FDNB法测定氨基酸含量.

生物化学简明教程（第四版)课后习题————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期:２蛋白质化学１.用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？基本原理是什么？解答:（1) N-末端测定法:常采用2,4―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。

①2,4―二硝基氟苯(DNＦＢ或FＤNB)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与2,4―二硝基氟苯(2,4―DNFB）反应(Sａngeｒ反应)，生成ＤNP―多肽或DNＰ―蛋白质。

由于ＤNＦB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP―多肽经酸水解后,只有N―末端氨基酸为黄色DNＰ―氨基酸衍生物,其余的都是游离氨基酸。

②丹磺酰氯(DNS)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与与丹磺酰氯（DNS―Ｃl)反应生成DＮＳ―多肽或DNS―蛋白质。

由于DＮS与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定,因此DNS―多肽经酸水解后,只有N―末端氨基酸为强烈的荧光物质ＤNＳ―氨基酸，其余的都是游离氨基酸。

③苯异硫氰酸脂(ＰITＣ或Edman降解)法:多肽或蛋白质的游离末端氨基与异硫氰酸苯酯(PITＣ）反应(Eｄman反应),生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。

在酸性有机溶剂中加热时，N―末端的PTC―氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来,除去N―末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。

④氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，能从多肽链的N端逐个地向里切。

根据不同的反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N端残基序列。

（2)Ｃ―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。

肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C端氨基酸以游离形式存在外,其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。

②还原法:肽链C端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的α―氨基醇。

2 蛋白质化学 1．用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？基本原理是什么？解答：（1） N-末端测定法：常采用―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。

① ―二硝基氟苯(DNFB或FDNB法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与―二硝基氟苯（―DNFB）反应（Sanger反应），生成DNP―多肽或DNP―蛋白质。

由于DNFB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP―多肽经酸水解后，只有N―末端氨基酸为黄色DNP―氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。

②丹磺酰氯(DNS法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与与丹磺酰氯（DNS―Cl）反应生成DNS―多肽或DNS―蛋白质。

由于DNS与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNS―多肽经酸水解后，只有N―末端氨基酸为强烈的荧光物质DNS―氨基酸，其余的都是游离氨基酸。

③苯异硫氰酸脂（PITC或Edman降解）法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）反应（Edman反应），生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。

在酸性有机溶剂中加热时，N―末端的PTC―氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N―末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。

④氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，能从多肽链的N端逐个地向里切。

根据不同的反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N端残基序列。

（2）C―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。

肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。

②还原法：肽链C端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的α―氨基醇。

肽链完全水解后，代表原来C―末端氨基酸的α―氨基醇，可用层析法加以鉴别。

③羧肽酶法：是一类肽链外切酶，专一的从肽链的C―末端开始逐个降解，释放出游离的氨基酸。

被释放的氨基酸数目与种类随反应时间的而变化。

蛋白质中氨‎基酸的含量‎测定组成蛋白质‎的基本单位‎是氨基酸，氨基酸通过‎脱水缩合形‎成肽链。

蛋白质是由‎一条或多条‎多肽链组成‎的生物大分‎子，其含量测定‎是生化药品‎研究中最常‎用、最基本的分‎析方法之一‎。

目前其常用‎的测定方法‎有凯氏定氮‎法、福林酚法、双缩脲法、BcA法、考马斯亮蓝‎法、紫外分光光‎度法及荧光‎法。

1凯氏定氮‎法1．1方法本法系‎依据蛋白质‎为含氮的有‎机化合物，当与硫酸和‎硫酸铜、硫酸钾一同‎加热消化时‎使蛋白质分‎解，分解的氨与‎硫酸结合生‎成硫酸铵。

然后碱化蒸‎馏使氨游离‎，用硼酸液吸‎收后以硫酸‎滴定液滴定‎，根据酸的消‎耗量乘以氮‎转化为蛋白‎质的换算系‎数，即为蛋白质‎的含量。

本法各国药‎典收载的方‎法一致。

故参照《中国药典》2005年‎版三部[41附录方‎法，按纯蛋白类‎供试品及添‎加无机含氮‎物质及有机‎非蛋白质含‎氮物质的供‎试品分别拟‎定各测定方‎法。

1．2讨论1．2．1凯氏定氮法‎虽耗时较长‎，但它是蛋白‎质测定方法‎中最经典的‎测定方法，本法所测的‎结果为蛋白‎质绝对浓度‎而非相对浓‎度，可用于标准‎蛋白质含量‎的准确测定‎。

1．2．2本法灵敏度‎较低，适用于O．2～2．o mg氮的测‎定，干扰少。

1．2．3蛋白质是复‎杂的含氮有‎机化合物，一般蛋白质‎的含氮量为‎16％，故含氮量转‎化为蛋白质‎的系数为6‎．25。

但由于不同‎蛋白质的结‎构差异，其换算系数‎会稍有区别‎，如乳制品为‎6．38，动物胶为5‎。

65等，因此一些特‎殊蛋白质应‎在各论中相‎应说吩其转‎化系数。

1．2．4在本法附注‎中起草了非‎蛋白氮供试‎品溶液制备‎的两种常用‎方法用于非‎氮的测定，一般采用钨‎酸沉淀法，但当供试品‎中含有氨基‎酸(精氨酸)时，由于其会影‎响蛋白质的‎沉淀，故建议采用‎三氯醋酸沉‎淀法方法(1)与方法(3)的线性相关‎系数均能达‎到0．999以上‎，较理想；方法(1)试剂配制繁‎琐且整个实‎验费时长，而方法(3)操作更简便‎快速。

生物化学（第三版）课后习题详细解答第三章氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。

蛋白质中的氨基酸都是L型的。

但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。

参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。

此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。

除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。

氨基酸是两性电解质。

当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。

在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。

某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI 表示。

所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。

α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（ Edman反应）。

胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。

半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。

这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。

除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。

比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。

参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。

核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。

氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。

常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。

习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。

食品中的氨基酸含量分析方法在我们生活中，各种食品中都含有丰富的营养成分。

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，因此在食品中的氨基酸含量分析具有重要的意义。

正确的氨基酸含量分析方法对于我们评价食品质量，提高饮食健康具有重要的意义。

一、氨基酸的分类和特性氨基酸是一类含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)的有机分子，能够和其他氨基酸通过肽键结合在一起形成多肽和蛋白质。

按照侧链的性质和结构，氨基酸可被分为20种不同的类型。

氨基酸的性质非常特殊，它们能够在弱酸和弱碱中形成离子。

当氨基酸处于酸性环境中，羧基离去负电荷会更多，并采取负离子的形式，而氨基则会处于非离子状态。

反过来，当氨基酸处于碱性环境中，则氨基会处于离子状态，而羧基则会存在于非离子形态。

这种离子形态和非离子形态的变化使氨基酸在不同条件下具有不同的功能和特性。

二、氨基酸含量分析方法1.经典几何分析法经典几何分析法是一种重量测定法，通过氧化重量法或氢解重量法测量蛋白质样品的重量，并计算出样品中氨基酸含量的百分比。

然而，这种方法具有较大的误差，且需要大量的样品，在实验室中已经不常被使用。

2.直接测定法直接测定法是通过直接测定氨基酸在样品中的含量，然后计算出总蛋白质的含量。

常用的直接测定法有比色法、荧光法和色谱法。

比色法是一种基于酚酞(phenol red)的指示剂的分析方法，可以测定氨基酸的含量。

此外，还有一些比色反应也可以用来检测氨基酸含量。

这种方法的准确性较高，而且可以应用于不同种类的样品中。

荧光法利用氨基酸的荧光特性测量其含量。

荧光分析技术的灵敏度很高，但相对比色法来说，其选择性较差。

色谱法是一种常用的氨基酸分析方法，包括气相色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳。

这些方法具有灵敏度高、准确性高、选择性好等特点。

气相色谱法适用于挥发性氨基酸的测定，而高效液相色谱法和毛细管电泳则适用于非挥发性氨基酸的测定。

三、氨基酸含量分析方法的应用氨基酸含量分析方法在食品行业中有广泛的应用。

反相高效液相色谱—紫外吸收法测定灵芝中氨基酸的含量0一;{药物分析杂志反相高效液相色谱一紫外吸收法测定灵芝中氨基酸的含量商振华于亿生郭为蒋辉r——(百;;磊大连化学物理研究所l16.12)A采用本实验室自行制备的反相高技涟相色谱桂,以醋酸钠缓冲液和乙温下对常见的16种1一氟一2.4一二硝基苯(FDNB)衍生化氨基酸进行了有效的分离,用紫外吸收检测器(360nm)和外标定量法对灵芝蛋白中各种氨基酸的含量进行了测定.结果表明:FDNB衍生化氨基酸在一周内是稳定的,回收率在96～102之间,相对标准偏差小于4N一灵芝中含有人体必需的赖氨酸,苯丙氨酸和组氨酸等组分关毽词1一氟一2,4一二硝基苯预柱衙生初级和扶毁氨基酸反相拄紫外吸收检测灵芝I一一———————～～氨基酸分析报道的方法有离子交换柱分合相填料,10m,匀浆法装填.ZS0mm×离一茚三酮显色.’:,反相液相色谱分离一邻苯二甲醛,丹酰氯.,9一芴甲基氯甲酸酯”等荧光衍生测定方法近些年来又发展出了可直接采用紫外吸收检测的一些新方法.其衍生化试剂有1一氟一2.4一二硝基苯(FDNB).1一氟一2—4～二硝基一5一L一丙氨酰胺”,N,N一二乙基一2,4一二硝基一5一氟苯胺(FDNDEB).异氰酸苯酯(PITC)等.其特点是:衍生化产物在特制的反相高效柱上分离,在可变波长紫外吸收检测器上测定,大多能同时对初级和次级氨基酸进行定量.我们用国产原料制备了反相氨基酸专用分析柱,在45min内对l8种氨基酸进行有效分离.于360nm检测,最小检出量可达10pmol/L,并对灵芝蛋白中各氨基酸含量进行了测定.实验部分一,仪器与试剂GAD—LN007高效液相色谱仪(法国GiLson公司);506接口;305型高压输液泵(--台);806压力传感器;NEc—APCⅣ型微处理机,GiLson714色谱软件;811A动力学混合器;Rheodyne7125进样阀;116型可编程序紫外吸收检测器;色谱柱:AA05反相键车谋墨为国掌自妻复科学基盘贷助项目4.6ram(内径)FDNB(分析纯,Merck公司产)在棕色量瓶中配制成1乙腈(光谱纯)溶液于4C下避光保存,供衍生化用.其它试剂均为分析纯;去离子水经二次蒸馏.用超声波发生器严格脱气.L一氨基酸标准品(光谱纯,Sigma公司产)灵芝样品(山西运城市灵芝研究所提供) 二,供试品溶液的制备1.灵芝蛋白的水解取灵芝样品,用去离子水洗净.80C烘干,研成细粉(<200 目).110C烘至恒重.精密称取一定量,置于带铝箔盖的锥形水耩反应瓶中,加6mol/L盐酸lml,抽去瓶中空气.通人干燥氩气,抽去氩气?再通人氢气,盖紧瓶口.于110C水解2地.放冷至室温,取水解液离tL,sm(4000r/ rain)-过滤?滤液用2tool/L氢氧化钠溶液中和至中性.2.氨基酸标准品和样品水解液的衍生化取氨基酸标准品和样品水解蔽各lml-分别置于10ml棕色量瓶中.加0.5mol/L碳酸氢钠溶液(pH9.0)lm1.1FDNB乙腈溶液1m1.混匀.于60(避光反应lh.待反应液冷至室温,加0.01mol/I磷酸氢■钾溶液(pH 70)至刻度.摇匀.取Jml,离心f4000r/n)10min,取10,ul进样.结果和讨论一FDNB衍生化氨基酸的分离1.柱效对分离的影响为了使16种氨基酸在较短时间内获得好的分离,选用填料粒度均匀,键台量适中.又经封尾处理的高效分离柱.按表l所列实验条件,用匀浆法制备氨基酸专用色谱柱.每米柱效均接近或超过l00000塔板数.分离结果见图l由于选用的流动相含盐浓度很低(60mtool/L),又接近于中性(pH6.45),因此,既不会造成对进样阀,泵,管路等的堵塞和腐蚀,叉不会损坏仪器和色潜柱,而且操作压力适中(8～15MPa).采用增加乙腈含量的梯度洗脱模型,能保证生成的衍生化产物和填料表面键台相间的快速质量传递,从而使与固定相有较强相互作用的憎水性氨基酸(如}Ile,Let,,Phe,Lys等)也能保持峰型的对称性和较高的分离效能.少量有机改性剂N,一二甲基甲酰胺的加入,有利于减弱强憎水性氨基酸与键合相之间的相互作用提高柱效结果表明:一根柱效达20000塔板数的色谱柱(一般为20～25cm)就能使16种常见氨基酸获得满意的分离.表lFDNB衍生化氨基酸在AA05反相柱上的分离条件色谱住流量柱压降冲l;芒剂梯匪模型拉测器柱温AA05型键台相柱-10±2t,m250ram×46ram1ml_mI2～g6MPaA160mtool’L醋酸钠(pH645)1N.N一Ⅲ二甲基甲酰胺(V—V) B己睛水(1:lV/V)性;_司(mIn)0230745组成(BJ15304070】00UV6Ohm.…AUFS’室温(2a～23()-【03O∞ii1{__凹1在AA05反相桂上常见氨基酸的舟离谱图1.Axp2Olu3Set4.DNPOH5杂质6Gly.Thr8.Pro9AlajnArgIlV al12Met13liel4Leu15Trpl6.Phe】7.Hl$l8Lvs2梯度洗脱模型的选择要使16种氨基酸在较短时间内获得好的分离,除柱效外,梯度洗脱模型的选择也很重要(见图1)若流动相从100A开始,则会使Asp,Glu,Ser等强极性氨基酸出峰时间拖后,延长分离时间.若乙腈一水起始含量过高或在7～23rain问的梯度陡度过大,则会使副产物DNP～OH与Gly,Thr,Pro,Ala,Arg间的分离度变小.影响定量精度.若不适时地增加23～27rain及37 ～45rain问的梯度陡度,则会延缓中性氨基酸V al,lie,Leu及强憎水性氨基酸Phe,Trp,tys等的出峰时间,使分析时间拖长.在表1所列梯度模型下,45rain即可完成16种氨基酸的分离,一般色谱柱平衡时问只需5mir,,分离的重复性也很好,保留时间误差小于1.药物分析杂志二,FDNB衍生化氨基酸的稳定性若将FDNB衍生化产物在室温下暴嚣于空气中,结果表明:24h后大部分氨基酸含量降低5以上,3天后则降低2o以上.若在室温下避光保存,3天后其含量变化仍小于5,即使放置一周,其含量变化仍在5以内.4C下避光保存3o天,除Met,Trp,His含量变化分别为6.8,7.5,9.2外,其余氨基酸的含量变化仍小于5.这说明FDNB衍生化氨基酸只要严格避光保存,是相当稳定的.三,灵芝中氨基酸含量测定灵芝含有丰富的有机酸,有机锗,多糖体,氨基酸等.图2是灵芝样品蛋白经水解后,采用FDNB衍生化法所生成的氨基酸在AA05 反相色谱柱上的分离结果.若将水解反应温度提高到150C.则水解反应在8h内即可完成,1,/l\LE05D…图2灵芝中各种氨基酸在反相拄上的升离结果色谱蜂号同图1本实验采用外标法,将16种氨基酸分成两组,配置不同浓度标样,衍生化后再经色谱分离,测定不同浓度下各氨基酸的峰面积,计算出响应因子,根据响应因子直接算出灵芝样品中相应氨基酸的含量,结果见表2.各氨基酸的回收率和相对标准偏差(n=5)也汇总在表2中.回收率实验采用标准加样的方法,在灵芝水解前将经过准确称量的标准氨基酸加人样品中,根据分离后的峰面积与未加标准样的结果计算回收率.除Trp外,其它氨基酸的回收率均在96～102之间,相对标准偏差均小于4.表2结果表明:灵芝中氨基酸的含量大约为总重量的3.4,尤其富含人体所必需的His,Phe和Lys,这3种氨基酸含量约占85,远高于其它氨基酸含量.图2的分离结果未发现胱氨酸和半胱氨酸,是否在强酸水解过程中被降解破坏掉了,有待进一步研究.裹2曼芝中各种氯基蘸吉■的舅定结果参考文献1MooreS.SpackmanDHandSteinWHChromatography Dfaminoaektsonsulfonatedpolystyrene~sinsAnal Chem,1958.30(7)I1185～11902UheAM,colllerGR,McLermmnEA,eta1.Quandta. tionoftryptophaaandotherD1Ⅱsmaaminoacidsbyauto- matedpre?colmno?Phthaldialdehydedefivat~atmn HPLC:improvedsamplep~paratlonJChromatogr,1991, 564(1):81～913BaeysnsW,BruggemanJandLinB.EnhancedchemUuml一一detectionof$omedansylaminoacidsinliquid ehromatograp.Chromatograph/a,1989.27(5--6):191～1944BlankenshipDT.KfivanekMA.AckermaanBL,eta1.High-sensltivltyaminoacidsanalysisbydefivat~atmn14(4).1994?33?with…phth1a[dehydeand9fluorenylraethylchlorofor—mateusingu.rescencedetection:applicationinprotein structuredete~ination.AhalBiochem,1989,178(2):227～2325陈亚兰.付宜和,王国林等十八种氨基酸注射液的HPLC 2,4一二硝基氟苯柱前衍生化法音量测定.药物分析杂志?1990-10(9):149～1516KochharSandChristenP.AmlaoacidanalysishyHPLC afterderivatizationwith1Iluoro2.4一dinitropheny[一51一alanineamide.AhalBiochem.1989,178:17～217Fem帕I,RubinoFM,BolzaceiniE,eta1.Pre—column deri…tiationofaminoacidswithN,N—diethy]一2,4一dinitro一5一fluoroanlhaeandreversed—phaseliquidrD-raatngraphicseparation.JChromatogr,1988’433:53～628徐康森.郝苏丽.孙桂英等.高教液相一pico?TagTM量快速分析氨基酸药物分析杂志,1988t8(5):船3～287(本文于1992年9月20日收刊) TheSeparationofAminoAcidsinGlossyGanodermaon ReversedPhaseColumnandQuantitativeDetermination wihtUVAbsorptionDetectorShangZhenhua?YuYinian-GuoWei?JiangHuiandWangJunde (Datianlnsfftla~ofChemicalPhsicsAcademiaSinicaDatian116012) Theprimaryandsecondaryaminoacidsproducedinpreeolumnderivatizatio nwith1--fluo—m一2.4--dinitrobenzene(FDNB)havebeenefficientlyseparatedonthereversedph asecolumn preparedinourlaboratoryatambienttemperature.Asimplelineargradientelu tionwithacetate bufferandaeetonitrilesolutionisusedformobilephaseduringtheseparation. Themethodhas beensuccessfullyappliedtothequantitativedeterminationofaminoacidsofh ydrolysedprotein.fglossyganoderma.The.FDNBderivativesofaminoacidsaremorestableth anthoseintradi—tionalmethods.Themethodhashighrecoveryandgoodaccuracy. Keywords:pre—columnderivatizationwith1--fluoro一2,4--dinitrobenzene:primaryandsecondaryaminoacids:reversedphasecolumn;UVabsorptiondetection:glo ssyganoderma。

用fdnb法和edman降解法测定蛋白质原理
FDNB法和Edman降解法是两种常用的测定蛋白质氨基酸序列的方法。

1. FDNB法（硫氰酸二硝基苯酯法）：
该方法是通过将硫氰酸二硝基苯酯（FDNB）与蛋白质中的内源性氨基酸中的氨基团（主要是赖氨酸）反应，形成黄色的光吸收化合物，从而定量分析蛋白质中该氨基酸的含量。

原理如下：
- FDNB与蛋白质中的氨基团反应，生成硫氰酸羰基二硝基苯酯（一种黄色产物）。

这个反应对于其中部分内源性氨基酸特异性，而对于其他氨基酸不起反应。

- 通过测定生成物的吸收光谱，可以知道蛋白质中该氨基酸的含量。

2. Edman降解法：
该方法是通过将蛋白质中的N末端氨基酸（谷氨酸或其他）与二硫苯酚（Edman试剂）反应，生成稳定的二硫苯酚胺酸衍生物，然后脱去N 端衍生物，并对其进行定量分析，以确定蛋白质的序列。

原理如下：- 蛋白质与Edman试剂反应生成二硫苯酚胺酸衍生物。

这个反应对于N 末端氨基酸特异性，而对于其他氨基酸不起反应。

- 通过将衍生物从蛋白质上脱去并采用高效液相色谱等分析方法，可以确定蛋白质的N末端氨基酸。

- 重复该过程，每次逐步分析蛋白质的N末端氨基酸，可以得到其序列信息。

这两种方法都可用于测定蛋白质的序列信息，具体选择哪种方法取决于蛋白质的性质和实验要求。

蛋白质化学一、填空题1．氨基酸的等电点pI是指。

2．氨基酸在等电点时，主要以离子形式存在，在pH>pI的溶液中，大部分以离子形式存在，在pH<pI的溶液中，大部分以离子形式存在。

3．在生理条件下(pH7.0左右)，蛋白质分子中的侧链和侧链几乎完全带正电荷，但是侧链则带部分正电荷。

4．通常球状蛋白质的氨基酸侧链位于分子内部，氨基酸侧链位于分子表面。

5．蛋白质中的Phe、Trp和 3 种氨基酸具有紫外吸收特性，因而使蛋白质在nm 处有最大吸收值。

6．DEAE-纤维素是一种交换剂，CM-纤维素是一种交换剂。

7．天然蛋白质中的α—螺旋结构，其主链上所有的羰基与亚氨基氢都参与了链内键的形成，因此构象相当稳定。

8．大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为，如测得1克样品含氮量为10mg,则蛋白质含量为。

9．精氨酸的pI值为10.76,将其溶于pH7的缓冲液中，并置于电场中，则精氨酸应向电场的方向移动。

10．组成蛋白质的20种氨基酸中，含有咪唑环的氨基酸是，含硫的氨基酸有和。

11．蛋白质的二级结构最基本的有两种类型，它们是和。

12．酪氨酸的α－氨基的pK’＝2.2，α－羧基的pK’＝9.11，酚羟基的pK’＝10.9，则酪氨酸的等电点为，在pH＝7.0的溶液中电泳它泳向极。

13．α-螺旋结构是由同一肽链的和间的键维持的，螺距为,每圈螺旋含氨基酸残基，每个氨基酸残基沿轴上升高度为。

天然蛋白质分子中的α-螺旋大都属于螺旋。

14．球状蛋白质中有的氨基酸残基常位于分子表面而与水结合，而有的氨基酸位于分子的内部。

15．氨基酸与茚三酮发生氧化脱羧脱氨反应生成化合物，而与茚三酮反应生成黄色化合物。

16．维持蛋白质的一级结构的化学键有和；维持二级结构靠键；维持三级结构和四级结构靠键，其中包括、、和。

17．稳定蛋白质胶体的因素是和。

18．GSH的中文名称是，它的活性基团是。

19．加入低浓度的中性盐可使蛋白质溶解度，这种现象称为，而加入高浓度的中性盐，当达到一定的盐饱和度时，可使蛋白质的溶解度并，这种现象称为，蛋白质的这种性质常用于。

2 蛋白质化学1．用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？基本原理是什么？2,4―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。

解答：（1） N-末端测定法：常采用2,4―二硝基氟苯(DNFB或FDNB)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与2,4―二硝基①2,4―DNFB）反应（Sanger反应），生成DNP―多肽或DNP―蛋白质。

由于DNFB与氨氟苯（基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP―多肽经酸水解后，只有N―末端氨基酸为黄色DNP―氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。

②丹磺酰氯(DNS)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与与丹磺酰氯（DNS―Cl）反应生成DNS―多肽或DNS―蛋白质。

由于DNS与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNS―多肽经酸水解后，只有N―末端氨基酸为强烈的荧光物质DNS―氨基酸，其余的都是游离氨基酸。

③苯异硫氰酸脂（PITC或Edman降解）法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）反应（Edman反应），生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。

在酸性有机溶剂中加热时，N―末端的PTC―氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N―末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。

④氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，能从多肽链的N端逐个地向里切。

根据不同的反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N端残基序列。

（2）C―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。

肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。

②还原法：肽链C端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的α―氨基醇。

肽链完全水解后，代表原来C―末端氨基酸的α―氨基醇，可用层析法加以鉴别。

③羧肽酶法：是一类肽链外切酶，专一的从肽链的C―末端开始逐个降解，释放出游离的氨基酸。

氨基酸常用的检测方法和原理氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。

因此，准确、快速地检测氨基酸的方法和原理是科学研究和实际应用中的关键问题之一。

本文将介绍几种常用的氨基酸检测方法及其原理。

一、纸层析法纸层析法是一种简单、快速的氨基酸检测方法。

其原理是根据氨基酸在纸上的迁移速度差异来分离和检测氨基酸。

首先，将待测样品与色谱溶剂混合，然后将混合液滴在纸上，待溶剂上升至一定高度后，根据不同氨基酸的迁移距离和颜色变化，可以判断样品中是否含有特定的氨基酸。

二、高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是一种精确、灵敏的氨基酸检测方法。

其原理是利用氨基酸在液相中的分配系数差异来实现分离和检测。

首先，将待测样品通过色谱柱进行分离，然后通过检测器检测样品中各种氨基酸的浓度。

由于不同氨基酸的分配系数不同，它们在色谱柱中的停留时间也不同，从而实现了氨基酸的分离和检测。

三、毛细管电泳法毛细管电泳法是一种高效、快速的氨基酸检测方法。

其原理是利用氨基酸在电场作用下在毛细管中的迁移速度差异来实现分离和检测。

首先，将待测样品注入毛细管中，然后施加电场，通过检测器检测样品中各种氨基酸的浓度。

由于不同氨基酸的电荷性质和大小不同，它们在电场作用下的迁移速度也不同，从而实现了氨基酸的分离和检测。

四、质谱法质谱法是一种高精确度、高灵敏度的氨基酸检测方法。

其原理是利用氨基酸分子在质谱仪中的质量-电荷比差异来实现分离和检测。

首先，将待测样品通过质谱仪进行分离，然后通过检测器检测样品中各种氨基酸的质量-电荷比。

由于不同氨基酸的分子量不同，它们在质谱仪中的质量-电荷比也不同，从而实现了氨基酸的分离和检测。

纸层析法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和质谱法是常用的氨基酸检测方法。

每种方法都有其独特的原理和优势，可以根据实际需要选择合适的方法进行氨基酸的检测。

这些方法的应用不仅在科学研究中具有重要意义，也在食品、医药等领域有着广泛的应用前景。

氨基酸测定方法一、引言氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，对于生命体的生长和发育起着重要的作用。

因此，准确测定氨基酸的含量和组成对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。

本文将介绍一些常用的氨基酸测定方法，包括色谱法、光谱法和化学法等。

二、色谱法测定氨基酸2.1 气相色谱法气相色谱法是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。

该方法通过将氨基酸样品转化为易挥发的衍生物，然后使用气相色谱仪进行分析。

气相色谱法具有分离效果好、灵敏度高和操作简便等优点。

2.1.1 衍生化反应在气相色谱法中，常用的氨基酸衍生化反应包括酯化、酰化和取代反应等。

这些反应能够将氨基酸转化为易挥发的衍生物，便于后续的气相色谱分析。

2.1.2 气相色谱仪气相色谱仪是进行气相色谱分析的关键设备。

它由进样系统、色谱柱和检测器等部分组成。

进样系统用于将样品引入色谱柱，色谱柱用于分离氨基酸衍生物，检测器用于检测分离后的化合物。

2.2 液相色谱法液相色谱法也是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。

该方法通过将氨基酸样品溶解在溶剂中，然后使用液相色谱仪进行分析。

液相色谱法具有分离效果好、灵敏度高和选择性强等优点。

2.2.1 色谱柱选择在液相色谱法中，选择合适的色谱柱对于分离氨基酸非常重要。

常用的色谱柱包括离子交换柱、反相柱和手性柱等。

不同的色谱柱具有不同的分离机理和选择性，可以根据需要选择合适的色谱柱。

2.2.2 梯度洗脱条件在液相色谱法中，通过调整洗脱溶剂的组成和流速等参数，可以实现对氨基酸的有效分离。

梯度洗脱条件可以根据氨基酸的亲水性和极性等特性进行优化。

三、光谱法测定氨基酸3.1 紫外-可见光谱法紫外-可见光谱法是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。

该方法通过测量氨基酸在紫外-可见光波段的吸收特性，来推断其含量和组成。

紫外-可见光谱法具有操作简便、灵敏度高和选择性强等优点。

3.1.1 吸收峰特征不同氨基酸在紫外-可见光谱中具有不同的吸收峰特征。

通过测量氨基酸的吸收峰强度和位置，可以推断其含量和组成。

第一章蛋白质（一）名词解释1.两性离子（dipolarion）2.必需氨基酸（essential amino acid）3.等电点(isoelectric point,pI)4.稀有氨基酸(rare amino acid)5.非蛋白质氨基酸(nonprotein amino acid)6.构型(configuration)7.蛋白质的一级结构(protein primary structure)8.构象(conformation)9.蛋白质的二级结构(protein secondary structure)10.结构域(domain)11.蛋白质的三级结构(protein tertiary structure)12.氢键(hydrogen bond)13.蛋白质的四级结构(protein quaternary structure)14.离子键(ionic bond)15.超二级结构(super-secondary structure)16.疏水键(hydrophobic bond)17.范德华力( van der Waals force)18.盐析(salting out)19.盐溶(salting in)20.蛋白质的变性(denaturation)21.蛋白质的复性(renaturation)22.蛋白质的沉淀作用(precipitation)23.凝胶电泳（gel electrophoresis）24.层析（chromatography）(二)填空题1.蛋白质多肽链中的肽键是通过一个氨基酸的_____基和另一氨基酸的_____基连接而形成的。

2.大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为___%，如测得1克样品含氮量为10mg,则蛋白质含量为____%。

3.在20种氨基酸中，酸性氨基酸有_________和________2种，具有羟基的氨基酸是________和_________，能形成二硫键的氨基酸是__________.4.蛋白质中的_________、___________和__________3种氨基酸具有紫外吸收特性，因而使蛋白质在280nm处有最大吸收值。

氨基酸的含量测定方法
氨基酸的含量可以用不同的方法进行测定，以下是其中几种常用的方法：
1. 紫外吸收法（UV法）：氨基酸分子中存在芳香族环和烯烃键，可以吸收紫外光，根据吸收的强度来确定氨基酸的浓度。

2. 高效液相色谱法（HPLC法）：这是一种常用的测定氨基酸含量的方法，通过将样品中的氨基酸溶解后注入液相色谱仪中，利用氨基酸在不同条件下的保留时间和峰面积来测定其含量。

3. 伯里特法：伯里特试剂能与氨基酸发生比色反应，该方法适用于测定含有酪蛋白、皮质素等色泽较重的氨基酸的含量。

4. 显色法：该方法将氨基酸和特定试剂反应，生成显色产物，根据产物的颜色深浅来测定氨基酸含量。

常用的显色试剂有二。

18种氨基酸检测方法【原创版4篇】目录（篇1）I.氨基酸检测方法概述1.氨基酸是生命中必不可少的有机化合物2.18种氨基酸是人体必需的营养物质3.氨基酸检测方法的研究意义II.氨基酸检测方法介绍1.传统检测方法2.现代检测方法3.新型检测方法III.氨基酸检测方法优缺点分析1.传统检测方法的优缺点2.现代检测方法的优缺点3.新型检测方法的优缺点IV.氨基酸检测方法应用前景展望1.在医疗领域的应用2.在食品行业的应用3.在其他领域的应用正文（篇1）一、氨基酸检测方法概述氨基酸是生命中必不可少的有机化合物，它们在人体内扮演着重要的角色。

人体内有18种氨基酸，其中一部分是由身体自身合成的，而其余的部分必须从食物中摄取。

因此，氨基酸检测方法的研究对于了解人体健康状况具有重要意义。

传统的氨基酸检测方法较为繁琐，需要耗时费力，而现代的检测方法则更加快速、准确、简便。

例如，高效液相色谱法、质谱法等。

此外，近年来还出现了一些新型的检测方法，如表面增强拉曼光谱法、近红外光谱法等。

二、氨基酸检测方法介绍1.传统检测方法：传统的氨基酸检测方法主要包括化学法、电泳法、色谱法等。

化学法是通过测定氨基酸的化学反应来测定其含量，但操作繁琐、误差较大；电泳法是通过氨基酸在电场中的迁移率来测定其含量，但需要消耗大量的样品；色谱法是通过氨基酸在色谱柱中的分离来测定其含量，但需要消耗大量的样品。

2.现代检测方法：现代的氨基酸检测方法主要包括高效液相色谱法、质谱法等。

高效液相色谱法是一种基于色谱分离技术的分析方法，可以快速、准确地分离和测定多种氨基酸；质谱法是一种基于质谱分离技术的分析方法，可以同时测定多种氨基酸，但需要消耗大量的样品。

3.新型检测方法：新型的氨基酸检测方法主要包括表面增强拉曼光谱法、近红外光谱法等。

表面增强拉曼光谱法是一种基于拉曼散射技术的分析方法，可以在不破坏样品的情况下快速、准确地测定多种氨基酸；近红外光谱法是一种基于光学技术的分析方法，可以在不破坏样品的情况下快速、准确地测定多种氨基酸。

用fdnb法和edman降解法测定蛋白质原理用FDNB法和EDMAN降解法测定蛋白质的原理是相同的，都是通过测定蛋白质的N-末端氨基酸序列来推断蛋白质的结构和功能。

FDNB法（Sanger反应）是多肽链N末端氨基酸与FDNB（2，4-二硝基氟苯）反应生成二硝基苯衍生物（DNP-蛋白），然后将其进行酸水解，打断所有肽键，N末端氨基酸与二硝基苯基结合牢固，不易被酸水解。

水解产物为黄色的N端DNP-氨基酸和各种游离氨基酸。

将DNP-氨基酸抽提出来并进行鉴定可知N端氨基酸的种类，但不能测出其后氨基酸的序列。

EDMAN降解法是通过循环3个化学反应实现N末端氨基酸的序列测定。

其基本原理是利用异硫氰酸苯酯(PITC)特异性识别并连接在待测蛋白质的N端氨基酸上形成PITC-蛋白复合物；在酸处理条件下，PITC连接的N端氨基酸被切割，形成不稳定的PITC-氨基酸复合物；被萃取的PITC-氨基酸复合物在酸性条件下转化为稳定的苯基乙内酰硫脲(PTH)衍生物；最后利用高效液相色谱HPLC鉴定氨基酸种类。

每次EDman 反应只断裂一个氨基酸，将少了一个氨基酸的多肽链进行回收并重复以上操作，直到最后鉴定出N末端的氨基酸排列
顺序。

以上信息仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士。

茚三酮比色测定氨基酸含量1）原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。

该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。

2）试剂①1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2▪H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。

滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。

②pH8.04磷酸缓冲液：Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。

Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。

Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。

③氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL常量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。

3）操作方法①标准曲线绘制准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。

静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。

以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。