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・４５４・ 中国生物制品学杂志２００６年９月第ｌ９卷第５期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００６，Ｖｏ１．１９ Ｎｏ．５
产气荚膜梭茵，ｘ－Ｉ￣－ 融合基因的构建及表达
韩学波 ’ 许崇波 曾瑾 王玉炯 【基础研究】
【摘要】 目的构建产气荚膜梭菌 ．１３２－１３。融合蛋白基因表达载体，并对表达产物进行鉴定。方法利用ＰＣＲ技术，
从含 毒素基因的质粒ｐＸＣＰＡ０２中扩增出 毒素基因，经Ｎｃｏ Ｉ酶切，回收０．９５ ｋｂ的 基因片段，再与经Ｎｃｏ Ｉ酶切并含融 合基因１３．．１３ 的质粒ｐＸＥＴＢ１Ｂ２连接，获得重组质粒ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１，经Ｎｃｏ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ和Ｅｃ０Ｒ Ｉ酶切鉴定，并对其表达产物进 行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 重组质粒ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１含有理．１３２－１３．融合基因。表达产物相对分子质量约为 ９５ ０００，并可被特异性抗体识别。结论 已获得高效表达 一３２－１３。的重组菌株。
【关键词】产气荚膜梭菌；毒素；融合基因
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ － Ｆｕｓｉｏｎ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ
ＨＡＮ Ｘｕｅ—ｂｏ ，ＸＵ Ｃｈｏｎｇ—ｂｏ，ＺＥＮＧ Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ（ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｗｅ￣ｉｔｙ，Ｈｎｃｈｕａｎ ７５００２１，Ｃｈｉｎａ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ・１３２—１３ｌ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｍｐｌｉｆｙ —ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＸＣＰＡ０２ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｏｔｒｌｎｇｅｒｕ ・ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｂｙ ＰＣＲ，ｄｉ・
ｇｅｓｔ ｗｉｔｈ Ｎｃｏ Ｉ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒ ａ ０．９５ ｋｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｄｉｇｅｓｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＸＥＴＢ１ Ｂ２ ｗｉｔｈ Ｎｃｏ Ｉ，ａｎｄ ｌｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ １３ｌ・１３２ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｔｏ ・ ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ．Ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｂｙ ＳＤＳ・ＰＡＧＥ ａｎｄ
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ 一３２－ｐｌ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ・ｐ２－１３ｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｗｉｔｈ ａ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｌ【ｓｈｔ ｏｆ ９５ ０００，ｗａｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｈｉｉｇｈ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｑ一１３２・１３ｌ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃ￣ｓｔｄｄｉｕｍ ｐｅｏＳ＂ｉｎｇｅｎ＊ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅＣｒｉｎｇｅｎｅｓ；Ｔｏｘｉｎ；Ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ
Ｃ型产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅ（ｆｉｉｎｇｅｎｓ）是引
起动物出血性、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原
菌。特别在新生幼畜和幼禽（尤其新生仔猪）中易
出现高致病性和高死亡率。长期以来，一直认为Ｃ
型产气荚膜梭菌只产生Ｏｔ和Ｂ毒素（现称Ｂ 毒
素），而且是主要的毒力因子。直至最近，Ｇｉｂｅａ
等…才确认该菌还产生另外一种更重要的毒力因
子，即Ｂ 毒素。他们证实Ｂ 毒素与Ｂ 毒素具有相
似的生物学活性，但既无明显基因序列和氨基酸序
列的同源性，也无免疫相关性，且分离峰也不同。这
３种毒素毒性都很强，但都具有良好的免疫原性。
本研究在克隆和表达 与１３２－１３ 毒素基因的基
础上 ．３ Ｊ，进一步将 毒素基因连接到Ｂ 一Ｂ 毒素基
因的上游，构建了 —Ｂ 一Ｂ 基因，表达融合蛋白，并
进行鉴定，为下一步研制仔猪红痢基因工程疫苗奠
定了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０３８００６０）． 作者单位：ｌ宁夏大学生命科学学院（银川７５００２１）；２宁夏医学 院药检系（银川７５００２１）；３大连大学生物工程学院 （大连ｌ１６６２２）． 通讯作者：许崇波，Ｅ・ｍａｉｌ：ｘｅｂ９２１＠ｓｏｈｕ．ｅｏｍ 材料与方法
１．菌株及质粒
工程菌ＢＩ２１（ＤＥ３）由本室保存；含 毒素基因
质粒ｐＸＣＰＡ０２和含１３５－１３ 毒素基因质粒ｐＸＥＴＢ１ Ｂ２
由本室构建。
２．试剂
Ｎｃｏ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ内切酶、ＲＮａｓｅ Ａ、
Ｔ４ＤＮＡ连接酶和Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＩＰＴＧ和低熔点琼脂糖购
自华美公司；溶菌酶购自北京同正生物科技公司；卡
那霉素购自上海生工生物工程公司；Ｃ型产气荚膜
梭菌抗血清购自兰州兽医研究所；ＨＲＰ标记兔抗羊
ＩｇＧ购自北京中山生物技术有限公司；ＤＡＢ为Ｓｉｇｍａ
公司产品。
３．仅毒素基因的扩增
质粒ｐＸＣＰＡ０２经ＥｃｏＲ Ｉ和Ｎｃｏ Ｉ酶切后，回收
１．２ ｋｂ的 毒素基因片段，以此为模板用于ＰＣＲ扩
增。根据ＴｉｔｂａＵ等 报道的 毒素基因序列，设计
合成了一对ＰＣＲ引物，分别为引物１：５ 一ＣＡＴＧＣＣ
ＡＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＡＴＡＡＴＡＡ１］ Ｃ一３ ，引物２：
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５ 一ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＩ’Ｉ’Ｉ’Ａ Ｉ．Ａ Ｉ’ＩｌＡＴＡＡＧＴｒＧＡＡＴｒ一３ 。
ＰＣＲ扩增按常规方法进行，反应体积为５Ｏ ｌ，其中，
模板ＤＮＡ １ ，引物各０．１ ｍｏＶＬ，１０×ＰＣＲ反应缓
冲液５ ，ｄＮＴＰ ４ ｐ．１，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶１ ，按照
９５℃变性５ ｍｉｎ，９４℃６０ ｓ— ７℃６Ｏ ｓ—÷７２℃１２０ Ｓ
的温度转换模式，共进行３Ｏ个循环。
４．Ｏｒ－ＩＩ２－ 融合基因的构建
将经ＰＣＲ扩增的 毒素基因再经Ｎｃｏ Ｉ单酶
切后，回收０．９５ ｋｂ的 基因片段，与经Ｎｃｏ Ｉ单酶
切并５ 端去磷酸化处理的含１３ 一１３。融合基因的质粒
ｐＸＥＴＢ１Ｂ２，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）中，涂种于含卡那霉素的ＬＢ琼脂平板
上过夜培养，挑取单菌落并提取质粒ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１，
酶切鉴定。
５．ＤＮＡ的重组和转化
质粒提取、酶切、电泳、连接、转化等均按文献
［５］的方法进行。
６．核苷酸序列分析
采用ＡＢＩ ３７７全自动ＤＮＡ序列分析仪进行。
７．质粒的稳定性试验
参照Ｍｅａｃｏｃｋ等 的方法进行。
８．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
按文献［５］的方法进行。
９．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析
将ＳＤＳ—ＰＡＧＥ后的凝胶于半干转印仪中，转印
１．５～２ ｈ。转印后的ＮＣ膜于３７℃封闭３ ｈ，用ＰＢＳ
缓冲液洗涤３次，每次１０ ｍｉｎ，放人用ＰＢＳ缓冲液稀
释的Ｃ型产气荚膜梭菌抗血清溶液中，４℃过夜后
取出，用ＰＢＳ缓冲液洗涤３次，每次１０ ｍｉｎ，放人用
ＰＢＳ缓冲液稀释的ＨＲＰ标记兔抗羊ＩｇＧ溶液中，
３７℃作用１ ｈ，再次充分洗涤后，加入新鲜配置的
ＤＡＢ底物液，室温避光显色，最后用双蒸水冲洗终
１Ｅ反应。
结 果
１．Ｏｒ－Ｂ２・ 融合基因的构建
用ＢａｍＨ Ｉ单酶切重组质粒ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１，经
１％琼脂糖凝胶电泳，结果出现２条带，其中１条小
的电泳带位于ＤＩ２０００ ｍａ￣ｅｒ２０００ ｂｐ稍下方，表明
经Ｎｃｏ Ｉ单酶切的目的基因片段与载体为正向连
接。再进一步用ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ双酶切该质粒，经
１％琼脂糖凝胶电泳，结果出现３条带，其中１条电
泳带与经ＢａｍＨ Ｉ单酶切后的小片段电泳带位置相
同，另１条最小的电泳带位于ＤＩ２０００ ｍａｒｋｅｒ １ ０００ ｂｐ 稍下，最大的一条电泳带则显示比经ＢａｍＨ Ｉ单酶
切后的大片段略小。用ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ／Ｎｃｏ Ｉ三
酶切该质粒，结果出现３条带，最小的约为７５０ ｂｐ，
表明这条电泳带应为Ｂ 基因片段；大小约１ ０００ ｂｐ
的则应为 毒素基因与Ｂ。毒素基因片段相混合所
产生（两者均９５０ ｂｐ），见图１。以上酶切结果表明，
已成功地构建了含有 ．１３２＂１３。融合基因的重组质粒
ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１。
１：ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｔｌｌ ＢａｍＨ Ｉ：２：ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１
ｄｉｇｅｓｔ￣ ｔｌｌ ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ：３：ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１ ｄｉｇｅｓｔ￣
ｔｌｌ ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ／Ｎｃｏ Ｉ：４：ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１ ｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｔｌｌ ＥｃｏＲ Ｉ：５：ＤＬ２ｏｏｏ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ． 图１重组质粒ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１酶切电泳结果
Ｆｉｇ １．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｍａｐ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＸ－
ＥＴＡＢ２Ｂｌ
２． Ｂ２・ 融合基因的核苷酸序列测定
利用ＡＢＩ３７７核苷酸序列分析仪，测定了０【一Ｂ 一
ｐ。融合基因的核苷酸序列，结果表明其基因序列和
阅读框架正确。
３．重组质粒的稳定性
重组质粒ｐＸＥＴＡＢ２Ｂ１在受体菌ＢＩ２１（ＤＥ３）中
传２Ｏ代后，质粒丢失率为０，表明具有良好的稳定性。
４．表达产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
将用于表达１７启动子的ＢＩ２１（ＤＥ３）菌株作为
０【一ｐ 一ｐ。融合基因的表达工程菌，经转化，挑取单个
菌落培养，菌体经煮沸处理后，用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析，
结果在相对分子质量约９５ ０００处出现融合蛋白，见
图２。表明０【一１３ 一１３。融合基因可在工程菌中表达。
５．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析
表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明，在相对分子
质量约９５ ０００处出现Ｃ型产气荚膜梭菌抗血清的
识别条带，见图３。表明表达产物可以被特异性抗
体识别。
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