原位杂交在观赏植物中的研究进展

RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列 互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂 交中所使用的探针依其来源可分为三种： 1、特异性 特异性cDNA： cDNA中不存在内含子及其它高度重复序 特异性 列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复 性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性 2、cRNA探针 探针：以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因 探针 为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针 做杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。cRNA与RNA 之间形成的杂交体要比cDNA-RNA杂交体稳定。cRNA-RNA 之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。因此杂交反应后可 用RNA酶处理，以除去未结合的探针。 3、人工合成寡核苷酸探针 人工合成寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核 人工合成寡核苷酸探针 苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存 在的高度重复序列带来的不利影响。它与mRNA形成的杂 交体不如cRNA-RNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带 的标记物少，敏感性较低。
二、制片（12月3日）
切片： 切片 1. 先将蜡块切成小块，粘固在小木头桩上。 2. 安装切片刀，调好角度和切口部位。 3. 根据需要调整切片厚度，进行切片。 展片：将切好的石蜡材料平展在玻片上，一般借 展片 助水将石蜡切片展开。 粘片：通过加热使切好蜡带平展在载玻片上。用 粘片 滤纸吸去载玻片上多余水分，同时以记号笔在玻 片上编号以确定材料方位，放入42℃温箱中烘干， 约12小时。
材料固定
混合固定液： 混合固定液：
1、 FAA固定液：植物组织最常用的固定液。固定时间不 受限制，并且固定后材料可以正常染色。配方：50%或 70%酒精90毫升（软材料用50%酒精，硬材料用70%酒 精），冰醋酸5 ml，福尔马林5 ml。 2、卡尔诺氏（Carnoy's）固定液：多用于组织和细胞的固 定，渗透力极快，一般情况下，固定根尖和花药只需 40-60分钟。固定后用95%酒精冲洗，在组织不能立即 40-60 95% 处理时，需转入70％酒精中保存。配方1：15 ml乙醇和 5 ml冰醋酸混合；配方2：30 ml乙醇，5 ml氯仿和1 ml 冰醋酸混合。 3、纳瓦兴（Navaschjn‘s）固定液：植物制片技术中广泛 应用。配方：75 ml 1%铬酸，5 ml冰醋酸和20 ml福尔 马林混合。根据实验材料的种类，目前有很多的改良液， 效果更好。

荧光原位杂交技术及其在植物学中的应用现状荧光原位杂交是Langer在1982由原位杂交改善而来[1]，其基本原理为：根据核苷酸碱基互补配对原则，使荧光标记的探针序列与靶DNA序列进行杂交，然后用合适的检测方法将荧光信号检出，达到基因定位的目的。

因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。

自从1985年Raybm[2]首次将原位杂交技术应用于植物染色体研究后该技术便在植物学研究中得到了广泛的应用。

1 荧光原位杂交技术的发展与改进荧光原位杂交是在放射性同位素原位杂交的基础上改进而来的，Manning等[3]在1975年最早用非放射性的生物素通过细胞色素C与RNA分子链接，开创了非放射性标记，Rudkin等1977年在放射性同位素标记的基础上发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术，Langer等在1982年成功地实现了首例用生物素标记探针的原位杂交，自此荧光原位杂交技术真正建立并不断发展改进。

随着分子生物学技术的发展，FISH技术还衍生出了引物原位标记、间期核FISH、染色体原位抑制技术等，并且还发展出M- FISH、3D-FISH、Rx-FISH技术、CGH 以及近年来微阵列技术等这些更为完善的FISH技术。

1.1 FISH中探针的发展改进特异探针序列的正确选择是FISH技术中的一个关键，随着FISH技术发展，针对不同的研究对象和目的，探针的类型也有了许多改进，主要有以下几种：1）染色体特异重复序列探针：rDNA、端粒、着丝粒以及类似于α卫星、卫星Ⅲ等重复序列上重复元件可达106拷贝数，其杂交靶位点大于1Mb，杂交信号易于检测，常用于检测非整倍体；2）基因组探针：高等动物基因组DNA除过很小一部分的编码序列外有一些高频率的重复序列，进化上的保守性使其具有物种特异性，作为探针，可分析多倍体的起源、进化、基因组成等；3）单拷贝序列探针：针对靶片段中的单拷贝序列而选择的此类探针，通常是某个基因的DNA克隆、RFLP或RAPD标记或是用大的插入片段；4）染色体文库探针：此类探针由从基因组文库中的一条染色体或某一区域核酸片段组成，片段较小，因此被破坏的可能性小。

• 百合花发育相关基因的组织原位杂交研究_潘梅
《百合花发育相关基因的组织原位杂交 研究》---潘梅，2010
总结
• 以野菊不同发育时期的花器官为材料，通过制备 菊花花型对称相关基因（CYC、RAD、DIV）的地 高辛标记的RNA探针，与菊花花器官内靶基因转 录产物mRNA进行组织原位杂交定位，可显示花 型对称相关基因在组织细胞中的时空表达差异和 规律，以获取相关基因在调控菊花花发育过程的 重要信息，进一步揭示菊花花对称的分子机理。 • 同时，结合实时定量荧光PCR，定性、半定量地 检测相关基因的表达水平。
1、特异性cDNA： cDNA中不存在内含子及其它高度重复了杂交反应的敏 感性
2、cRNA探针：以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链 探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条链之间的 复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA-RNA杂交体稳定。 cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。因此杂交反应后可用RNA 酶处理，以除去未结合的探针。 3、人工合成寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过 DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。 它与mRNA形成的杂交体不如cRNA-RNA杂交体稳定，再则探针较短，所携 带的标记物少，敏感性较低。
二、分类
• 原位杂交主要分为染色体原位杂交和RNA原位杂交，染色体原位杂交应 用于观赏植物中较多的是FISH和GISH。
• FISH(Fluorescence in situ Hybridization) 因其所用探针被荧光物质标记 （间接或直接）而得名，基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与 已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过显微镜观察荧光信号可在不 改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。DNA荧 光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细 胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平的分析。 • GISH(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交是在分子水平上检测 外源染色质的一种有效方法,其探针是总基因组DNA.该技术广泛应用于 植物进化、亲缘关系、真实杂种鉴定上。

原位杂交技术在植物研究中的应用裴冬丽1,2,李锁平13(1河南大学生命科学学院,河南开封475001;2商丘师范学院生物系)摘要:简述了染色体原位杂交技术最新技术发展,阐明了如何利用原位杂交技术通过细胞检测、染色体检测、基因检测来进行植物研究,并探讨了该技术的应用前景。

关键词:原位杂交;应用中图分类号:S5035.1 文献标识码:A 文章编号:1004-3268(2004)02-0007-03Application of in Situ HybridizationTechnique on Plant ResearchPEI Dong 2li 1,2,L I Suo 2ping 13(1College of Life Science ,Henan University ,K aifeng 475001,China ;2Department of Biology ,Shangqiu Normal College )Abstract :A new developement of chromosome in situ hybridization and introduces how to do plant research through cell detection ,chromosome detection and gene detection by use of in situ hy 2bridization are presented and the applied prospects of the technology are also discussed.K ey w ords :In situ hybridization ;Application 自1969年G all 和Pardue 及John 等分别建立原位杂交技术(In Situ Hybridization )以来,在遗传学和分子生物学研究领域发挥了极大的作用。