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·220·银杏叶YinxingyeFOLIUM GINKGO本品为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L．的干燥叶。
秋季叶尚绿时采收，及时干燥。
【性状】本品多皱折或破碎，完整者呈扇形，长3～12cm，宽5～15cm。
黄绿色或浅棕黄色，上缘呈不规则的波状弯曲，有的中间凹入，深者可达叶长的4／5。
具二叉状平行叶脉，细而密，光滑无毛，易纵向撕裂。
叶基楔形，叶柄长2～8cm。
体轻。
气微，味微苦。
【鉴别】(1)取本品粉末1g，加甲醇10ml，加热回流10分钟，放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。
另取银杏叶对照药材lg，同法制成对照药材溶液。
照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各6µl，分别点于同一含4％醋酸钠的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5：3：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。
(2)取本品粉末1g，加50％丙酮溶液40ml，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加15％乙醇5ml使溶解，置于已处理好的聚酰胺柱(30～60目，1g，内径lcm，用水湿法装柱)上，用5％乙醇40ml洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸去乙醇，残液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。
另取银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品及白果内酯对照品，加丙酮制成每1ml各含0.5mg、0.5mg、0.5mg、lmg的混合溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各5µ1，分别点于同一含4％醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(10：5：5：0.6)为展开剂，在15℃以下展开，取出，晾干，在醋酐蒸气中熏15分钟，在140～160℃中加热30分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。
通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonellaparatyphi B)〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24 小时。
银杏叶口服液微生物限度检查试验及方法学验证资料
朱晓燕
【期刊名称】《中国新技术新产品》
【年(卷),期】2011(000)007
【摘要】对银杏叶口服液进行微生物限度检查试验及其方法学验证,确认采用的方法适合于该药品的微生物限度检查.
【总页数】1页(P7)
【作者】朱晓燕
【作者单位】哈药集团三精制药股份有限公司,黑龙江,哈尔滨,150000
【正文语种】中文
【中图分类】F763
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2015年08月10日发布中国食品药品检定研究院研究制定的《银杏叶软胶囊中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法》《银杏叶滴丸中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法》《舒血宁注射液、银杏叶提取物注射液中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法》《银杏达莫注射液中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法》《银杏叶滴剂中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法》《银杏叶提取物、银杏叶片及银杏叶胶囊中槐角苷检查项补充检验方法》已经国家食品药品监督管理总局批准，现予正式发布。
特此公告。
附件：1.银杏叶软胶囊中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法2.银杏叶滴丸中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法3.舒血宁注射液、银杏叶提取物注射液中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法4.银杏达莫注射液中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法5.银杏叶滴剂中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法6.银杏叶提取物、银杏叶片及银杏叶胶囊中槐角苷检查项补充检验方法食品药品监管总局2015年8月10日2015年第142号公告附件1.docx2015年第142号公告附件2.docx2015年第142号公告附件3.docx2015年第142号公告附件4.docx2015年第142号公告附件5.docx2015年第142号公告附件6.docx附件1银杏叶软胶囊中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素检查项补充检验方法【检查】游离槲皮素、山柰素、异鼠李素照高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》2010年版一部附录VI D）测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇－0.4%磷酸溶液（45:55）为流动相；检测波长为360nm。
理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备分别取槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含20μg、20μg、8μg的混合溶液，即得。
微生物限度检查方法适用性试验方案模板2015版药典验证文件类别：编号：部门：XXXX微生物限度检查方法适用性试验方案XXXXX公司2016年XXXX微生物限度检查方法适用性试验方案审批目录1、适用范围2、目的3、概述4、适用性所需要的仪器设备及文件5、可接受的限度范围标准6、测试方法7、异常情况处理8、测试结果9、结论10、再适用性周期11、附表1、适用范围本适用性方案适用于XXXX微生物限度检查的方法适用性试验。
2、目的因《中华人民共和国药典》（2015年版）颁布实施，为确保该产品的微生物限度检查方法的可靠性和可操作性，故对其检验方法进行适用性试验，以符合《中华人民共和国药典》规定。
3、概述3.1根据《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法，对XXXX进行需氧菌、霉菌和酵母菌、大肠埃希菌检查方法的适用性试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。
3.2适用性试验时间及批号：年月日开始分别对、、三批XXXX进行独立的方法适用性试验。
3.3验证小组4、仪器设备及文件4.1需用仪器设备5、可接受的限度范围标准5.1XXXX微生物限度检查质量标准5.2需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法采用《中华人民共和国药典》2015版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法中叙述的平皿法中的倾注法。
控制菌检查方法采用1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法中大肠埃希菌检查方法6、测试方法6.1供试品 XXXX 批号：6.2培养基及菌种6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，并经过培养基适用性检查。
胰酪大豆胨琼脂培养基批号：胰酪大豆胨液体培养基批号：沙氏葡萄糖琼脂培养基批号：沙氏葡萄糖液体培养基批号：麦康凯琼脂培养基批号：麦康凯液体培养基批号：MUG培养基批号：6.2.2菌种均购于：6.3菌液制备6.3.1需氧菌、霉菌和酵母菌的检查菌液制备6.3.1.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌适量至胰酪大豆胨液体培养基中， 30～35℃培养18～24小时，取上述培养物一定量用PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成制成适宜浓度的菌悬液，备用。
附录×××非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。
微生物计数试验应在受控洁净环境环境洁净度10 000 级下的局部洁净度不低于B100 级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。
MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。
供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，同时所选的方法的供试品用量必须具备检测充足样品量的能力，能够以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
表 1 试验菌液的制备和使用试验菌株试验菌液的制备计数培养基适用性检查计数方法适用性试验需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26 003)〕胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤，培养温度30 ～35℃，培养时间18～24小时胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤，培养温度30 ～35℃，培养时间不超过3 天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂/ 胰酪大豆胨肉汤（MPN 法），培养温度30～35℃，培养时间不超过 3 天，接种量不大于100cfu铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10 104〕胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤，培养温度30 ～35℃，培养时间18～24小时胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉35℃，培养时间不超过3 天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂/ 胰酪大豆胨肉汤（MPN 法），培养温度30～35℃，培养时间不超过 3 天，接种量不大于100cfu枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)〔CMCC(B) 63 501〕胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤，培养温度30 ～胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤，培养温度30 ～胰酪大豆胨琼脂/ 胰酪大豆胨肉汤（MPN 法），培养温度注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基灵敏度检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。
文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录1 样品相关信息1.1 基本信息2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备2.2 试验用培养基2.3 试验用试剂2.4 试验用菌种3 试验环境3.1 无菌室3.2 洁净工作台3.3 生物安全柜4 试验方案4.1 验证试验目的4.2 微生物限度检查方法草案5 方法验证试验5.1 菌液制备5.2 计数培养基适用性检查5.3 控制菌检查用培养基使用性检查5.4 供试液制备5.5 方法验证5.5.1 菌落计数方法验证试验5.5.2 控制菌检查方法的验证5.6 方法验证结论6 供试品微生物限度检查结果1 样品相关信息1.1 基本信息（三批）2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备2.2 试验用培养基2.2.1 对照培养基2.2.2 试验用培养基2.3 试验用试剂2.4 试验用菌种3 试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。
本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。
3.1 无菌室无菌室按《医药工业洁净厂房设计规》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。
3.2 超净工作台超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
超净工作台沉降菌检测记录2015.11.153.3生物安全柜生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
生物安全柜沉降菌监测记录2015.11.154 试验方案按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
银杏叶口服液微生物限度检查试验及方法学验证资料作者：朱晓燕来源：《中国新技术新产品》2011年第07期摘要：对银杏叶口服液进行微生物限度检查试验及其方法学验证，确认采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。
关键词：银杏叶口服液；微生物限度检查法；方法学验证。
中图分类号：F763 文献标识码：A微生物限度检查法取银杏叶口服液3支（规格：10ml）,共取10ml供试品，至90mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，制成1：10、1：100、1：1000供试液备用。
细菌数取1：10供试液50ml用薄膜过滤法过滤。
用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每次冲洗100ml,共冲洗三次.冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基平板上培养.若滤膜上无菌落生长,以霉菌数取各稀释级供试液1ml，采用平皿法，依法《中国药典》2005年版一部附录检查，应符合规定。
控制菌取1：10供试液10ml（相当于供试品1ml）接种至100 ml相应培养基中，培养18-24小时。
依《中国药典》2005年版一部附录检验，结果应符合规定。
微生物限度检查方法学验证依据《中国药典》2005年版，对银杏叶口服液的微生物限度检查法进行了方法学验证，验证结果如下：1样品：银杏叶口服液批号：10042114、10042124、10042134生产单位：哈药集团三精制药股份有限公司2 验证用菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B)26003]大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]3 验证用培养基：营养琼脂培养基批号：090225玫瑰红钠琼脂培养基批号：080905胆盐乳糖培养基批号：090104营养肉汤培养基批号：090121改良马丁培养基批号：090220曙红亚甲蓝培养基批号：090322以上培养基均由中检所提供。
食品药品监管总局国家卫生计生委关于加强含可待因复方口服液体制剂管理的通知食药监药化监〔2015〕46号2015年04月29日发布权威发布】CFDA吴浈副局长在银杏叶药品专项治理的表态2015-05-22 蒲公英杂志同志们：近期总局根据药品销售价格异常的线索，组织对部分银杏叶药品生产企业开展了一次飞行检查。
这次检查发现的问题十分严重，昨日总局已经就此专门发布了通告，召开了新闻通气会，并下发了明传电报部署开展银杏叶药品专项治理。
我想大家已经看到了《通告》和《通知》，对其中的精神和要求进行了认真学习和领会。
总局对做好此项工作高度重视，决定再召开一个视频会议，向大家讲清开展专项治理的意义，部署如何开展好专项治理工作，同时提出相关工作要求。
下面我讲三点意见。
一、高度重视银杏叶药品专项治理这次飞行检查，已经查实桂林兴达药业有限公司存在擅自将银杏叶提取工艺由稀乙醇改为3%盐酸提取，从不具备资质企业购进以盐酸工艺生产的银杏叶提取物用于生产银杏叶药品制剂，将外购的提取物以本企业产品名义销售给其他药品生产企业，伪造原料购进台账和生产检验记录等违法行为。
万邦德（湖南）天然药物有限公司也不同程度存在上述违法行为。
这两家企业的行为已经严重违反《药品管理法》有关规定和《中国药典》关于银杏叶提取物的标准要求，有些行为已经涉嫌犯罪。
用盐酸工艺提取银杏叶提取物，会造成药品有效成分的分解，虽然尚未发现对人体有害，但是严重影响药品的疗效。
老百姓吃了药却不治病，耽误了治疗，也是危害公众健康。
所以说这次飞行检查发现的问题，性质恶劣、危害很大。
这是一起典型的为降低成本铤而走险，主观故意弄虚作假，使用假劣原料生产药品的违法行为。
市场监测发现，这不是个别企业的问题，还有一些企业也存在类似问题。
近日，中检院从北京市的市场上抽取了14家企业的22个银杏叶药品，采用新研究的补充检验方法进行了检验，发现7家企业的10个产品均不同程度存在改变生产工艺、违法添加相关物质等问题。
银杏叶含量测定方法（槲皮素、山奈素、异鼠李素）银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶。
2005版《中国药典》一部采用高效液相色谱法，以槲皮素、山奈素、异鼠李素为对照，测定总黄酮苷的含量。
一、高效液相色谱法2005版《中国药典》银杏叶含量测定项下：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）为流动相；检测波长为360nm。
理论板数按槲皮素峰计算应不得低于2500。
供试品溶液的制备：取本品中粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取2小时，弃去溶剂，药渣挥干，加甲醇回流提取4小时，提取液蒸干，残渣加甲醇-25%盐酸溶液（4：1）混合液25ml，加热回流30分钟，放冷，转移至50ml量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，即得。
用HPLC法测定银杏叶总黄酮苷的含量时，常用的流动相系统为甲醇-磷酸系统。
①日本岛津LC-6A系列高效液相色谱仪；色谱柱为YWG-C18（10μm,25cm×4.0mm）；流动相：甲醇-水(含0.4%磷酸)（52：48）；检测器：紫外光检测器；波长360nm；柱温30℃。
②Waters高效液相色谱仪；色谱柱为Novaplal C18(300mm×3.9mm,4μm)；流动相：甲醇-水（50：50），磷酸调pH为2.5；检测波长360nm；柱温40℃。
③Waters高效液相色谱仪；色谱柱为Spherisor Rb-18(10μm,250×4mm)；流动相：甲醇-水-磷酸（55：44.5：0.5）；柱温25℃；检测波长370nm。
④岛津LC-6A高效液相色谱仪；C18柱(10μm,3.9mm×300mm)；流动相：甲醇-0.5%磷酸水溶液(48：52)；检测波长368nm。
其它如：袁龙测定银杏叶片剂总银杏黄酮的含量，采用岛津LC-10A VP高效液相色谱仪；色谱柱为Hypersil ODS 柱（205mm×4.6mm,5μm）；流动相：磷酸缓冲液（pH2）-四氢呋喃-甲醇-异丙醇（60：15：10：15）；检测波长380nm.池静端等用反相高效液相色谱法测定了银杏叶中槲皮素、异鼠李素、山萘酚等6种黄酮成分的含量。
编号：QT－QC－122－1512浙江佐力药业股份有限公司验证文件项目名称：银杏叶片微生物限度检查法适用性试验方案编号： QT－VP－QC－122-1512报告编号：QT－VR－QC－122-1512证书编号：QT－VC－QC－122-1512归档日期：目录一、验证方案二、验证报告三、验证批准证书文件编号：QT－VP－QC－122-1512银杏叶片微生物限度检查法适用性试验方案方案起草方案起草人起草日期方案审核方案审核人审核日期审核日期审核日期审核日期方案批准方案批准人批准日期1．验证参加人员及其职责部门姓名职责QC 验证方案起草、负责实施QA 负责取样，进度跟踪及信息沟通质量技术部验证方案、报告审核，负责验证组织实施、评价及偏差调查质量技术部验证方案、报告审核与批准2.概述银杏叶片是我公司生产的口服固体片剂，主要用于活血化瘀通络。
用于瘀血阻络引起的胸痹、心痛、中风、半身不遂、舌强语謇；冠心病稳定型心绞痛、脑梗死见上述证候者。
其处方为单位处方批生产量银杏叶提取物40ｇ 50kg微晶纤维素 27.6ｇ 34.4kg淀粉 100.8ｇ 126kg蔗糖 20.8ｇ 26kg硬脂酸镁 0.8ｇ 1kg30%乙醇 72g 90 kg制成 1000片 125万片主要工艺为原辅料过筛，称量，混合制粒，沸腾干燥，整粒，总混，压片，包衣，铝塑包装，外包。
经前期方法确认，本品不具有抑菌性（见银杏叶片微生物方法检查验证报告编号VP-QC-026），确认检查方法为：取本品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，溶解，混匀，制成1：10均匀供试液。
细菌数、霉菌和酵母菌数检查：取1：10供试液按常规法检查（平皿法）。
3.验证目的由于中国药典2015年版四部1100生物检查法之1105、1106非无菌产品微生物限度检查法与2010年版规定的方法和条件有所变化，现对新版药典规定的检查法适用性进行确认，以确认所采用的方法适合本产品的无菌检查。
4.接受标准4.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌试验组各试验菌回收率在50%-200%。
若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行本产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
若还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，可选择回收最接近要求的方法和试验条件进行本产品的检查。
4.2控制菌（大肠埃希菌）试验若检出试验菌，按本供试液制备方法和控制菌检查方法进行本品检查；若未检出试验菌，应设计新的方法消除本品的抑菌活性，并重新进行确认。
5.验证前准备5.1样品来源：浙江佐力药业股份有限公司生产。
5.2培养基：购买市售所需培养基，培养基有：胰酪大豆胨琼脂培养基（北京三药），沙氏葡萄糖琼脂培养基（北京三药），胰酪大豆胨液体培养基（北京三药），麦康凯液体培养基（北京三药），麦康凯琼脂培养基（北京三药）等。
5.3．菌种：药检所购买。
大肠埃希菌（CMCC（B）44102）、枯草芽胞杆菌（CMCC(B)63501）、金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26003）、白色念珠菌（CMCC(F)98001）、黑曲霉（CMCC(F)98003）、铜绿假单胞菌（CMCC(B)10104）。
5.4．仪器与试验材料：蒸汽灭菌器、净化工作台、无菌隔离舱、集菌培养器（每套3联管）、接种环、试管、刻度吸管、移液管、量筒、酒精灯、75%酒精、镊子等。
5.5．环境监测无菌隔离舱内及物体表面擦拭消毒，系统能正常启动并保持良好运行，尘埃粒子和沉降菌检测结果符合百级洁净级别要求。
5.6．参与人员已经培训并能充分理解验证方法及操作步骤。
6．参考文献：《中国药典》2015版四部通则1105、1106非无菌产品微生物限度检查法7．菌液制备方法7.1接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物少许至胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物少许至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物少许至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20℃～25℃培养24～48小时。
取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液，2～8℃保存，备用（注配制好的菌悬液应尽快使用，尽可能在24小时内使用）。
7.2接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培斜面培养基上，20℃～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，用接种环轻轻将孢子洗脱。
然后用一支10ml无菌球形毛细吸管，其管口用无菌纱布包扎，吸出孢子菌液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100cfu的孢子悬液，2～8℃保存，备用。
7.3注意事项菌悬液配制的稀释过程中，每一级稀释液混合震荡必须充分。
由于菌种为具有特殊活性的生物，菌种的状态、接种量及培养时间对最终菌悬液配制浓度都有影响，因此试验中应严格按照已确定的实验参数。
制备好的原菌悬液以当天使用为宜。
自我保护，防止感染。
7.4菌液计数方法每次制备菌液量约100ml，将制备好的菌液充分摇匀，用灭菌移液管吸取1ml，置适宜的灭菌试管中，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液9ml，然后充分摇匀，作为10-1倍稀释菌液，再从10倍稀释菌液管吸取1ml，置适宜的灭菌试管中，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液9ml，充分摇匀，作为10-2倍稀释菌液，依次稀释，制备一系列稀释菌液，将各稀释菌液取1ml，涂布于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，接种于胰酪大豆胨琼脂培养平皿中，每种菌液作平行样，30℃～35℃培养18～24小时，计数，取菌液浓度在小于100cfu/ml稀释级的菌液作为供试菌悬液。
白色念珠菌、黑曲霉菌液取1ml分别接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿中，每种菌液作平行样，20℃～25℃培养24～48小时，计数。
生孢梭菌培养应在厌氧培养专用袋中培养。
每稀释取样时，移液管须更换，每步稀释菌液应充分混匀，吸取体积要准确。
宜选取10-4～10-8稀释级菌液计数。
8.计数方法验证验证试验分3组，三批分次独立试验，并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。
8.1 供试品溶液制备取银杏叶片10g，置适宜三角瓶中，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（可适当均匀加热，温度不超过45℃）100ml，振摇，制成1:10供试品溶液。
如需稀释时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
8.2试验组取供试品溶液1ml和适量试验菌（使每ml供试液含菌量不大于100cfu），注入直径90mm的无菌平皿中，每个平皿注入15-20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
每株试验菌平行2个平皿，按平皿法测定其菌落数，以算术均值作为计数结果。
胰酪大豆胨琼脂培养基培养温度30℃～35℃培养3天（其中接种白色念珠菌和黑曲霉的培养5天）；沙氏葡萄糖琼脂培养基20℃～25℃培养5天，计数。
8.3菌液组取稀释液代替供试液，按试验组操作加入试验菌液，对各试验菌逐一进行微生物回收试验。
8.4供试品对照组取上述供试品溶液1ml注入平皿，以稀释液代替菌液同试验组操作。
8.5 回收率计算试验组菌回收率(%)=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数) ×100%/菌液组平均菌落数9.控制菌（大肠埃希菌）9.1菌液制备和计数方法同7.菌液制备方法9.2供试液的制备8.1 供试品溶液制备9.3 试验菌取供试品溶液10ml和不大于100cfu的大肠埃希菌至100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，按微生物限度检查法标准操作规程（SOP-QC-A-005）之大肠埃希菌检查法检查，在规定的温度和最短时间下培养，观察能否检出大肠埃希菌的反应特征。
9.4阴性对照取相应稀释液10ml替代供试品溶液，同试验菌试验同法操作，应能检出大肠埃希菌的反应特征。
10.总结与评价对验证过程及结果进行评估，评估内容包括是否严格按既定的方案组织实施，验证是否按进行了三次独立的试验，培养基的适用性检查是否进行并符合要求，标准菌株管理及试验菌液的制备是否合理，任何偏差是否列入偏差分析并进行调查。
11.再验证计划若检验程序或产品发生变化可能影响结果时，应重新进行方法适用性试验。
文件编号：QT－VR－QC－122-1512银杏叶片微生物限度检查法适用性试验报告报告起草方案起草人起草日期报告审核报告审核人审核日期审核日期审核日期审核日期报告批准报告批准人批准日期1．验证参加人员及其职责部门姓名职责QC 验证方案起草、负责实施QA 负责取样，进度跟踪及信息沟通质量技术部验证方案、报告审核，负责验证组织实施、评价及偏差调查质量技术部验证方案、报告审核与批准2.概述银杏叶片是我公司生产的口服固体片剂，主要用于活血化瘀通络。
用于瘀血阻络引起的胸痹、心痛、中风、半身不遂、舌强语謇；冠心病稳定型心绞痛、脑梗死见上述证候者。
其处方为单位处方批生产量银杏叶提取物40ｇ 50kg微晶纤维素 27.6ｇ 34.4kg淀粉 100.8ｇ 126kg蔗糖 20.8ｇ 26kg硬脂酸镁 0.8ｇ 1kg30%乙醇 72g 90 kg制成 1000片 125万片主要工艺为原辅料过筛，称量，混合制粒，沸腾干燥，整粒，总混，压片，包衣，铝塑包装，外包。
经前期方法确认，本品不具有抑菌性（见银杏叶片微生物方法检查验证报告编号VP-QC-026），确认检查方法为：取本品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，溶解，混匀，制成1：10均匀供试液。
细菌数、霉菌和酵母菌数检查：取1：10供试液按常规法检查（平皿法）。
3.验证目的由于中国药典2015年版四部1100生物检查法之1105、1106非无菌产品微生物限度检查法与2010年版规定的方法和条件有所变化，现对新版药典规定的检查法适用性进行确认，以确认所采用的方法适合本产品的无菌检查。
4.接受标准4.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌试验组各试验菌回收率在50%-200%。
若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行本产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
若还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，可选择回收最接近要求的方法和试验条件进行本产品的检查。
4.2控制菌（大肠埃希菌）试验若检出试验菌，按本供试液制备方法和控制菌检查方法进行本品检查；若未检出试验菌，应设计新的方法消除本品的抑菌活性，并重新进行确认。
5.验证前准备5.1样品来源表1序号产品批号规格生产单位1 151201 总黄酮醇苷9.6mg萜类内酯2.4mg 浙江佐力药业股份公司2 151202 总黄酮醇苷9.6mg萜类内酯2.4mg 浙江佐力药业股份公司3 151203 总黄酮醇苷9.6mg萜类内酯2.4mg 浙江佐力药业股份公司5.2培养基及适用性检查表2序号名称批号有效期至生产厂商1 胰酪大豆胨液体培养基150303 2018.03.02 北京三药科技开发公司2 沙氏葡萄糖琼脂培养基150709 2018.07.08北京三药科技开发公司3 沙氏葡萄糖液体培养基1405082 2017.05.07北京三药科技开发公司4 胰酪大豆胨琼脂培养基150916 2018.09.15北京三药科技开发公司5 麦康凯琼脂培养基130**** ****.03.04北京三药科技开发公司6 麦康凯液体培养基150924 2018.09.23北京三药科技开发公司7 PH7.0氯化钠蛋白胨-缓冲液150211 2018.02.10北京三药科技开发公司上述培养基均经过培养基适用性检查方法检查且符合要。
