下载文档原格式
组织切片免疫荧光染色的具体步骤切片免疫荧光染色是一种常用的生物学实验方法，用于研究组织或细胞样本中的特定蛋白质标记。
下面是一般的切片免疫荧光染色的具体步骤：步骤一：取样步骤二：切片将固定的组织样本或细胞样本进行切片处理。
可以使用切片刀或者切片机来获得薄片。
切片的厚度往往是几微米到几百微米。
切片完成后，可以将其放在载玻片上。
步骤三：预处理载玻片上的切片需要进行一些预处理步骤，以去除可能会影响后续染色的物质，如脂质或其他杂质。
预处理步骤可能会包括洗涤、脱水和透明化等。
步骤四：抗原修复细胞或组织样本中的抗原有时会受到固定过程的影响，使得抗原无法与抗体结合。
因此，需要进行抗原修复步骤来恢复抗原的免疫原性。
抗原修复可以通过热处理、酸碱处理或酶解等方式进行。
步骤五：阻断非特异结合物为了减少非特异抗体的结合，需要使用一种阻断剂来防止非特异结合。
典型的阻断剂包括牛血清蛋白、胎牛血清等。
阻断剂可以在洗涤缓冲液中加入。
步骤六：初级抗体染色在预处理和阻断步骤之后，将含有特定初级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。
初级抗体是特异性结合到目标蛋白质的抗体。
孵育时间和温度可以根据实验的需要来确定。
步骤七：洗涤之后，用缓冲液洗涤样本，将未结合的抗体和杂质去除。
洗涤是非常重要的步骤，可以通过多次洗涤来提高特异性和背景的对比度。
步骤八：二级抗体染色二级抗体通常是带有荧光标记的抗体。
与初级抗体相比，二级抗体对特定的初级抗体更具选择性，并且能够增强荧光染色的信号。
将含有二级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。
步骤九：洗涤与前面的步骤类似，需要用缓冲液洗涤样本，去除未结合的二级抗体和杂质。
步骤十：荧光显微镜观察片片染色完成后，放入荧光显微镜中观察。
通过荧光显微镜，可以看到标记的荧光信号并进行图像记录和分析。
需要注意的是，切片免疫荧光染色步骤根据具体实验目的的不同可能会有所不同。
此外，具体的步骤和实验条件可以根据实验室的需要进行优化和修改。
组织免疫荧光步骤：
1）取出切片，用 M PBS冲洗5min×3次；
2）滴加10%正常山羊血清37℃封闭45 min；
3）吸去多余液体，加入抗TSHR的一抗（1：100），放入湿盒中，37℃孵育1h后置于4℃冰箱中过夜（保持在湿盒中）；
4） M PBS冲洗5min×3次；
（至下一步开始要适度避光操作，防荧光淬灭！）
5）在黑暗条件下加入山羊抗兔IgG-FITC（1：200），37℃温育45 min；6）在黑暗条件下吸弃二抗 (注：不再冲洗)，加入DAPI染液（μg/ml），室温作用20 min；
7）在黑暗条件下 PBS冲洗5min×6次；
8）在黑暗条件下防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。
核实好下边的问题你就可以操作了：
1、准备 M PBS 500 ml，冲洗时动作既要轻柔防脱片，又要保证冲洗
彻底；
2、抗TSHR的一抗用1：100，用抗体稀释液稀释；
3、实验室有没有山羊抗兔IgG-FITC，使用浓度是1：200；
4、DAPI染液（μg/ml）实验室有吗
5、防荧光淬灭剂封片实验室有吗。
免疫细胞荧光实验步骤
1.准备所需的仪器和试剂，如生物组织摊烤片机、普通冰箱、盖玻片、载玻
片、无水乙醇、3%双氧水、中性树胶、二甲苯、PBS缓冲粉、柠檬酸缓冲液等。
2.组织免疫荧光技术操作：将切片置于二甲苯中10分钟，进行脱蜡处理，然
后用100%，95%，85%和75%乙醇分别将切片置于其中，进行洗脱。
之后用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
3.热修复抗原：将切片浸入柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，在微波炉高火加热8
分钟，冷却后用PBS缓冲液洗涤3次。
4.加入3% H2O2，室温10分钟以灭活内源性酶。
然后用PBS缓冲液洗涤3
次。
5.封闭：将切片滴加血清并放入湿盒中，室温20分钟。
然后用PBS缓冲液洗
涤3次。
6.孵育一抗：将切片滴加适当稀释的一抗，放入湿盒中，4℃孵育过夜。
7.复染核：用DAPI染色液复染核，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测特定抗原在细胞或组织中的表达和定位。
以下是免疫荧光染色的基本步骤：
1. 取得标本：获取需要检测的组织或细胞样本，可以是固定的组织切片或涂片，或者是固定的细胞。
2. 抗原解发：如果样本中的抗原被掩盖或结合得过于紧密，需要进行抗原解发。
可以使用酶解方法或热解方法来解发抗原。
3. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合抑制剂，如动物血清、牛血清白蛋白或BSA，来阻止未特异性抗体结合到样本上。
4. 抗体染色：加入特异性一抗，即针对目标抗原的初级抗体。
留样本在4°C或室温下与一抗孵育一段时间，充分结合。
5. 洗涤：用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合的初
级抗体。
6. 加入荧光标记的二抗：使用经荧光标记的二抗，即反应在初级抗体上的特异性抗体。
留样本在4°C或室温下与二抗孵育
一段时间，充分结合。
7. 洗涤：再次用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合
的二抗。
8. 盖玻片和封片：将样本转移到载玻片上并加盖玻片，可以加入抗褪色剂来保护荧光信号。
9. 观察与记录：使用荧光显微镜观察标本，并记录所观察到的荧光信号的位置和强度。
以上是免疫荧光染色的基本步骤，具体步骤可能会因实验目的和设备的不同而有所变化。
免疫荧光染色操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!免疫荧光染色操作流程一、准备工作阶段。
在进行免疫荧光染色之前，需要进行充分的准备工作。
免疫染色实验方法和步骤免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。
1. 样品准备(Sample preparation)对于贴壁细胞：可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。
也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。
这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。
对于悬浮细胞：把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。
然后就可以进行后续操作。
如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。
对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。
对于石蜡切片：脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。
无水乙醇5分钟，两次。
90%乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。
蒸馏水5分钟，两次。
抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。
2. 固定可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。
固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。
3. 封闭(Blocking)加入免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
组织切片免疫荧光染色
组织切片免疫荧光染色是一种常用的方法，用于检测组织样本中特定抗原的表达情况。
它可以帮助研究者研究细胞、组织的结构和功能，以及疾病的发生和发展过程。
这种染色方法的基本步骤如下：
1. 取得组织样本：通常从动物（如小鼠、大鼠）或人体中取得组织样本。
样本可以是固定的组织块或细胞培养物。
2. 制备组织切片：将组织样本固定、包埋、切片，得到薄片。
常用的固定剂包括甲醛或乙醛等。
切片可以通过切片机或手工操作。
3. 抗原解露：将组织切片进行抗原解露处理，使得目标抗原能够与特异抗体结合。
解露方法包括热解露或酶消化等。
4. 抗原结合：将特异性抗体加入到切片上，与目标抗原结合。
这些抗体通常是通过动物免疫反应获得的。
5. 检测染色：使用荧光染料或酶联二抗法等方法标记抗体，以可视化与抗原结合的抗体。
荧光染料通常是荧光素和荧光素衍生物。
6. 显微镜观察：将染色的组织切片放置在荧光显微镜下观察和拍照。
荧光显微镜能够通过荧光染料的发射光进行可视化。
通过组织切片免疫荧光染色，研究者可以可视化特定抗原在组织中的位置和表达水平，从而了解细胞和组织的功能以及疾病的机制。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；• 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min•抗体染色：C孵育30min；︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37• 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
•缓冲甘油封片–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
•镜检：在荧光显微镜下观察。
•优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项μ•对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；•一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；C的低温，延长染色时间。
︒C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2︒C)，高于37︒–染色温度：多采用室温(25C 30 min效果好的多。
︒–低温染色过夜较37•试验时需设置下列对照：–自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；•经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
免疫组织化学技术：染色步骤免疫组织化学技术:染色步骤一、免疫荧光法１．直接法（1）冰冻切片、涂片、印片或单层细胞培养物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。
（2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃过夜（3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次（4）50%甘油缓冲液封片（5）荧光显微镜下检查（6）对照染色①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。
②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。
③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。
④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。
或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。
对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。
2．间接法（1）标本处理同直接法。
（2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟或４℃过夜。
（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟。
（５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。
（６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。
（７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。
３．补体法（１）标本处理同直接法。
（２）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，置湿盒中，３７℃３０分钟，ＰＢＳ洗３次。
（３）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体，置理盒中，３７℃３０分钟。
ＰＢＳ洗２次，蒸馏水洗１次。
（４）甘油缓冲液封片。
（５）对照染色，可作正常血清替代，灭活补体对照即经５６℃３０分钟灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，进行染色，结果均应阴性。
