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最权威最齐全的PCR汇总及其原理,程序

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pcr的基本原理及操作流程

pcr的基本原理及操作流程

pcr的基本原理及操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!PCR技术：基本原理与操作流程详解PCR，全称为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在体外快速复制DNA片段的生物技术。

PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理

PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理

PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理PCR简介聚合酶链式反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以在体外扩增目标DNA 序列。

它通过不断的循环反应，迅速大量复制目标DNA，从而能够快速获取足够的起始模板用于后续的实验。

PCR具有高效、敏感、特异性强等优点，在基因工程、医学诊断和犯罪鉴定等领域得到广泛应用。

PCR步骤和方法PCR主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。

这三个步骤通过循环反应，反复进行以达到目标DNA扩增的目的。

1.变性（Denaturation）：在高温条件下（通常为94-98°C），双链DNA被迅速分离成两条单链DNA。

这被认为是PCR反应的起始步骤，使得目标DNA的两个互补链分开，为后续的PCR步骤提供单链DNA模板。

2.退火（Annealing）：降温至50-65°C的退火温度，引入特异性引物（primers），使其与目标DNA序列上的两个互补区域发生配对。

引物是短寡核苷酸序列，用于定位目标序列的起始和终止位置。

3.延伸（Extension）：在60-75°C条件下，DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等）以引物为起点，沿模板链的互补链合成新的DNA链。

延伸速率通常为60-100 bp/分钟。

以上三个步骤完成后，产生的DNA分子会成为下一轮PCR反应的起始模板。

每个PCR循环通常需要几十秒到几分钟的时间。

PCR的方法可以进一步分为常规PCR、荧光定量PCR（qPCR）和逆转录PCR（RT-PCR）等。

PCR实验过程以下是PCR在实验室内的基本步骤：1.提取DNA：从待检测的样品（如血液、组织等）中提取目标DNA。

这一步需要遵循相应的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。

2.准备反应体系：将PCR反应所需的各种试剂按比例加入反应管中。

通常，反应体系包括目标DNA、引物、核苷酸、DNA聚合酶、缓冲液和Mg2+等。

3.PCR反应：将反应管置于PCR仪中，按照设定的PCR程序进行反应。

PCR详细讲解

PCR详细讲解

引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
引物设计的基本原则
2、避开易形成二级结构的模板序列区域。
基本原理
PCR扩增反应是酶促反应，遵循酶促动力学原 理，开始的循环内扩增产物呈指数积累，产物与
模板呈线性关系。半定量 RT-PCR 技术正是利用产
物与模板量的这一线性关系，通过扩增产物来对
比总RNA中目的基因的表达。
基本流程
注意的问题
RNA的提取
• 做RT前必需测RNA浓度，常用500ng或1ug。
逆转录引物：
（1）随机六聚核苷酸引物
仅长6个核苷酸，每个核苷酸位点上随 机加入4中不同的脱氧核苷酸，因此是46中 不同引物的集合体。 所有RNA分子均可以充当模板，合成的 cDNA中有96%来自rRNA。
逆转录引物：
（2）Oligo（dT） 仅由dTTP构成，长度一般为1824个核苷酸。 识别mRNA的3’端poly（A）尾， 因此仅mRNA可被逆转录。
• PCR（Polymerase Chain Reaction)技术即
聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术。 • 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发 明，荣获1993年度诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外 DNA 分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M

简述pcr原理及操作流程

简述pcr原理及操作流程

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聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术。

PCR的原理和操作过程

PCR的原理和操作过程

原则旳PCR反应体系
10X 扩增缓冲液： 5μl
模板DNA:
0.1~2μg
引物：
各0.2~1μmol/L
4种dNTP: 各200μmol/L
Mg2+:
1.5mmol/L
Taq DNA聚合酶： 2.5U
ddH2O 总体积：
补齐 50μl
能够按照百分比放大或者缩小体系，不同旳PCR反应需要优 化
2. 能从100万个细胞中检出一种靶细胞
3. 病毒检测旳敏捷度可达3个RFU 4. 细菌检测旳最小检出率为3个细菌
1. 简便、迅速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完毕扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
2. 对标本旳纯度要求低
1. 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织旳粗提DNA
第二节 PCR旳试验环节
按照试验方案进行即可
1.加样 将上述总体积为50чl旳反应体系加入一无菌
0.5ml离心管中
2离心 将加入旳反应物混合均匀后稍离心，加入一
滴矿物油覆盖于反应混合物上
3扩增 在PCR仪上设置PCR反应参数（详细数据根
据引物和扩增片段旳大小而定）：94℃下加热4分钟左右 ；依次94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟 ，循环32次左右；72℃下保温7分钟，使反应产物扩增充 分
PCR原理和基本操作过程
临床146生化试验小组
第一节 PCR技术原理
聚合酶链式反应（polymerase chain reation,PCR)是一种DNA体外核 酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量旳目旳基因或某DNA片段扩增 至十万乃至百万倍，从极微量旳标本中扩增出足量旳DNA供分析研究和检 测鉴定。PCR技术具有特异、敏感、产率高、迅速、简便、反复性好、易 自动化等突出优点。

PCR技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)

PCR技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)

聚合酶链式反应（PCR）原理DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。

PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的‚半保留复制链‛，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR技术分类（常用）（9）荧光定量实时PCR技术PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

pcr扩增的原理和步骤以及常见问题

pcr扩增的原理和步骤以及常见问题

P C R实验原理及步骤PCR，又称聚合酶链式反应，基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

实验方法原理①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR反应体系10×扩增缓冲液10 ul4种dNTP混合物各200 umol/L引物各10～100 pmol模板DNA 0.1～2 ugTaq DNA聚合酶 2.5 uMg2+ 1.5 mmol/L加双或三蒸水至 100 ul模板制备（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。

也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。

法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。

多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。

难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。

所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

PCR反应条件控制1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子。

2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。

pcr的原理和主要应用

pcr的原理和主要应用

PCR的原理和主要应用1. PCR的原理PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它可以在体外迅速扩增目标DNA序列。

PCR的原理基于DNA聚合酶在体外复制DNA的能力，通过循环反应，可以从一小段DNA模板扩增出大量目标DNA片段。

PCR的原理主要包括三个步骤：变性、引物结合和延伸。

1.1 变性PCR反应开始时，将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开，得到两条单链DNA。

1.2 引物结合将PCR反应体系降温至目标DNA片段的引物结合温度，引物能够特异性地与目标DNA的两端结合。

引物是由两个无定序核苷酸组成，一个与目标DNA的一条链上的末端互补，另一个与另一条链上的末端互补。

1.3 延伸加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），温度升高至DNA聚合酶的最适温度，DNA聚合酶沿着DNA模板逐渐合成新的DNA链。

此步骤的温度通常在72℃左右。

经过多次循环，可以扩增出大量目标DNA片段。

2. PCR的主要应用PCR技术在生物学研究和临床诊断中有广泛的应用。

以下是PCR的主要应用。

2.1 基因克隆PCR可以扩增出目标基因的DNA片段，并通过连接酶和质粒进行连接，从而实现基因的克隆。

基因克隆是研究基因功能和制备重组蛋白等重要实验手段。

2.2 基因检测PCR技术可以用来检测特定基因的存在与否。

通过设计特异性引物，可以选择性地扩增目标基因的DNA片段。

这种检测方法广泛应用于遗传病的检测、疾病相关基因的筛查等。

2.3 遗传多态性分析PCR技术可以用来分析基因座的遗传多态性。

通过选择特异性引物，可以扩增出基因座上的多种等位基因，通过分析扩增产物的长度或序列，可以确定个体在某个基因座上的基因型。

2.4 表达定量PCR技术可以用来分析基因在不同组织或条件下的表达量。

通过选择特异性引物，可以扩增出目标基因的DNA片段，通过比较扩增产物的数量，可以推断出基因在不同条件下的表达量。

2.5 病原体检测PCR技术在疾病的快速诊断中发挥了重要作用。

PCR扩增的原理和操作步骤

PCR扩增的原理和操作步骤

PCR扩增的原理和操作步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于生物学研究和基因工程领域的技术，它能在体外复制目标DNA段，并在短时间内扩增出大量的目标DNA。

本文将详细介绍PCR扩增的原理和操作步骤。

一、PCR扩增的原理PCR扩增是通过DNA聚合酶的酶活性，在体外模拟DNA的复制过程，快速合成大量特定序列的方法。

其原理包括三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。

1.1 变性PCR反应开始时，将待扩增模板DNA加热至95℃，使其发生变性，将DNA双链解开成两条单链。

该步骤使DNA变得单链化，为后续的引物结合和DNA合成提供条件。

1.2 引物结合通过降低反应温度至40-60℃，使引物与DNA单链结合。

引物是两个互补的寡核苷酸序列，在扩增过程中所选择的引物，将确定扩增的目标DNA段。

引物与目标DNA序列互补结合，形成引物／DNA复合物。

1.3 延伸升高反应温度至72℃，加入热稳定的DNA聚合酶，启动延伸步骤。

DNA聚合酶以引物为起始点，向延伸方向沿着模板DNA链合成互补的新DNA链。

此步骤的重复进行，将目标DNA段扩增为大量的复制产物。

二、PCR扩增的操作步骤2.1 材料准备准备PCR反应体系所需的试剂和设备，包括DNA样品、引物、酶、缓冲液、dNTPs、镁离子、试管、PCR仪等。

2.2 PCR反应体系的配置根据需要扩增的目标DNA片段的大小和特点，选择适当的引物浓度和配比。

一般情况下，将试管中的反应体系按以下顺序依次配制：缓冲液、dNTPs、MgCl2、引物、DNA模板、聚合酶、去离子水。

2.3 反应条件设置设置PCR反应条件，包括退火温度、延伸时间等。

这些参数的设定与目标DNA的GC含量、长度等相关。

2.4 PCR反应的进行将装有反应体系的试管放入PCR仪中，根据所设定的程序进行PCR扩增反应。

一般情况下，PCR反应包括预变性（变性阶段）、循环扩增（引物结合和延伸阶段）和最终延伸。

2.5 PCR产物分析将PCR反应体系取出，利用琼脂糖凝胶电泳等方法进行PCR产物的分析。

PCR PPT课件

PCR PPT课件

Mg2+
缓冲液
.
• 模板：即为要被复制的核酸片段 • 条件：需要较高的纯度
.
• 引物：化学合成的寡核苷酸 • 条件： • 1.一般长度为20个核苷酸 • 2.两条引物的序列不能互补 • 3.两条引物之间的Tm值不能相差太多
.
• dNTP:4种核苷酸 • 条件：4种核苷酸的浓度需要一致，否则容易出现DNA聚合酶错 配的概率
.
• Taq DNA聚合酶：是从水栖嗜热菌中提取的一种酶，能催化 DNA合成。具有5’端→3’端的外切酶活性。
.
• Mg2+：是Taq DNA聚合酶的辅助因子，可以稳定其活性
.
• 缓冲液：在扩增过程中使PH值维持在7.2左右，使DNA聚合酶发 挥最大的活性.ຫໍສະໝຸດ PCR技术基本过程.
变性
在熔点温度的条件下（94℃左右），使双链DNA结构的氢键断裂， 形成两条单链分子作为扩增反应的模板，以便与引物结合。
.
•
72℃ 4种dNTP在引物和DNA聚合酶的 的作用下延伸
.
定量PCR技术
• 指在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号累积实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的 方法。
.
• Taqman荧光探针： • 5’端荧光基团 FAM 3’端淬灭基团
.
PCR 扩增时， Taq 酶的 5’- 3’
阈值线
.
17
② Ct值(cycle threshold)的概念 指PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过 的扩增循环次数。它与起始拷贝数的对数成线性关系（即与起 始拷贝数反比关系）
阈值线
C(t) 值
C(t) 值

PCR原理及其操作PPT课件

PCR原理及其操作PPT课件

⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基， 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的 酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；
⑧引物量：每条引物的浓度0.1 ~ 0.5μM，以最低引物量产生所需要的 结果为好
• 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓 度为200µmol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L为宜;
• Mg2+浓度过高，反应特异性降低，
出现非特异扩增， 浓度过低会降低
Taq DNA聚合酶的活性，使反应产
物减少。 精选PPT课件
32
PCR 的反应流程
1. 温度与时间的设置 2. 循环次数
• 复性时间一般为30～60s，足以使引 物与模板之间完全结合
精选PPT课件
37
③ 延伸温度与时间：
• 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 – 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
• 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 – 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则 合成产物量减少。
精选PPT课件
29
3.dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系：
– dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活
– dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后， 以1M NaOH 或 1M Tris-HCl 的 缓 冲 液 将 其 pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保 存。多次冻融会使dNTP降解

PCR技术原理、实验步骤和应用

PCR技术原理、实验步骤和应用

PCR技术原理、实验步骤和应用一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。

2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetu s公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。

细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。

参与复制的有多种因素。

PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶0.5μL2、设置PCR反应程序。

pcr原理及其反应过程

pcr原理及其反应过程

pcr原理及其反应过程多聚酶链反应（PCR）是一种能够在试管内高效扩增 DNA 片段的技术。

它是由 Kary Mullis 在 1983 年发明的，目前已成为分子生物学和遗传学领域中最为重要的实验手段之一。

PCR 的反应过程分为三个主要步骤，包括变性、退火和延伸。

首先，在变性步骤中，在高温条件下，模板 DNA 被分离成两条互补的单链 DNA。

这是通过加热模板 DNA，使其双链结构解开，产生单链 DNA 分子的过程完成的。

接下来，在退火步骤中，适合的引物与单链 DNA 片段结合形成双链结构。

引物是相当短的 DNA 片段，在体系中与特定的模板 DNA 片段互补结合。

引物形成的双链结构的两端与 DNA 序列一致，从而在其周围形成一个适合的建模环境，使之后的延伸反应得以顺利进行。

在延伸步骤中，使用热稳定的 DNA 聚合酶来合成新的 DNA 序列。

这个酶能够识别每个引物，然后沿着 DNA 片段依序合成 DNA 单链。

这是通过将试管降温至适合酶的反应温度，使酶沿着模板 DNA 合成相应 DNA 片段的过程完成的。

PCR 技术具有许多优点，包括灵敏度高、特异性强、快速、简便和高效。

它的应用广泛，可以用于确定基因型、检测遗传病、DNA 克隆和基因表达分析等方面。

需要注意的是，PCR 可能存在一些潜在问题，其中最重要的包括污染和扩增富集问题。

为了克服这些问题，需要提前进行实验设计、引物设计、模板净化和试剂验证等前期工作，以确保 PCR 反应的质量和稳定性。

总之，PCR 技术是现代分子生物学和遗传学研究中最有用的实验方法之一。

熟练掌握 PCR 的原理及其反应过程，对于科学家们的实验工作和研究成果都有重要的指导意义。

PCR的原理和操作过程

PCR的原理和操作过程

PCR的原理和操作过程PCR是一种在分子生物学中广泛使用的技术，它能够在短时间内从少量DNA样本中扩增大量DNA。

PCR的全称是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），它是由美国科学家基利斯与生物技术先驱的名字关联而来。

PCR基本原理：PCR的基本原理是通过反复进行三个步骤的循环反应，这三个步骤是：变性、退火和延伸。

通过这个循环过程，每一轮的PCR会在每个目标DNA分子的两端复制一个新的DNA分子，这样反复迭代多次，就可以在短时间内从一个DNA分子扩增出大量DNA。

PCR的操作过程：PCR技术主要涉及到以下步骤：DNA提取、PCR反应体系的制备、PCR循环反应、分析PCR产物。

1.DNA提取：PCR的第一步是从所需的生物样品中提取DNA。

这涉及到细胞破碎和DNA分离的过程，常用方法有酚/氯仿法和商业DNA提取试剂盒。

DNA提取的目的是获取纯度高、浓度适中的DNA样本。

2.PCR反应体系的制备：制备PCR反应需要购买PCR试剂盒，并根据试剂盒的指南来配制反应液。

PCR反应液包括模板DNA、聚合酶、引物、核苷酸、Mg2+ 离子和缓冲液。

聚合酶一般使用DNA聚合酶，如Taq聚合酶。

引物是用于选择DNA特定区域的两个短DNA片段，引物设计的合理性直接影响PCR扩增的结果。

3.PCR循环反应：PCR循环反应是PCR的核心步骤。

它主要包括三个不同的温度区域：变性区域、退火区域和延伸区域。

PCR每个循环包括以下步骤：- 变性（Denaturation）：将PCR反应体系加热至95-98摄氏度，使双链DNA解链为两个单链DNA。

- 退火（Annealing）：将PCR反应体系降温至40-65摄氏度，使引物与模板DNA的互补序列结合。

- 延伸（Extension）：将PCR反应体系升温至72摄氏度，使DNA聚合酶从引物的3'端延伸合成新的DNA链。

这个步骤称为延伸或扩增。

以上三个步骤组成了PCR的一个循环，一个完整的PCR反应通常包含25-35个循环。

PCR技术原理及其应用

PCR技术原理及其应用

PCR技术原理及其应用PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种体外复制DNA的技术，其原理基于DNA的双链特性以及DNA复制酶的催化作用。

PCR技术的应用十分广泛，包括基因检测、遗传性疾病的诊断、病原体的检测等。

下面详细介绍PCR技术的原理及其应用。

首先是变性步骤。

在PCR反应开始时，将待扩增的DNA模板加热至95℃，使其双链解开，生成两条单链DNA。

这一步骤被称为变性，它使DNA的两条链分离，以便于后续步骤的进行。

接下来是退火步骤。

将反应温度降至50-65℃，以使引物与目标DNA序列互补结合。

引物是一段长度为20-30个碱基的DNA片段，可以通过合成的方式获得。

引物的设计非常重要，因为它们决定了PCR产物的特异性。

在这一步骤中，引物与模板DNA的特定区域结合。

最后是扩增步骤。

反应温度升至72℃时，热稳定的DNA聚合酶开始作用，并在模板DNA的两个引物位置之间生成新的DNA链。

DNA聚合酶通过在一个引物上添加新的碱基，然后将其延伸到另一个引物上，以此反复扩增DNA片段。

每一轮扩增会使目标DNA序列的数量翻倍，因此PCR可以在数轮后扩增出大量目标DNA。

1.基因检测和测序。

PCR可以用于检测基因的突变和多态性，从而判断人体患病风险、确定遗传性疾病的类型等。

此外，PCR还可以用于测序，即确定DNA序列。

2.病原体的检测。

PCR可以用于检测人体内的病原体，如细菌、病毒和真菌等。

通过PCR可以快速、敏感地检测出感染的病原体，从而指导治疗和预防控制措施。

3.古DNA的研究。

因为PCR可以扩增数量极少的DNA，所以它被广泛应用于古DNA的研究。

通过PCR可以从古代化石、古代遗物等中提取DNA并进行分析，从而揭示古代生物的基因信息。

4.断层分析和定量分析。

PCR可以用于定量测量其中一基因的拷贝数，这对于研究基因的表达调控、证据等领域非常重要。

此外，PCR还可以用于检验DNA在断层分析中的存在与否，从而帮助办案人员收集证据。

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RTPCRTPCR - RT-PCR简介反转录·聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-P CR）是将RNA的反转录（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA 产物。

无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。

只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Olig o（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行。

在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。

cDNA的合成首先在反转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。

在一步法RT-PCR中，在同时为反转录和PCR优化的条件下，反转录和PCR在一直观众顺次进行。

1、反转录酶的选择两种方法1、Money 鼠白血病病毒反转录酶有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37°。

2、AMV反转录酶有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适温度为42°。

2、合成cDNA引物的选择用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。

对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

一步法RT-PCR引物的选择：1. 随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA。

适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA 的反转录反应。

主要用于单一模板的RT-PCR反应。

两步法2. Oligo dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA。

（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。

）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

3. 基因特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。

RTPCR - 影响因素RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。

1、建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。

2、对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。

较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。

3、大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。

但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。

反向PCR反向PCR反向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。

PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。

反转录PCR反转录PCR又称为逆转录PCR，，是指扩增mRNA的一种实验技术。

先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。

RT-PCR反应原理反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。

其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

反转录PCR - 一、反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在M n2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Po ly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。

用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

1. 总RNA的提取。

2. cDNA第一链的合成（Reverse Transcription）：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。

现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达1 1μl。

在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。

（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。

然后加入下列试剂的混合物：10×PCR buffer 2μl25mM MgCl2 2μl10mM dNTPmix 1μl0.1M DTT 2μl轻轻混匀，离心。

42℃孵育2-5min。

（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。

（4）于70℃加热15min以终止反应。

（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。

-20℃保存备用。

3．PCR：（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2μl上游引物（10pM） 2μl下游引物（10pM） 2μldNTP(2mM) 4μl10×PCR buffer 5μlTaq 酶（2u/μl） 1μl（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。

轻轻混匀，离心。

（3）设定PCR程序。

在适当的温度参数下扩增28-32个循环。

为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。

（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。

2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。

常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。

其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PC R反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。

故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

5．防止DNA的污染：（1）采用DNA酶处理RNA样品。

（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

巢式PCR巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。

第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。

第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。

因此，巢式PCR的扩增非常特异。

巢式PCR - 定义巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。

第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。

第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。

因此，巢式PCR的扩增非常特异。

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DN A聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。