酵母双杂交系统技术介绍.ppt

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The End
Thankyou
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株 具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。 〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特
征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳
动物的蛋白结合
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根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与
已知蛋白质Bait protein的基因构建在同 一个表达载体上，在酵母中表达两者的
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4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此 协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着 功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多 新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将因之间的联系，建立基因 组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传 导、代谢途径等有重要意义
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与反式转录激活因子结构的即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成其中有dnadnabindingdomainbd和activationdomainad这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能但不能激活转录只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时才能重新呈现完整的转录因子活性并可激活上游激活序列upstreamactivatingsequenceuas的下游启动子使启动子下游基因得到转酵母双杂交酵母双杂交系统的另一个重要的元件报道株指经改造的含报道基因reportergene的重组质粒的宿主细胞
•
据此，我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要
他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激

酵母双杂交系统1.原理酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。

研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是山两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。

例如，酵母的转录激活因子GAL4,在N端有一个山147 个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD), C端有一个山113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)o GAL4 分子的DNA 结合域可以和上游激活序列(UPStream activating sequence, UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。

但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。

2.试验流程酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋口在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋口质，其大致步骤为：2. 1、视已知蛋白的CDNA序列为诱饵(bait),将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。

2. 2、将待筛选蛋口的CDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。

2. 3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。

2. 4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋口若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。

利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。

3.特点优点蛋口-蛋口相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。

酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。

缺点尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。

1、它并非对所有蛋口质都适用，这是山其原理所决定的。

双杂交系统要求两种杂交体蛋口都是融合蛋口，都必须能进入细胞核内。

因为融合蛋口相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。

酵母双杂交系统技术介绍
Clontech
Matchmaker™
4/11/2021 • 6
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背景介绍: Matchmaker Gold 系统
酵母单杂交-蛋白与DNA的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast One-Hybrid Library Screening Syst选
▪ SMART合成cDNA ▪共转/A
▪1ml mating 酵母双杂交系统技术介绍
QDO/X/A
4/11/2021 • 20•筛选: Clontech MM筛选
630489 Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System
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Clontech MM系统的优点
异常 简便
SMART方法与同源重组技术结合构建 ，聪明的酵母自己做克隆。抗性 筛选
AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景 生长，大续与a型菌株Y2H Gold进行mating 直接筛选。
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4/1 Easy yeast Plasmid Isolation Kit
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 28
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验证互作: 体内验证
630305
Mammalian Matchmaker TwoHybrid Assay Kit 2
正常情况在酵母细胞内:
GAL UAS
Promoter
Transcription gal metabolic gene
在GAL4 based双杂交系统中:
GAL4 AD
Reporter Gene
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 12
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基本原理: 三个启动子，四个报告基因

蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外，酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
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的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性，能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ，它还具有高通量和高可重复性的特点，可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而，酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如，它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响，导致假阳性结果。此外，由于酵母细胞与人类细胞存在差异，因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中，了解蛋白质之间 行，例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性， 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时， 它可能会产生过多的蛋白质，导致自激活。
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该系统基于两种基本的酵母转录因子，即GAL4 和STE12，它们可以分别与DNA结合并激活转录。
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当一个转录因子与另一个转录因子结合时，它们 可以形成一个杂合二聚体，从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础，以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向