干扰素的工艺制备流程39页PPT

(l)溶解氧控制 分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期 提高干扰素的发酵水平。通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。
(2).温度控制 假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。产物 合成温度控制在20℃可以有效防止干扰素-α 2b的降解，而其最佳生长温度则 为30℃。质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降，因此在培养后期降温可以 减少目标产物的降解，增加质粒的稳定性。
30℃ ，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3-4小时，转入发 酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌。
3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%,培养温度30℃,pH7.0。
级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%,培养4小时。然后控制培养温度20℃ ， pH6.0,溶解氧60%,继续培养5-6.5小吋。同时进行发酵液杂菌检查，当0D值达9.0±1.0后， 用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入 冰块使温度迅速降至10℃以下。
提取重组质
粒②
3、碱裂解法
1）将洗过的500ml培养物的细菌沉淀物[来自收获细菌的步骤3]重悬于10ml(18ml) 溶液Ⅰ中。
溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
10mmol/L EDTA(Ph8.0)
溶液Ⅰ可分批配制，在10 1bf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟， 贮存于4 ℃。
流程:步骤一:将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基上培养,就可得到质粒 PBR322或重组质粒的细菌单菌落。
步骤二:步骤一获得的每一个细菌单菌落标记为a、b、c、d等,在每一 个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上,不能生长的是绝大部 分含有重组质粒的细菌及少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原 因:因为PBR322含有抗四环素基因,重组质粒中目的基因插在抗四环素基因中, 使其结构破坏,失去抗四环素作用。

路线4：
动物无限细胞系培养生产工艺：
上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格
路线5：
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺： 宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） 上市产品：IFN α-2b/安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子 结构和生物活性 工艺特点： 发酵周期短：几个小时 无需变性、复性过程，获得有活性产品 纯化过程：淘汰抗体亲和层析
适应症：
1.用于多种恶性肿瘤，包括毛细胞白血 病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓 瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期转移性肾 癌及胰腺恶性内分泌肿瘤、黑色素瘤 和Kaposi肉瘤等。 2.与其他抗肿瘤药物并用。 3.作为放疗、化疗及手术的辅助治疗剂。 4.病毒性疾病的防治。

不良反应：

1.全身反应主要表现为流感样症状，即寒战、 发热和不适。 2.骨髓抑制在用药中可出现白细胞、血小板 和网状红细胞减少。
路线2：
人源转化细胞系培养生产工艺： 1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点： 活性低，退出临床应用。
路线3： 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。

提取重组质 粒④
7)用合适转头于室温以5000转/分离心15分钟，回收核酸。如于4 ℃离心， 盐也会生成了沉淀。 8)小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,于室温用70%乙醇 洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所 有液滴，于室温将瓶倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。 9)用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀. 10)纯化。
质粒DNA的纯
化①
（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA
1)将核酸溶液所得转入15mlCorex管中，再加3ml用冰预冷的5mo1/L LiCl溶液， 充 分混匀，用合适转头于4 ℃下以10000转/分离心I0分钟。LiCI可沉淀高分子RNA。
2)将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34 转头(或与其相当的转尖)于室温以10000转/分离心10分钟，回收沉淀的核酸。
白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标 作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。
(6)残余外源性DNA含量测定 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于
100pg. (7)残余血清lgG含量测定 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法吋必须进行此项检定。
重组体引入宿主 细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒pBR322中,转化到大肠杆菌,重组的载体 DNA 分子在 一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。
从大肠杆菌K12获取目 的基因
由于质粒重组时有3种基本方式,即:目的基因与克隆载体重组,目的基因片段与 目的基因片段重组,克隆载体与克隆载体重组;另外重组过程可能会发生基因突 变情况

演示完毕！谢谢
4. 人γ干扰素 上海生物化学研究所 中国预防医学科学院 卫生部上海生物制品研究所 第二军医大学 上海克隆生物高技术有限公司 珠海丽珠制药有限公司
干扰素生产工艺路线:
路线1：
体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞 1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市 产量低：1g IFNα，需要 3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性
配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和 10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至 2℃～10℃。 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解： 2℃～10℃，匀浆，完全溶解。

2.沉淀与疏水层析




等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀 杂蛋白，离心收集上清液。 疏水层析： 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。 等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电 导值40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜
2.预处理-沉淀：

加絮凝剂聚乙烯亚胺:
加凝聚剂醋酸钙溶液:
2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。

2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉 淀。
3.离心：
连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
药理作用：


1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是 抑制病毒，它一般为广谱病毒抑制剂，对 RNA和DNA病毒都有抑制作用。 2.抑制细胞增殖。干扰素抑制细胞分裂的活 性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性比 正常细胞大500～1000倍。干扰素抗肿瘤效 果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过 宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。

(2)蛋白质含量测定 福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。 (3)比活性 效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。
(4)纯度 电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一区带，经扫描 仪测定纯度应在95%以上。 (5)相对分子量测定 还原型SDS-PAGE,加样量不低于微克，同时用已知相对分子量的蛋
重组体引入宿主 细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒pBR322中,转化到大肠杆菌,重组的载体 DNA 分子在 一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。
从大肠杆菌K12获取目 的基因
由于质粒重组时有3种基本方式,即:目的基因与克隆载体重组,目的基因片段与 目的基因片段重组,克隆载体与克隆载体重组;另外重组过程可能会发生基因突 变情况
干扰素又依其结构分为1b2a2b等亚型基因工程菌的制备目的基因的分离目的基因与克隆重组导入大肠杆菌k12克隆载体载体的体外重组受体菌的培养从受体菌中获取目的基因及筛选重组质粒表达载体导入大肠杆菌受体菌的筛选表达性稳定性等检测工程菌目的基因的分离与获得重组体引入宿主细胞提取重组质粒质粒dna的纯化目的基因与克隆载体进行体外重组从大肠杆菌k12获取目的基因对重组质粒的检测与目的基因提取目的基因与表达载体的组合与导入工艺流程目的基因的分离与获得设计合成干扰素基因的两端引物完全的每条引物内或5端最好有内切酶酶切位点
(3).pH值 发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵 条件所决定。干扰素- α的等电点在pH6.0附近，在低酸性条件下稳定，能耐 受pH2.5的酸性环境。因此可在发酵后期降低pH,从而造成大量蛋白酶失活减 少干扰素-α的水解，提高干扰素的积累量。
半成品检定
(l)效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞VSV病毒为基本检测系统，测定中必 须用国家或国际参考品校准为国际单位。

• 其区别在于个别氨基酸的差异上,早期干扰素是用病毒
诱导人白血球产生的,产量低、价格昂贵,不能满足需
要，
,现在可利用基因工程技术并在大肠杆菌中
发酵、表达
来进行生产。
基因工程菌的制备
目的基因的分离 克隆载体
目的基因与克隆 载体的体外重组
重组导入大肠杆菌K12
受体菌的培养 及筛选
从受体菌中获取目的基因 表达载体
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
提取重组质
粒③
4）加15ml(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。 溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配制的的溶液对钾是3mol/L,对乙酸跟是5mol/L。 封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两
个液相。置冰 上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0 ℃放置后所形 成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。 5）用合适转头于4 ℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停 转。如果细 菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可 能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形 成致密沉淀块原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。 6）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室 温放置10分钟。

04
品种及其价位
普通干扰素分子小、作用时间短，一般情况下，普通干扰素注射12小 时后基本完全排出体外，因而需要多次注射，普通干扰素的注射方法可以 为隔一天注射一针或是一周注射三针。对于普通干扰素的价位，普通干扰 素价格比较低，300万剂量的普通干扰素价格一般在50-80元不等。 相对于普通干扰素，长效干扰素半衰期长，长效干扰素的半衰期长达 40小时，可以在乙肝患者体内持续作用168个小时，因而，长效干扰素一 周只需要注射一次，使用比较方便，而且提高了干扰素治疗的安全性。长 效干扰素价格相对较贵，长效干扰素的价格一般在1200-1500元之间。
科学家猜测，人的血液细胞里本身就存在干扰素。 后来研究证明，这种猜测是有道理的，通过精密的血液 分析，在人和许多动物的细胞中都找到了干扰素。
人们最初想到的是，通过血液制取干扰素。可惜， 干扰素在血液中的含量实在是太少了，用大量的血液才 能制得微量的干扰素，这种生产方式产量低得可怜，自 然价格也就十分昂贵。干扰素无法得到普及、推广。
抗肿瘤作用:干扰素可抑制细胞分裂，对正 常细胞和肿瘤细胞均有明显的抑制作用，对迅 速分裂细胞的抑制作用尤为明显。干扰素通过 抑制肿瘤病毒的增殖、肿瘤细胞的增生，改变 肿瘤细胞表面性能，诱发新的抗原，从而易被 免疫细胞识别并加以排斥，通过免疫调节作用， 可增强机体抗肿瘤能力，如激活巨噬细胞，增 强NK细胞功能等。
1957年，经过大量的实验,美国菌学家萨克斯发现， 在病毒的刺激下，细胞中会产生一种蛋白质，能抑制后 来病毒的侵染。萨克斯认为这种特殊的蛋白质能起到干 扰作用，就将其命名为“干扰素”。人类的许多疾病都 是由病毒引起的，再好的抗生素也拿它们没辙，可是干 扰素却是对付病毒的克星。
但是，要使干扰素成为药品，进入实际应用当中， 必须有足够的量。那么，如何获得大量的干扰素呢？人 们首先想到，用病毒刺激老鼠，让它们产生干扰素，再 提取出来供人使用，但是这种方法失败了。原因是干扰 素的活动场所很专一，老鼠体内产生的干扰素对人不管 用。所以最理想的办法是用人自身产生的干扰素。

5
以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物
目的基因与克隆载体进行体 外重组
1.提取载体(质粒、病毒等),双酶切,再 把干扰素基因的PCR产物用相应的 酶酶切,用连接酶连接
2.连接完成后分离纯化,测序,与原干扰 素序列比对。
3.鉴定序列无误后(无义突变也行),导 入受体细胞,筛选
4.菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000r/min离心收集。进行干扰
素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌 体于一20 ℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。
干扰素发酵过程控制
在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5 小时开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到 最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单孢杆 菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策 略进行过程控制。
干扰素制备的工艺流 程图
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
(3).pH值 发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵 条件所决定。干扰素- α的等电点在pH6.0附近，在低酸性条件下稳定，能耐 受pH2.5的酸性环境。因此可在发酵后期降低pH,从而造成大量蛋白酶失活减 少干扰素-α的水解，提高干扰素的积累量。