋｏｉｄｚ的干燥根茎，白术具有健脾益气、燥湿　

利水、止汗安胎之效…。《中国药典｝２００５年版第一部记载含白　

术的处方有９１个。近几年以来，中国对白术的需求量大增，居全　国大宗常用中药材之首。由于其含有白术多糖、挥发油、氨基酸　

等多种有效成分而倍受药物研究工作者的关注，使白术的临床应　用１３趋广泛－２　Ｊ，其研究也更为深入、更为多元化。然而，迄今为　

止，对白术中营养成分氨基酸研究甚少。为了开发利用白术的药　

用价值，本文对湖南平江产自术——平白术进行研究，提取平白　

术多糖、氨基酸，采用正交实验选择多糖显色条件，用苯酚一硫酸　法测定多糖含量。以茚三酮作衍生试剂，采用柱后衍生法测定氨　

基酸含量。　ｌ材料　１．１仪器ＵＶ－２１５０型分光广度计（日本岛津），日立Ｌ－８８００全　

自动氨基酸自动分析仪　１．２　试剂无水乙醇、硫酸锌、氢氧化钡、硫酸、苯酚、茚三酮、柠　

檬酸。三钠、醋酸钠（均为分析纯），平江白术（由ｉ蜘暂药材公司　提供）、果糖标准品（市售）、氨基酸标准品（中国科学院亚热带农　

业生态研究所提供）。　

２方法与结果　２．１显色条件的考察　２．１．１苯酚浓度对显色单因素的影响吸取标准溶液１　ｍｌ于１Ｏ　

收稿日期：２００６－０５－０９；修订日期：２００６—１２－０９　

基金项目：湖南省重大专项资助项目（Ｎｏ．０５ＮＫ１００１—０３）；　化学生物传感与计量学国家重点实验室（湖南大学）开放课题　

（Ｎｏ．０４—１０）　作者简介：陈文（１９８１一），女（汉族），湖南衡阳人，现为湖南师范大学化　学工学院在读研究生，学士学位，主要从事中草药研究工作．　’通讯作者简介：邱细敏（１９５４－），女（汉族），湖南平江人，现任湖南师范大学　医学院药学系教授，学士学位，主要从事中草药成分分析测定方法研究工作．　ｒＩ１ｌ具塞试管中，精密加入１　ｍｌ不同浓度的苯酚和５　ｒＩ１ｌ浓硫酸，　

混匀，放置５　ｍｉｎ。移入２５℃的水浴中保温２０　ｍｉｎ。冷却。以蒸　馏水１　ｍｌ加相应的试剂作空白，测定吸收度。见图１，表１。　

表１苯酚浓度的考察　

苯酚量（％）　吸收度Ａ　０．３６８　０．３７５　０．３７０　０．３６３　

苯酚浓度（％）　图１苯酚浓度的考察　

实验结果表明，苯酚浓度在４％～７％范围内所得吸收值相　

近，苯酚浓度为５％时所得吸收值较大，故选择苯酚浓度为５％。　

２．１．２苯酚一硫酸法正交实验设计　实验因素水平表设计：　

实验选择苯酚用量（５％苯酚）、浓硫酸用量、水浴温度和水浴中　的放置时间４个因素作为考察对象，根据初步实验，每个因素确　

定３个水平，采用　（３　）正交表进行实验（见表２）。以吸收度为　

评价指标（表３）。对结果进行统计学处理，得方差分析见表４。　

表２实验因素水平　

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　维普资讯 http://www.cqvip.com 时珍国医国药２００７年第１８卷第４期ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＲＩＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２００７ＶＯＬ・１８　ＮＯ・４　

表３　ｋ（３　）正交实验结果　

方差来源　离差平方和　自由度　方差　值　

Ｆｏ　ｏ５（２．２）＝１９．Ｏ０，Ｆｏ　０１（２．２）＝９９．Ｏ０　

经方差分析可知，苯酚用量、浓硫酸用量、水浴温度及水浴放　

置时问对吸收度影响不显著，但综合比较，本实验选择苯酚一硫　

酸法最佳显色条件为　Ｂ　Ｃ３Ｄ：即苯酚１．２　ｍｌ，浓硫酸４　ｍｌ，水浴　温度２５℃，水浴放置时间３０　ｍｉｎ。　

２．２　测定波长的选择精密称取一定量多糖样品置小烧杯中，　加水溶解，定量转移至１００　ｍｌ量瓶中，加水至刻度，混匀。吸取　

该样品２　ｍｌ于试管中，加５％苯酚水溶液１．２　ｍｌ混匀，迅速加入　

４　ｍｌ浓硫酸，振摇１０　ｍｉｎ，在２５℃水浴保温放置３０　ｍｉｎ，取出冷　却，以苯酚一硫酸溶液为空白，于４００—８００　ａｍ范围扫描，选择最　

大吸收波长４８８．４　ａｍ为测定波长。　

２．３标准曲线精密称取１０５￣Ｃ干燥至恒重的标准果糖１８．７０　ｇ，加水溶解至２５０　ｍｌ，配成７４．８　ｇ／ｍｌ的标准储备液。取１０　

ｍｌ具塞试管，分别加上述标准液０．０，０．１０，０．２０，０．３０，０．４０，　

０．５０，０．６０，０．７０　ｍｌ，加水稀释至１　ｍｌ，摇匀，每个试管各加５％苯　酚水溶液１．２　ｍｌ混匀，再迅速加入４　ｍｌ浓硫酸，振摇１０　ｍｉｎ，在　

２５℃水浴保温放置３０　ｍｉｎ。以水作空白在４８８．４　ｎｌｉ１处测定各　

标准液的吸收度，得回归方程Ａ＝０．０９８　３Ｃ＋０．０．０９２　６（ｒ＝　０．９９９　４）。其在１～２０．６　ｍｌ浓度范围内呈良好的线性关系。　

２．４　换算因素测定精密称取干燥的平白术多糖２０　ｍｇ，用蒸馏　

水溶解后定容至１００　ｍｌ，作为多糖储备液。精确量取多糖储备液　

０．２　ｍｌ，加水至１．０　ｍｌ，按测定标准曲线同样的方法测其吸光度　值。按下式计算换算因素　＝Ｗ／ＣＤ，试中：　为多糖质量（　ｇ），　

ｃ为多糖液中果糖的浓度（　ｍ１），Ｄ为多糖的稀释因素，测得．厂　＝１．２４。　

２．５平白术多糖、氨基酸的提取　

２．５．１　平白术多糖的提取　精密称取白术粗粉５０　ｇ置于　１　０００　ｍｌ的容量瓶中，加６倍量７０％的乙醇回流２　ｈ。过滤，取滤　

渣加８倍蒸馏水回流２　ｈ，趁热过滤。在滤渣中加６倍水回流　

１　ｈ，趁热过滤。再在滤渣中加３倍量水回流１　ｈ，趁热过滤，合并　３次滤液，浓缩至１００　ｍｌ，加无水乙醇至乙醇浓度达８５％，再用　

７５％乙醇冲洗，离心，反复６次，去溶液取沉淀。加水溶解，用　

５％ＺｎＳＯ　４　ｍｌ和饱和Ｂａ（ＯＨ）２溶液１６　ｍｌ振摇，离心去蛋白，　

反复１０次　。将所得溶液置于冰箱中过夜，次日取出溶解，在　

８　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１５　ｒａｉｎ，反复４次。用氯仿一正丁醇（４：１）与　溶液按５：１的比例混合搅拌１５　ｒａｉｎ，离心，反复３次，得澄清液　

即白术多糖溶液。加水至１００　ｍｌ冷藏备用。　

・８ｌ６・　２．５．２平白术氨基酸的提取称取平白术粉末４０　ｇ（过８０目）投　

入装有搅拌器、温度计、回流冷凝器的三颈烧瓶中，加入６　ｍｏｌ／Ｌ　的盐酸１００　ｍｌ，加热水解２４　ｈ，反应温度保持在（１１０±１）℃左右。　

滤渣用少量稀盐酸浸泡，过滤，重复两次，收集３次滤液得水解　

液，加热７ｈ赶盐酸。在滤液中加入０．５　ｇ活性碳且维持滤液在　（８０～９０）℃，磁力搅拌脱色３０　ｍｉｎ，重复２次，减压浓缩得到５０　

ｍｌ橙红色的溶液，作为储备液。于４℃的冰箱中保存。　

２．６平白术多糖和氨基酸含量的测定　

２．６．１　样品多糖含量的测定平白术多糖提取液稀释至适当倍　

数后，精密吸取１．０　ｍｌ，按照标准曲线的方法测定吸光度，计算平　白术多糖的含量。　

厂，ｎ，　按下式计算多糖含量：多糖含量＝　１１＇７　×１００％，式中：　ｒｒ　为多糖质量（　ｇ），Ｃ为多糖液中果糖的浓度（　ｇ／，ｍ１），Ｄ　

为多糖的稀释因素，ｆ为换算因素。测得多糖的含量为１５．３％。　２．６．２　回收率实验在样品液中精密加入不同浓度的果糖标准