细胞周期的流式检测方法

全程服务（六）流式细胞仪周期检测大家总是想让自己的实验数据有不动声色的高级感，流式细胞仪检测就是细胞生物学的必备高级技能。

周期实验是检测药物、基因或蛋白对细胞周期影响的一种检测方法，具体要怎么做呢？且听我道来。

实验原理细胞周期（Cell Cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。

细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。

表1 细胞周期细胞周期特征间期G1期DNA合成前期S期DNA合成期G2期DNA合成后期分裂期M期有丝分裂前、中、后、末期G0期分裂结束后暂时离开细胞周期流式细胞仪用PI染色法检测细胞周期。

由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而 G2/ M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。

PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。

因此,通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0 期，S期和G2/M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过软件计算各时相的细胞百分率（如图1所示）图1 流式周期检测图说明技术应用检测异倍体的肿瘤细胞，检测药物、基因或蛋白等对细胞周期的影响。

实验步骤1. 细胞收集：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ ml以1 ml接种24孔板或2 ml接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，用常规胰酶消化并收集于离心管中，然后用PBS洗涤细胞2-3次，制备成单细胞悬液。

2. 细胞固定：1000 rpm离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清，用PBS洗涤两次后加入250 µl PBS使细胞重悬，再逐滴加入750 µl预冷的无水乙醇（-20℃），使其终浓度为75% 4℃放置过夜固定。

细胞周期和DNA倍体流式细胞术分析细胞周期是指细胞从一个有丝分裂开始到下一次有丝分裂开始所经历的一系列连续的时期。

细胞周期通常被分为四个阶段：G1期（Gap1期，细胞生长期）、S期（DNA合成期）、G2期（Gap2期，前期细胞准备期）和M期（有丝分裂期）。

细胞周期具有非常重要的生物学意义，它决定了一个细胞的生长、分化和复制过程。

了解细胞周期的调控机制对于研究细胞增殖、肿瘤发生机制等具有重要的意义。

DNA倍体流式细胞术是一种通过荧光染料标记DNA，利用流式细胞术分析细胞DNA含量和细胞周期的技术。

该技术通过细胞破碎和DNA染色使细胞DNA可见，并将细胞通过流式细胞术导入流式细胞仪中进行分析。

DNA倍体流式细胞术可以帮助我们了解细胞的DNA含量和倍体状态，从而推测细胞的生活循环和增殖能力。

DNA倍体流式细胞术的主要步骤包括：1.细胞处理：将细胞收集并进行预处理，使其达到适宜测量的状态；2.细胞固定：使用适当的化学物质固定细胞，以便于后续的染色和分析；3.DNA染色：通过DNA染色剂（如荧光素染剂）染色细胞DNA，使其可见；4.流式细胞术：将染色后的细胞通过流式细胞仪分析流式细胞术；5.数据分析：根据细胞染色的荧光强度和形态学特征来判断细胞周期和DNA倍体状态。

细胞周期和DNA倍体流式细胞术在分析细胞生命活动和基因组复制状态方面具有广泛的应用前景。

首先，细胞周期和DNA倍体流式细胞术可用于研究肿瘤的发生和发展机制。

在肿瘤细胞中，由于基因突变等原因，细胞周期的调控失去平衡，细胞周期的不正常分布和DNA倍体异常常常出现。

通过检测细胞周期和DNA倍体状态，可以更好地了解肿瘤细胞的生物学特性，从而为肿瘤治疗提供理论依据。

其次，细胞周期和DNA倍体流式细胞术还可用于研究细胞分化和发育过程。

细胞分化和发育是多个细胞周期的连续进行，通过细胞周期和DNA 倍体状态的测量，可以揭示不同细胞类型的分化和发育过程的调控机制，进一步推测细胞分化和发育的时序和关系。

PI染色检测细胞周期
1、HepG2细胞培养至70%左右，细胞铺板（60mm小皿），8万/皿，饥饿48小时，加药处理96h（加药组10万/皿）
2、收集培养基，2ml胰酶消化细胞，新培养基3ml重悬，收集细胞悬液，1000rpm，5min离心
3、弃去上清，加入1ml预冷的PBS充分重悬细胞，转移到1.5ml的EP管
4、混匀，4°，600g，5min离心
5、弃去上清，用250ul预冷的PBS重悬细胞，充分重悬，加入至750ul冰浴的无水乙醇，轻轻吹打混匀；
6、用封口膜封口，—20°，4h，最好过夜，可在—20°保存1w左右；
7、染色：
㈠、除去封口膜，加入500ulPBS重悬细胞，4°，600g，5min离心；
㈡、弃去上清，加入1ml预冷的PBS洗涤一次；
㈢、同上离心，弃去上清；
㈣、每管加入200ul PBS +2ul RnaseA（100µg/ml）溶液缓慢充分混匀后，室温，避光孵育30min, 再加2.5ul PI(250µg/ml)，室温避光15min；
㈤、24h内流式检测。

试剂：RnaseA，beyotime,10mg/ml,ST576
PI, beyotime,20 mg/ml,ST512。

1.消化：将细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化1-3min，（时间尽可能长，以减少吸管吹打），待消化充分，弃去胰酶，加入PBS5ml。

2.收集细胞：吸管吹打，移入离心管。

3.低速度离心：1000转5min弃去上清。

4.反复漂洗离心：加入PBS5-8ml，低速离心，同上步，重复3次，以除去细胞碎片。

5.获得单细胞悬液：加入1mlPBS，调整单细胞悬液至1-5*10^6/l，吸管吹打，制成单细胞悬液，4度保存。

6.PI染液制备：100ml去离子水加入5mgPI。

调PH值7,2-7。

4度棕色瓶保存。

4度避光保存。

7.、加入-20度预冷的乙醇。

4度过夜。

8.1000转5分钟离心弃去上清，
9.加入3mlPbs重悬。

10.1000转5分钟离心弃去上清，
11.加入100ulRNA酶37度水浴孵育30min
12.加入500ulPI染液4度避光孵育30min
13.上机前轻弹试管，，设立PI单染细胞组，检测。

一．细胞周期的检测1、原理：细胞在有丝分裂的过程中DNA会加倍。

（n----2n）2、我们使用PI来标记DNA。

PI的通到是FL23、荧光信号的表示方法，有荧光的宽度（W），荧光的高度（H），和荧光信号的积分面积（A）.我们使用荧光的积分面积（A）来检测细胞周期的变化.因为，即使DNA的含量相同的两个细胞，如果细胞的形状差异较大，荧光信号的高度是不相等的。

但是积分面积一定相等。

4.接下来我以二倍体细胞为例降解，流式检测细胞周期的过程。

首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞（G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的细胞又有G1期，S期,G2期和M期。

我们来分析下各个时期DNA含量的变化。

G0期DNA数目为n.G1期细胞主要进行RNA和蛋白的合成, DNA数目为n.S期DNA开始复制，直到复制结束进入M期，DNA数目从n变为2n.G2期主要是RNA和蛋白的合成,为M期做准备 DNA数目为2nM期细胞分裂的过程，直到M结束细胞一分为二，DNA数目也是2n.从DNA的数目上，我们可以将细胞周期分为G0/G1期，s期，G2/M期.我们利用荧光强度的积分面积来检测，利用直方图来表示，如果G0/G1期处于50的位置，那么G2/M期处于100的位置。

期间的为S期。

4、但是有个问题值得我们注意。

我们的样本很容易聚集有时候两个G1期的细胞会聚集在一起形成粘连体，通过激光照射区时，其荧光强度会和G2期的相同，这就需要排除粘连体。

我们BD公司的专利技术可以使粘连体通过检测区的荧光宽度比G2期的长。

我们利用W对A的散点图分析，如果G0/G1期在50的位置，那么G2/M期在100的位置，其他的位置为粘连体和一些不符合检测的细胞及碎片等。

我们通过画门来得到我们需要检测的细胞。

5、因此我们需要三个图就可以检测到我们的细胞周期变化情况，第一个散点图，通过前向和侧向的变化，区分出我们要检测的细胞群。

第二个散点图我们出去粘连体。

第三个直方图得到我们的细胞周期变化。

pi细胞周期流式分析门控策略
pi细胞是指在生长和复制阶段中DNA含量翻倍的细胞，在细胞周期的G1期至S期转换时异常积累。

流式细胞分析是一种可以测量细胞表型、形态、DNA含量以及细胞周期等参数的技术，因此可以用于pi细胞的检测。

门控策略是利用多因子分析法对细胞进行区分和分析。

对于pi细胞，通常采用PI（propidium iodide）染色法，将细胞DNA染色红色并流式分析。

流式细胞分析仪采用多重荧光检测系统，如蓝色激光与PI荧光可以实现细胞DNA含量的检测。

利用细胞DNA含量与细胞周期之间的关系，通过设置特定的门控来筛选pi细胞。

例如，双参数图设置红色荧光右移阈值和细胞数计数阈值，就可以检测pi细胞的比例和细胞环境下pi细胞的数量。

这种门控策略可以鉴别pi细胞并研究其生理特征和生物学过程，是对肿瘤细胞增殖和恶化机制的研究非常有帮助的技术。

流式细胞仪检测细胞周期操纵步调之杨若古兰创作取对数生持久的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比方加药,照耀）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋形态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃持久保管.↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP 管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标识表记标帜EP管↓提前一天网上预定↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构普通分为5部分：①流动室及液流驱动零碎；②激光光源及光束成形零碎；③光学零碎；④旌旗灯号检测、存贮、显示、分析零碎；⑤细胞分选零碎.↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后拔出流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中间喷出，构成细胞液柱↓液柱与激光束订交，细胞上的荧光染料被激发发生荧光（488nm激发光源）↓荧光旌旗灯号酿成电旌旗灯号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C ——Flowjo软件分析FCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M.G0/1和G2M 细胞峰的 DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布↓检测结果刻录光盘保管↓关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗）正常细胞DNA含量：2n-4n凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性添加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DNA含量减少.PI染色后，荧光强度减小而构成一个DNA含量小于2n的分布区（亚G1峰）.1、纵坐标Cell Number：即计数的无效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中曾经标示；4、右边数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA 含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡基来源根基理：磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素Ⅴ（AnnexinⅤ）发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不克不及透过正常细胞膜，只能进入曾经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系.正常细胞：膜完好，PS不过翻——PI-/AnnexinⅤ-凋亡初期：膜完好，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+凋亡初期：PS外翻，膜通透性添加——PI+/AnnexinⅤ+坏死细胞：膜严重破损，PS不过翻——PI+/AnnexinⅤ+几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-实验步调：取对数生持久的细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比方加入药物）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓细胞用0.25%胰酶37℃消化5min(胰酶消化时间不容易过长，以防惹起假阳性）↓加入PBS制成细胞悬液（移液枪吹打6-8次）↓倒置显微镜下观察细胞形态（单个分离悬浮）↓将细胞悬液移入15ml离心管中↓2000rpm离心5min,PBS吸除↓用PBS 清洗细胞2次（2000rpm，离心5min收集细胞）↓用400ul 1×Binding Buffer 悬浮细胞(浓度大约为1×106cells/ml)↓在细胞悬液中加入5ul Annexin V-EGFP，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15 min↓加入10ul PI 后轻轻混匀,于2-8℃避光条件下孵育5 min↓在1 h内用流式细胞仪检测流式细胞仪激发光波长采取Ex.= 488nm双波长激发，Em.= 510 nm检测EGFP荧光(FL1 channel)和>575 nm的发射波长检测PI.细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包含极初期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色.在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，浮现Annexin V +/PI-.。

细胞实验技术之细胞周期检测导读细胞周期是指细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的时间，它代表着生命从一代向下一代传递的连续过程，与前几期我们介绍过的细胞学实验（细胞增殖、克隆形成等）一样，细胞周期也是评价细胞增殖功能的重要实验。

流式细胞仪是检测细胞周期最常用的方法，然而我们会碰到细胞量不够、细胞碎片太多等原因，导致实验一次次重复，本文就一起看看如何把细胞周期的数据变的更加漂亮，准确！一、细胞周期简介主要分为以下2大过程：1.分裂间期：间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）；2.分裂期M期：细胞分裂期，指细胞分裂开始到结束。

细胞周期图（来自网络）•注：G0期是指某些细胞在分裂结束后会暂时离开细胞周期，停止细胞分裂；但在一定适宜刺激下，又可进入周期；•因为分裂间期持续的时间远远比分裂期持续时间长，在一个正常细胞周期中，分裂间期时间会占整个细胞周期的90%～95%；•不同类型细胞的G1期时间长短不同，所以其细胞周期时间存在差异。

如：人类胃上皮细胞为24小时，骨髓细胞为18小时，HeLa细胞为21小时。

二、常用的实验方法细胞周期常用检测方法有流式检测法、BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)掺入法及同位素标记法等，其中流式检测法因适用于大量样品检测，可快速分析单个细胞的多种特性，是目前最为常用的测定细胞周期的一种方法，下面就详细介绍如何利用流式细胞仪进行周期分析。

1. 流式检测的实验原理由于细胞周期各时相的DNA含量不同，因此，可通过特异性与DNA结合染料来检测细胞内的DNA含量来测定细胞周期。

流式中常用碘化丙啶(Propidium，简称PI)与DNA结合，其荧光强度与DNA 含量成正比。

因此，通过流式细胞仪对细胞内DNA含量进行检测，同时获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。

2. 流式细胞仪的实验步骤A. 收集细胞取适量的对数生长期细胞接种于6cm中，在相应的条件下（如药物）处理相应时间后，倒去培养基，用胰酶适度消化细胞，离心收集细胞，弃去上清；Tips:•细胞数量：一般情况下，由于在细胞周期中分析的细胞数应达到1.0*104~3.0*104才具有统计学意义。

实 验 实 验 目 的
标明你所测定的样品中各周期时相的百分比？ 流式细胞术分析细胞周期时相
原理
加PI约50µL至终浓度约为65µg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。
掌握流式细胞仪的工作原理
流式细胞术分析细胞周期时相
用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测
利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测 实验目 的
细胞周期时相分析
仪器、材料与试剂
仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱 材料：HeLa细胞，5ml注射器，离心管，封口膜，微量移液器，Tips 试剂：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-20℃保存），
细胞周期时相分析
实验报告及思考题
实验报告
标明你所测定的样品中各周期时相的百分比？
思考题
1. 流式细胞术在科学研究中的应用 2. 本实验为何要采用对数生长期的细胞？
细胞周期时相分析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实验 利用流式细胞 术分析细胞周期时相
细胞生物学实验
流式细胞术分析细胞周期时相
• 实验目的 • 实验原理 • 仪器、材料与试剂 • 实验步骤 • 实验报告及思考题
实验目 的
掌握流式细胞仪的工作原理 掌握用流式细胞仪测量细胞群体DNA 含量分布的方法 了解流式细胞术在细胞生物学研究中 的应用
细胞周期时相分析
试剂：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-20℃保存），
细胞生物学实验
实验 利用流式细胞术分析细胞周期时相
流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。

流式检测细胞周期线粒体膜电位（MMP）：使用几种染料中的其中一种就可以检测到细胞在凋亡过程中MMP的降低，如双氰基-双己氧基羰基靛蓝，它能够隐藏在活细胞的线粒体内。

当MMP体系崩溃时，细胞的荧光就会减少。

磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞表面的分布情况：PS一般分布在质膜的内侧上。

在细胞凋亡过程中，PS残余物会曝露在细胞表面。

这种变化可以通过复合蛋白钙依赖的磷脂结合蛋白V与PS结合来进行检测。

所使用的细胞必须是未经修复的，因为钙低速的磷脂结合蛋白V不能到达完整细胞的内部。

PI常被用来加到二次坏死细胞中来进行鉴别。

DNA消化：在最新的细胞凋亡的一系列反应过程中，一种特异的内切核酸酶能够将染色体这间的连接点打断，形成大量的小片段，这些小的片段是一些低聚体，其大小约为180bp。

可以通过以下两种方法对DNA链的断裂进行检测：观察DNA柱状图的sub-G1顶点；用脱氧核糖核苷末端转移酶对DNA链的断口进行标记（TUNEL 检测）。

Sub-G1点：如果细胞在乙醇中固定，随后再水合时，一部分低分子量的DNA会被滤掉，以降低DNA的含量。

这些细胞会在DNA柱状图中作为独立的峰被观察到。

TUNEL检测：DNA链的断裂末端可以通过酶标记作用进行标记。

在70%乙醇中固定之前，细胞在1%多聚甲醛中固定以将小的DNA片段结合到细胞中去，然后和Tdt以及一种已标记的核苷一起进行培育。

所用的这些核苷包括：地高辛－dUTP，用经FITC标记的抗地高辛配基进行检测；生物素－dUTP，用经FITC标记的抗生素蛋白进行检测；溴－dUTP，用抗BrdUrd的FITC进行检测。

在加入PI标记DNA后，绿（FITC）与红（PI）相对的荧光能够进行记录。

凋亡的细胞会发出绿色的荧光，经染色过的DNA表明从凋亡的细胞中的细胞循环间隔会被诱导产生。

细胞生长及死亡：组织的发育和肿瘤的生长在细胞分裂和死亡的平衡是同样的。

在许多细胞动力学研究中，它们具有同样重要的地位。

细胞周期检测点的流式细胞术分析一、概述细胞周期检测点的流式细胞术分析是一种先进的生物学研究方法，它结合了流式细胞术的高通量、高精度特点与细胞周期检测点的关键生物学意义，为研究者提供了深入理解细胞生长、增殖和分化过程的强大工具。

细胞周期是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的全过程，包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）以及细胞分裂期（M期）。

在每个周期阶段，细胞都会进行特定的生理活动，如DNA复制、蛋白质合成等。

而检测点则是细胞周期中确保各个阶段顺利进行的关键环节，它们能够监测并应对各种可能影响细胞周期进程的内外因素。

流式细胞术是一种可以对细胞进行快速、定量分析和分选的技术。

通过利用不同荧光物质标记的单克隆抗体，流式细胞术能够检测细胞周期中各个阶段的特异性标志物，从而实现对细胞周期的精确分析。

流式细胞术还具有高通量、高灵敏度和高准确性的优点，能够在短时间内处理大量样本，并获取丰富的数据信息。

细胞周期检测点的流式细胞术分析在多个领域具有广泛的应用价值。

在基础研究中，它可以帮助我们深入了解细胞周期的调控机制以及检测点在细胞周期中的作用在临床医学中，它可以用于诊断肿瘤、评估治疗效果以及预测疾病进展等在药物研发中，它可以作为筛选具有细胞周期特异性作用的药物的重要手段。

细胞周期检测点的流式细胞术分析是一种强大的生物学研究方法，它将为我们揭示细胞周期的奥秘提供有力的技术支持。

1. 细胞周期检测点的重要性细胞周期是生物体细胞生长、分裂和繁殖的基础过程，它确保了遗传信息的准确传递和细胞功能的正常维持。

在这个过程中，细胞周期检测点扮演着至关重要的角色。

检测点是细胞周期中的特定阶段，它们能够监测细胞内的各种条件和状态，确保只有在满足特定条件时，细胞才能继续其周期进程。

细胞周期检测点对于维护基因组稳定性至关重要。

在DNA复制和染色体分离的过程中，任何错误都可能导致基因突变或染色体异常，进而影响细胞的正常功能。

流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程
大家好，今天咱们来聊聊那个神奇的玩意儿——流式细胞术。

这个技术就像个魔法师，能帮我们用显微镜看细胞，还能测出它们的年龄和性格呢！
先说说这流式细胞术的魔法棒——荧光染料。

想象一下，这些染料就像是给细胞穿上了五彩斑斓的外衣。

有的像彩虹一样亮，有的像夜空中的星星，还有的像森林里的小精灵。

这些染料一碰到细胞，细胞就变身成为各种颜色，就像变魔术一样！
接下来是那把神奇的尺子——激光。

它就像一位严谨的老师，用光来量度细胞的大小。

当激光照到细胞上，就像老师拿着尺子在黑板上画线，一下子就知道细胞有多长、多宽、多高。

再来说说那些聪明的小助手——计算机。

它们就像一群聪明的小侦探，用数据来分析这些“彩色的小精灵”。

通过计算，它们就能告诉我们细胞是“年轻态”还是“老态龙钟”，甚至还能分辨出哪些细胞正在加班加点工作，哪些已经休息去了。

别忘了我们的“观众”——电子显示屏。

它就像是一场精彩的演出，把所有的信息都展示出来。

你可以看到细胞们穿着各种颜色的裙子，跳着不同的舞蹈，有的还戴着花冠，真是美极了！
现在，让我们来做个小游戏吧！想象一下，如果细胞们都穿上了漂亮的衣服，跳起了优雅的舞蹈，你会看到什么？是不是觉得这个技术太神奇了，就像打开了一个新世界的大门？
今天的分享就到这里啦！希望你们也能像探索新大陆一样，去发现更多关于流式细胞术的秘密。

记得哦，科学的世界总是充满了惊喜，等着你去探索！。

流式细胞仪检测细胞周期9、采用流式细胞仪（FCM）研究MG63细胞周期FCM检测细胞周期原理流式细胞仪(flow cytometry或flow cytomyter，FCM)又称荧光活化细胞分拣器(fluorescence activated cell sorter，FACS)是20世纪60年代后期利用激光器和层流流动室而建立的一种用于测定放射性染色体的新技术。

细胞周期(cell cycle)是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程，包含G1期、S期、G2期、M期四个阶段(图1)。

细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂, 结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。

通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。

在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。

用FCM 进行细胞周期分析是通过测定细胞中DNA量而完成的。

测定DNA含量后，可用FCM配备的细胞周期分析软件(例如Becton Dickinson公司的Cell FIT)对其进行自动分析。

此测定的细胞周期按照DNA的量分可为Go/G1期、S期及G2/M期。

FCM检测细胞周期流程①培养MG63细胞在6 孔板内依次放入对照组和3 个实验组钛片各40 片，接种密度为 4 × 105/ ml。

培养至细胞汇合后，每孔加矿化液2． 5 ml( 含10 nmol/L 地塞米松，10 mmol/L β －甘油磷酸钠，50 μg/ml 抗坏血酸的培养液) 。

分别培养3、5、10、15d 后，每组各取出5 个钛片移至新的6 孔板内，将钛片表面细胞消化离心收集。

② PBS清洗经消化收集的细胞2～3次，调整细胞密度为1×106个/ml;③将细胞悬液100ul转移至试管中;④ 加入FITC标记的annexin V和PI溶液，轻轻混匀;⑤室温避光放置10～15min;⑥ 加入400ul缓冲液，将全部液体转移至FCM分析用试管;⑦ 尽快进行FCM分析（用FCM进行细胞周期分析是通过测定细胞中DNA量而完成的。

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流式细胞术检测细胞周期
1. 纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；
2. 横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期
3. G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；
4. 右侧数字含义：Mean G1=19
5.4即G1期DNA含量平均值为
195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；
1 G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
2 G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时
间；④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。

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3、流式细胞结果图各参数的意义：
前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：
G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。

流式细胞仪检测细胞周期操纵步调之五兆芳芳创作取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比方加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓参加1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下参加3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保管.↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，参加200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP 管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标识表记标帜EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、阐发系统；⑤细胞分选系统.↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后拔出流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激起产生荧光（488nm激起光源）↓荧光信号酿成电信号输出到计较机，软件阐发（荧光染料和细胞DNA份子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件阐发之前，将流式结果按如下所示导出结果阐发——Modfit软件阐发图片拷贝：直接Ctrl+C ——Flowjo软件阐发FCM-DNA 量阐发 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量散布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M.G0/1和G2M 细胞峰的 DNA 散布均为正态散布，S 期可以认为是一个加宽的正态散布↓检测结果刻录光盘保管↓关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗）正常细胞DNA含量：2n-4n凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DNA含量削减.PI染色后，荧光强度减小而形成一个DNA含量小于2n的散布区（亚G1峰）.1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字寄义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA 含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡基来源根底理：磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素Ⅴ（AnnexinⅤ）产生特异结合；PI是核酸荧光染料，不克不及透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放白色荧光，荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系.正常细胞：膜完整，PS不过翻——PI-/AnnexinⅤ-凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+坏死细胞：膜严重破损，PS不过翻——PI+/AnnexinⅤ+几近不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-实验步调：取对数生长期的细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比方参加药物）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓细胞用0.25%胰酶37℃消化5min(胰酶消化时间不容易太长，以防引起假阳性）↓参加PBS制成细胞悬液（移液枪吹打6-8次）↓倒置显微镜下不雅察细胞状态（单个别离悬浮）↓将细胞悬液移入15ml离心管中↓2000rpm离心5min,PBS吸除↓用PBS 清洗细胞2次（2000rpm，离心5min收集细胞）↓用400ul 1×Binding Buffer 悬浮细胞(浓度大约为1×106cells/ml)↓在细胞悬液中参加5ul Annexin V-EGFP，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15 min↓参加10ul PI 后轻轻混匀,于2-8℃避光条件下孵育5 min↓在1 h内用流式细胞仪检测流式细胞仪激起光波长采取Ex.= 488nm双波长激起，Em.= 510 nm检测EGFP荧光(FL1 channel)和>575 nm的发射波长检测PI.细胞应可分红三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包含极晚期凋亡细胞）有绿色和白色荧光双重染色.在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V +/PI-.。