下载文档原格式
![裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/2d4af96d2f3f5727a5e9856a561252d380eb20cf.png)
专利名称：裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法专利类型：发明专利
发明人：黄和,马旺,孙小曼,贾雨雷,黄鹏伟
申请号：CN202210328681.9
申请日：20220330
公开号：CN114561434A
公开日：
20220531
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于生物工程技术领域，公开了一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，该方法是以裂殖壶菌为生产菌株，在发酵培养基中添加恩西地平，发酵生产多不饱和脂肪酸。
本发明通过激活裂殖壶菌部分ELO/DES途径，提高裂殖壶菌发酵产物中EPA和DHA含量，采用裂殖壶菌工程菌EDG为生产菌株，使发酵产物中EPA含量提高8.73倍，DHA含量提高1.15倍。
申请人：南京师范大学
地址：210023 江苏省南京市栖霞区文苑路1号
国籍：CN
代理机构：石家庄科诚专利事务所(普通合伙)
更多信息请下载全文后查看。
高密度培养裂殖壶菌生产DHA的开题报告题目：高密度培养裂殖壶菌生产DHA的研究引言：DHA(Docosahexaenoic Acid)是一种重要的欧米伽-3多不饱和脂肪酸，具有良好的生理功能，特别是对心脑血管系统的保健作用已广受关注。
目前，DHA主要通过鱼类油提取或微藻发酵得到，但存在生产成本高和产量低的问题。
因此，寻找高效低成本的DHA生产途径十分重要。
裂殖壶菌是一种单细胞真核藻类，具有高生长速度、高DHA积累能力等优点，是一种生产DHA的有前途的微生物。
本研究的目的是通过高密度培养裂殖壶菌，提高其DHA产量和生产效率。
研究内容：1.裂殖壶菌筛选与培养条件优化：筛选适合高DHA产量的裂殖壶菌菌株，并通过理化因素调控优化其生长和DHA积累条件。
2.高密度培养模式研究：通过调节搅拌速度、通气量、培养时间等参数，建立裂殖壶菌的高密度培养模式，提高菌落数量和DHA生产效率。
3.反应器建模与传质研究：通过探究反应器内部流场、物质传质等过程，建立裂殖壶菌高密度培养的数学模型，为优化反应器设计提供依据。
预期成果：本研究将建立高密度培养裂殖壶菌的生产DHA方法，并探索最优化的反应器设计方案，以提高菌落数量和DHA生产效率。
预计在产量、物质转化率和能源利用等方面取得显著进展，为生产高效低成本的DHA产品提供技术支持。
研究意义：本研究以裂殖壶菌为研究对象，通过优化菌株和培养条件、建立高密度培养模式和数学模型等手段，为DHA的高效生产提供了新途径和新思路，将有助于满足市场对DHA产品的需求，促进欧米伽-3多不饱和脂肪酸的健康应用。
同时，本研究所建立的反应器模型和优化方案也将为微生物高密度培养过程的研究提供参考和借鉴。
・综 述・真菌发酵生产EPA及DHA影响因素的研究进展陈 欣(华东船舶工业学院生化系,江苏镇江 212005)摘 要 对真菌发酵生产EPA及DHA的影响因素进行综述,介绍了菌种、碳源、氮源、C/N比、p H值、温度、发酵时间、通气量、代谢途径的调控、种龄和接种量等因素对EPA及DHA产量的影响。
关键词 二十碳五烯酸(EPA);二十二碳六烯酸(DHA);真菌;发酵;多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PU FA)中图分类号 Q939.97 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2002)05-0037-04 多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PU FA)中的大多数是生物活性物质的前体,具有抗氧化、抗衰老等作用[1,2]。
如二十碳五烯酸(eicos2 apentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosa2 hexaenoic acid,DHA)等ω23脂肪酸具有健脑、防治心血管疾病、风湿性关节炎、视力下降、癌症和心脏猝死等作用。
尤其是EPA和DHA可以促进胎儿脑细胞发育、婴儿脑细胞生长,促进青少年提高记忆力,防止老年痴呆等功能,故有“脑黄金”之美称[3]。
天然的EPA及DHA通常存在于海洋生物中,特别是海洋浮游植物中含量丰富。
目前EPA及DHA的商业来源主要是深海鱼油,由于鱼油资源有限且含量和构成受鱼的种类、季节、地理位置等因素的影响而不能满足人们的需要[3,4]。
某些微生物由于富含多不饱和脂肪酸而且其生产不受季节限制,因而成为多不饱和脂肪酸的新来源之一[5]。
真菌发酵生产EPA及DHA的质量和产量均受到菌种及发酵条件的影响。
以下分别以菌种、碳源、氮源、C/N比率, p H值、温度、发酵时间、通气量、种龄、代谢途径的调控和接种量等重要因素讨论对发酵的影响。
1 菌 种 研究表明,能产生EPA及DHA的微生物主要有真菌和藻类[6]。
本论文不同意在《中国食品学报》上发表吐温对裂殖壶菌发酵生产DHA的影响常明，李婧 ，李翔宇，刘睿杰，金青哲，王兴国*（食品科学与技术国家重点实验室食品，安全与营养协同创新中心，江南大学食品学院，无锡214122）摘要裂殖壶菌作为好氧型产油微生物，是目前工业化生产DHA的主要菌株之一。
吐温是一种表面活性剂，作为培养基添加物，可起到改变细胞膜渗透性、增强底物与氧气传质、促进生长、提高脂质积累的效果。
实验探究了吐温系列（tween-20、tween-40、tween-60和tween-80）对裂殖壶菌生长、脂质积累和脂肪酸组成的影响。
结果表明，在1%（v/v）添加量下，吐温20与40促进菌体生长；4种吐温均显著增强了菌体总脂积累能力，DHA产量分别比对照组提高了28.68%、29.33%、16.29%和20.67%；吐温20和40将最终总脂产量由22.68 g/L提升至29 g/L以上，DHA产量由10.74 g/L提升至约13.8 g/L。
关键词裂殖壶菌；吐温；发酵；DHAEffect of Tween on DHA production by Schizochytrium sp. SR21LI Jing, Chang Ming*, Li Xiangyu, Liu Ruijie, Jin Qingzhe, Wang Xingguo(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Synergetic Innovation Center Of Food Safety and Nutrition, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122)Abstract Schizochytrium, one of the main sources of DHA, is aerobic oleaginous microorganism. Tween series, as non-ionic surfactants, added to the medium were known to interfere with the permeability of cell membranes, enhance the nutritional input and oxygen transfer, as well as improve growth and oil production of microorganisms. This research works were focus on the effect of Tween series (Tween-20, Tween-40, Tween-60 and Tween-80) on the growth, lipid accumulation and fatty acid composition in Schizochytrium sp. The results showed that total lipid content was significantly higher with Tween series (1%) and DHA yield were increased by 28.68%, 29.33%, 16.29% and 20.67% with Tween-20, Tween-40, Tween-60 and Tween-80 respectively. In addition, accompanying with the increasing of biomass, the total lipid and DHA production of Schizochytrium sp. were improved to 29 g/L and 13.8 g/L from 22.68 g/L and 10.74 g/L with 1% Tween 20 or Tween 40 respectively.Key words Schizochytrium; Tween; fermentation; DHA二十二碳六烯酸（22:6 n-3）（DHA）是一种重要的ω-3系列多不饱和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids），具有促进婴幼儿智力和视力发育、预防心血管疾病、抗癌、抗炎、增强免疫力等功效[1]，近年来受到广泛关注。
微生物发酵法生产出的DHA避免了传统来源——深海鱼油存在的诸多问题，例如品质不稳定、外源性污染、气味不良、纯化成本高、含有EPA和胆固醇等[2]，具有广阔的应用前景。
裂殖壶菌（Schizochytrium）属于破囊壶菌科的一类海洋微藻，是目前工业化生产DHA的热点菌株。
Schizochytrium藻油的安全性已得到美国FDA认可，2012年3月我国卫生部出台了《食品营养强基金项目：中国国家自然科学基金（31401619）；江苏省自然科学基金（BK20140156）作者简介：李婧（1990-），女，硕士研究生，研究方向为微生物油脂*通讯作者：常明（1979-），男，副教授，研究方向为油脂生物技术化剂使用标准》GB14880—2012，批准Schizochytrium藻油DHA可用于婴幼儿配方食品。
吐温是山梨醇酐脂肪酸酯的环氧乙烷加成物（加成数为20），化学名称为聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯。
吐温系列包含有吐温20、吐温40、吐温60和吐温80，分别为聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、单棕榈酸酯、单硬脂酸酯和单油酸酯。
吐温作为非离子型表面活性剂，亲水性强，广泛用作乳化剂和油类物质增溶剂等[3]。
研究表明，在发酵培养基中添加表面活性剂，可以改变微生物的生理学性质，提高代谢产物的合成，促进生长与呼吸，以及改变细胞膜结构和渗透性[4]。
Saenge等[5]发酵Rhodotorula glutinis生产脂质与类胡萝卜素时，在培养基中分别添加1%的吐温80、吐温20和阿拉伯树胶作为表面活性剂，结果显示三者都具有提高总脂含量的效果。
Taoka等[6]在基础培养基中添加1%的吐温80，也显著提高了破囊壶菌的生物量和总脂含量。
目前，吐温用于裂殖壶菌培养基添加物的研究未见报道。
本文研究了吐温系列（吐温20、吐温40、吐温60和吐温80）对裂殖壶菌生长、脂质积累和脂肪酸组成的影响。
在1%（v/v）添加量下，四种吐温对裂殖壶菌总脂产量和DHA产量均具有显著的提升作用。
本研究为利用表面活性剂提高Schizochytrium藻油生产效率提供了实验依据。
1 材料与方法1.1实验材料1.1.1菌种裂殖壶菌Schizochytrium sp. SR21（A TCC1381），购自美国菌种收藏中心（ATCC）。
1.1.2培养条件培养基：①种子培养基（g/L）：甘油30、酵母膏5、谷氨酸钠5、Na2SO4 15、K2SO4 1、MgSO4·7H2O 3、K2HPO4 2、KH2PO4 3、VB1 0.005、VB6 0.002、VB12 0.005；②发酵培养基（g/L）：甘油100、酵母膏10、谷氨酸钠15、Na2SO4 15、K2SO4 1、MgSO4·7H2O 4、KH2PO4 0.1、VB1 0.008、VB6 0.002、VB12 0.015；pH6.5，维生素过滤除菌，其余121 ℃、20 min灭菌。
培养方法：①种子培养：250 mL三角瓶中装50 mL种子培养基，从斜面挑取菌落接入，25 ℃、200 r/min 摇床培养48 h；②发酵培养：250 mL三角瓶中装50 mL发酵培养基，10%（v/v）接种，25 ℃、200 r/min 摇床培养6 d。
1.1.3 主要试剂吐温20、吐温60、吐温80，国药集团化学试剂有限公司（上海）；吐温40，阿拉丁试剂（上海）有限公司。
1.2实验仪器气相色谱仪，Agilent Technologies 7820A；ZWY-211B恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；LDZX-50KB高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；ZHJH-C1112B超净台，上海智城分析仪器制造有限公司。
1.3发酵指标测定细胞干重、脂质提取参见文献[7]；脂肪酸甲酯化及气相色谱分析参见文献[8]。
每个实验重复3次，并用统计学方法求平均值。
2 结果与分析2.1吐温20添加量对裂殖壶菌发酵的影响2.1.1吐温20添加量对裂殖壶菌生长、总脂和DHA含量的影响以100 g/L 甘油为初始碳源，分别添加0%（对照）、0.1%、0.5%、1.0%（v/v ）的吐温20，25 ℃、200 r/min 发酵6 d 。
生长曲线见图1。
结果表明，甘油为碳源时，吐温20对裂殖壶菌的生长有一定促进作用，主要表现在发酵后期生物量的提高上，以添加量0.1%最为显著（41.50 g/L ），比对照组提高了5.16 g/L 。
甘油为碳源发酵时，随发酵后期菌体密度的增大，发酵液溶氧迅速下降，导致甘油初级代谢酶甘油激酶活力锐减，这是甘油作为碳源利用率较低的原因[9,10]。
吐温20作为乳化剂，有增强氧气传质的作用，可能在一定程度上改善了发酵后期溶氧不足的问题，从而提高了甘油利用率。
另一方面，吐温可以干扰细胞膜渗透性，提高细胞从外界吸收营养物质的能力；Taoka 等[11]曾将吐温80用于从海水中分离破囊壶菌，也是基于此原理。
从总脂含量与DHA 含量来看，如表1所示，吐温20对总脂积累有明显的提升效果，最终总脂含量与产量随添加量的增加而增大，以1%最为显著。
该效果主要表现在氮源耗尽之后（3 d ）。
吐温20对DHA 占总脂肪酸含量没有明显的影响。
但鉴于生物量与总脂含量的提高，DHA 产量分别比对照组提高了36.43%，35.41%和41.02%。
图1 吐温20添加量对生物量的影响Fig. 1 Effects of Tween-20 concentration on dry cell weight by Schizochytrium sp. SR21表1 吐温20添加量对总脂与DHA 含量及产量的影响Table 1 Effects of Tween-20 concentration on parameters in DHA fermentation by Schizochytrium sp. 吐温20/%总脂含量 /(%,细胞干重）总脂产量 /（g/L ） DHA 含量 /（%,总脂肪酸）DHA 产量 /（g/L ） 0 62.40 22.68 47.37 10.74 0.1 65.52 27.19 49.19 13.37 0.5 68.01 26.54 50.00 13.27 1.073.2729.0147.6413.822.1.2 吐温20添加量对裂殖壶菌脂肪酸组成的影响吐温20分子上连接有脂肪酸C 14:0。
