蛋白磷酸酶抑制剂复合物I (100×)使用说明书

蛋白酶抑制剂引言蛋白酶抑制剂是一类用于抑制酶活性的化合物，其中蛋白酶是一种催化蛋白质水解的酶。

蛋白酶在生物体中起着重要的调控作用，参与多种生物反应的调节和控制。

然而，在某些情况下，蛋白酶的过度活化可能导致疾病的发生和发展。

因此，研发蛋白酶抑制剂成为一种重要的医药研究方向。

本文将介绍蛋白酶抑制剂的基本分类、作用机制以及在药物研发中的应用。

分类根据蛋白酶抑制剂对酶活性的抑制方式，蛋白酶抑制剂可分为两大类：1.反式抑制剂：反式抑制剂与酶结合后形成稳定的酶-抑制剂复合物，从而阻止酶催化反应的进行。

典型的例子是蛋白酶抑制剂Aprotinin，它通过与蛋白酶结合形成稳定的复合物，从而抑制蛋白酶的活性。

2.逆式抑制剂：逆式抑制剂通过与酶催化中心结合，改变酶的构象和活性。

这类抑制剂通常是模拟酶底物的分子结构，与酶催化中心发生特异性的相互作用。

逆式抑制剂的典型例子是酶的底物类似物，如硫氰酸酰胺（p-Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone，TPCK）可以选择性地抑制胰蛋白酶的活性。

作用机制蛋白酶抑制剂能够通过不同的机制来抑制蛋白酶的活性。

以下是几种常见的作用机制：1.受体拮抗作用：某些蛋白酶抑制剂能够与蛋白酶结合并阻断其与受体的相互作用，从而抑制了受体的活化。

这种机制在很多药物设计中都有重要的应用。

2.亲和力增强：一些蛋白酶抑制剂可以增强与酶的结合亲和力，从而阻止酶底物结合，进而抑制了酶的活性。

3.酶底物竞争：逆式抑制剂通过与酶催化中心竞争底物结合位点，从而阻断底物与酶的结合，进而抑制了酶活性的发生。

4.构象改变：某些蛋白酶抑制剂能够与酶发生特异性相互作用，改变酶的构象从而影响酶的活性。

应用蛋白酶抑制剂在医药领域有着广泛的应用。

以下是一些典型的应用示例：1.抗癌药物：蛋白酶在肿瘤细胞中起着重要的作用，因此蛋白酶抑制剂被广泛用于抗癌药物的研发。

例如，蛋白酶抑制剂Paclitaxel可以通过抑制肿瘤细胞内的蛋白酶活性来抑制细胞的增殖。

蛋白质提取‎过程中常用‎的蛋白酶和‎磷酸酶抑制‎剂详细使用‎说明转自:http://www.bioas‎/html/980.html在与蛋白相‎关的检测中‎，最关键的一‎步便是蛋白‎质的提取。

在提取的过‎程中，我们要经常‎加入以防止‎。

另外在磷酸化‎蛋白的研究‎过程中，也是必不可‎少的。

本文详细总‎结了常用的‎P MSF、 Leupe‎p tin亮‎肽素、Aprot‎i nin抑‎肽酶、Pepst‎a tin胃‎、EDTA-Na2等以及NaF‎氟化钠、Na3VO‎4原矾酸钠、Beta-glyce‎r opho‎s phat‎e甘油磷酸‎钠、Na2P2‎O4焦磷酸钠等的‎溶液配制、贮存液与工‎作液浓度及‎保存条件。

一、蛋白酶抑制‎剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白‎酶抑制剂，如胰凝乳蛋‎白酶、胰蛋白酶和‎凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋‎白酶如木瓜‎蛋白酶。

溶解性：溶于异丙醇‎、乙醇、甲醇和丙二‎醇里>10mg/ml。

在水溶液中不‎稳定。

在100%异丙醇，25℃时稳定至少‎9个月。

分子量：174.2使用：贮存浓度2‎00mM，工作浓度1‎m MLeupe‎p tin 亮肽素特性‎：抑制丝氨酸‎和半胱氨酸‎蛋白酶如胰‎蛋白酶、木瓜蛋白酶‎、纤溶酶和组‎织蛋白酶B‎。

溶解性：高度溶于水‎（1mg/ml）。

4℃一周稳定，分成小份，冷冻在 -20℃至少6个月‎。

分子量：C20H3‎8N6O4‎×1/2 H2SO4‎:475.6 C20H3‎8N6O4‎x 1/2 H2SO4‎× H2O:493.6使用：贮存浓度1‎m g/ml，工作浓度0‎.5 ug/ml (1mM)。

Aprot‎i nin抑‎肽酶特性：丝氨酸蛋白‎酶抑制剂，抑制纤维蛋‎白溶酶、激肽释放酶‎、胰蛋白酶、糜蛋白酶的‎高活性。

不抑制凝血‎酶或因子X‎。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。

蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明一、蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。

溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。

在水溶液中不稳定。

在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。

分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。

溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。

4℃一周稳定，分成小份，冷冻在-20℃至少6个月。

分子量：C20H38N6O4 ×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。

Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。

不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。

pH约7~8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。

避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

分子量：6,512使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。

Pepstatin胃蛋白酶抑制剂特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶、许多微生物酸性蛋白酶溶解性：溶于甲醇约1mg/ml；可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。

4℃稳定一周，分装储存于-20℃时可保存1个月。

分子量：685.9使用：贮存浓度1mg/ml，使用浓度0.7 μg/ml(1 μM)。

EDTA-Na2特性：金属蛋白酶抑制剂溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的条件下，4℃稳定至少6个月分子量：372.24使用：工作浓度0.2~0.5 mg/ml(0.5~1.3 mM)，不需现用现配，在溶液pH值调至8~9时再加入。

免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。

目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。

实验步骤：1.处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。

一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)。

2.配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。

注意抑制剂的要现加现用。

3.收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。

4.超声：强度37％，5秒×4次（程序07）。

目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。

5.离心细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。

6.Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。

取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm×2分钟，吸掉上清备用。

7.细胞裂解液预清洗：为去除非特异作用，细胞裂解液先用Agrose-proteinA/G预清洗。

检验科免疫室分析项目作业指导书第页，共页版本：A/0生效日期：2008-02-01 36b)>95%健康成人范围的样本量c)没有疾病，不患肿瘤可能为颅脑损伤的成年患者表现为轻微颅脑外伤（格拉斯哥昏迷计分GCS：13-15分）和至少有一种症状的患者3小时内进行Elecsys S100测定。

外伤后6小时内必须进行CCT（头颅计算机X线断层摄影术）检查。

以健康个体的95%值作为分界点，CCT作为参照，用Elecsys S100测定可获得如下结果：NPV（阴性预测值）99.7%，PPV（阳性预测值）11%，灵敏度98.8%，和特异度32.9%（95%可信区间：NPV99.1-100%，PPV8.8-13.3%,灵敏度96.5-100%，特异度30-35.9%）。

d)0.098μg/L每个实验室必须调查各自患者群体的参考范围变异性，必要时根据具体情况制订自己的参考范围。

9.分析性能分析仪的代表性试验数据如下。

各实验室由于具体情况不同，所得出的数据可能会稍有差异。

精密度根据NCCLS（全国临床实验室规范化操作委员会）制订的改良试验计划(EP5-A)，应用Elecsys试剂盒、人血液标本和质控液验证ElecsysS100试剂盒检测重复性。

每日测6 次共10 日（n＝60）；在E170 分析仪上的组间精密度（n＝21），得结果如下：分析灵敏度（低浓度检测限制）< 0.005 µg/L检验科免疫室分析项目作业指导书第页，共页版本：A/0生效日期：2008-02-01 46检测限制定义为可以区别零浓度定标液的最低可测浓度值，计算公式为定标液最小浓度＋2SD（标准差）（系统定标，定标液最小浓度＋2SD，组间精密度范围之内，标本数21）。

方法比较将Elecsys S100 现在的试剂盒Elecsys S100（产品目录号03051986（y））与Liamat Sangtec100 (x1)和 Liaison Sangtec100 (x2)进行比较，得到以下线性关系(pmol/L)。

北京索莱宝科技有限公司蛋白酶抑制剂混合物(哺乳动物样品抽提用,100X)货号：P6731规格：100T保存：-20ºC保存，有效期12个月；4ºC保存，2个月有效；室温保存2周有效。

产品组成：产品名称规格保存蛋白酶抑制剂混合物(哺乳动物样品抽提用,100X)1mL-20ºC避光0.5M EDTA,pH8.01mL RT产品说明：哺乳动物细胞或组织提取物中含有许多内源性的蛋白酶、磷酸酶等，容易导致提取物中的蛋白降解或去修饰，从而影响后续的蛋白检测。

因此在提取物中添加适当的蛋白酶、磷酸酶等抑制剂是防止蛋白降解和去修饰的有效方法。

本产品用于哺乳动物细胞或组织蛋白提取的蛋白酶抑制剂混合物，包含了广谱的丝氨酸、半胱氨酸和酸性蛋白酶抑制剂、以及氨基肽酶抑制剂。

如用于检测金属蛋白酶活性，则不宜添加EDTA。

以1:100的比例分别把蛋白酶抑制剂混合物(哺乳动物样品抽提用,100X)和0.5M EDTA加入裂解液中，即可用于哺乳动物细胞或组织蛋白的提取，并有效抑制蛋白降解。

适用范围：抑制哺乳动物细胞或组织提取物中的各种蛋白酶活性，如丝氨酸蛋白酶、氨基肽酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸和天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等。

适用于Western Blot和免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、蛋白激酶活性测定等。

使用方法：1、蛋白酶抑制剂混合物（100X），使用时分别按照1:100的比例加入到裂解液中，混匀后即可使用。

含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存待后续使用。

2、根据需要，0.5M的EDTA也按照1:100的比例加入到裂解液中。

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Human S100 Calcium-Binding Protein A8/A9 Complex (S100A8/A9) ELISA KitCatalog Number. CSB-E12149hFor the quantitative determination of human S100calcium-binding protein A8/A9complex(S100A8/A9)concentrations in serum,plasma, tissue homogenates.This package insert must be read in its entirety before using this product.In order to obtain higher efficiency service, please ready to supply the lot number of the kit to us (found on the outside of the box).PRINCIPLE OF THE ASSAYThis assay employs the quantitative sandwich enzyme immunoassay technique. Antibody specific for S100A8/A9has been pre-coated onto a microplate. Standards and samples are pipetted into the wells and any S100A8/A9 present is bound by the immobilized antibody. After removing any unbound substances, a biotin-conjugated antibody specific for S100A8/A9 is added to the wells. After washing,avidin conjugated Horseradish Peroxidase(HRP) is added to the wells.Following a wash to remove any unbound avidin-enzyme reagent,a substrate solution is added to the wells and color develops in proportion to the amount of S100A8/A9bound in the initial step.The color development is stopped and the intensity of the color is measured.D ETECTION RANGE1.56 ng/ml-100 ng/ml.SENSITIVITYThe minimum detectable dose of human S100A8/A9 is typically less than 0.39 ng/ml.The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection (LLD) was defined as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero. It was determined the mean O.D value of 20 replicates of the zero standard added bytheir three standard deviations.SPECIFICITYThis assay has high sensitivity and excellent specificity for detection of human S100A8/A9.No significant cross-reactivity or interference between human S100A8/A9 and analogues was observed.Note: Limited by current skills and knowledge, it is impossible for us to complete the cross-reactivity detection between human S100A8/A9 and all the analogues, therefore, cross reaction may still exist.PRECISIONIntra-assay Precision (Precision within an assay): CV%<8%Three samples of known concentration were tested twenty times on one plate to assess.Inter-assay Precision (Precision between assays):CV%<10%Three samples of known concentration were tested in twenty assays to assess.LIMITATIONS OF THE PROCEDUREFOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.If samples generate values higher than the highest standard, dilute the samples with Sample Diluent and repeat the assay.Any variation in Sample Diluent, operator, pipetting technique, washing technique, incubation time or temperature,and kit age can cause variation in binding.This assay is designed to eliminate interference by soluble receptors, binding proteins, and other factors present in biological samples. Until all factors have been tested in the Immunoassay,the possibility of interference cannot be excluded.MATERIALS PROVIDEDSTORAGE*Provided this is within the expiration date of the kit.OTHER SUPPLIES REQUIREDMicroplate reader capable of measuring absorbance at 450 nm, with the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.An incubator which can provide stable incubation conditions up to 37°C±0.5°C.Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.Absorbent paper for blotting the microtiter plate.100ml and 500ml graduated cylinders.Deionized or distilled water.Pipettes and pipette tips.Test tubes for dilution.PRECAUTIONSThe Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear eye, hand, face, and clothing protection when using this material.SAMPLE COLLECTION AND STORAGESerum Use a serum separator tube (SST) and allow samples to clot for two hours at room temperature or overnight at 4°C before centrifugation for 15 minutes at 1000 ×g. Remove serum and assay immediately or aliquot and store samples at -20°C or -80°C. Avoid repeated freeze-thaw cycles.Plasma Collect plasma using EDTA, or heparin as an anticoagulant.Centrifuge for 15minutes at1000x g,2 - 8°C within30minutes of collection. Assay immediately or aliquot and store samples at -20°C or -80°C. Avoid repeated freeze-thaw cycles. Centrifuge the sample again after thawing before the assay.Tissue Homogenates100mg tissue was rinsed with1X PBS, homogenized in 1 ml of 1X PBS and stored overnight at -20°C. After two freeze-thaw cycles were performed to break the cell membranes,the homogenates were centrifuged for 5 minutes at 5000 x g, 2 - 8°C. The supernate was removed and assayed immediately. Alternatively, aliquot and store samples at -20°C or -80°C. Centrifuge the sample again after thawing before the assay. Avoid repeated freeze-thaw cycles.Note:1.CUSABIO is only responsible for the kit itself, but not for the samplesconsumed during the assay.The user should calculate the possible amount of the samples used in the whole test. Please reserve sufficient samples in advance.2.Samples to be used within 5 days may be stored at 2-8°C, otherwisesamples must be stored at -20°C (≤1month) or -80°C (≤2month) to avoid loss of bioactivity and contamination.3.Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.4.If the samples are not indicated in the manual, a preliminary experimentto determine the validity of the kit is necessary.5.Please predict the concentration before assaying. If values for these arenot within the range of the standard curve, users must determine the optimal sample dilutions for their particular experiments.6.Tissue or cell extraction samples prepared by chemical lysis buffer maycause unexpected ELISA results due to the impacts of certain chemicals.7.Owing to the possibility of mismatching between antigen from otherresource and antibody used in our kits(e.g.,antibody targets conformational epitope rather than linear epitope),some native or recombinant proteins from other manufacturers may not be recognized by our products.8.Influenced by the factors including cell viability, cell number and alsosampling time, samples from cell culture supernatant may not be detected by the kit.9.Fresh samples without long time storage are recommended for the test.Otherwise, protein degradation and denaturalization may occur in those samples and finally lead to wrong results.REAGENT PREPARATIONNote:Kindly use graduated containers to prepare the reagent. Please don't prepare the reagent directly in the Diluent vials provided in the kit.Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use for 30min.Prepare fresh standard for each assay. Use within 4 hours and discard after use.Making serial dilution in the wells directly is not permitted.Please carefully reconstitute Standards according to the instruction, and avoid foaming and mix gently until the crystals have completely dissolved.To minimize imprecision caused by pipetting,use small volumes and ensure that pipettors are calibrated. It is recommended to suck more than 10μl for once pipetting.Distilled water is recommended to be used to make the preparation for reagents. Contaminated water or container for reagent preparation will influence the detection result.1.Biotin-antibody (1x) - Centrifuge the vial before opening.Biotin-antibody requires a 100-fold dilution. A suggested 100-fold dilution is 10 μl of Biotin-antibody + 990 μl of Biotin-antibody Diluent.2.HRP-avidin (1x) - Centrifuge the vial before opening.HRP-avidin requires a 100-fold dilution. A suggested 100-fold dilution is 10μl of HRP-avidin + 990 μl of HRP-avidin Diluent.3.Wash Buffer (1x) - If crystals have formed in the concentrate, warm up toroom temperature and mix gently until the crystals have completely dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate (25 x) into deionized or distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer (1 x).4.StandardCentrifuge the standard vial at 6000-10000rpm for 30s.Reconstitute the Standard with 1.0ml of Sample Diluent.Do not substitute other diluents. This reconstitution produces a stock solution of 100 ng/ml. Mix the standard to ensure complete reconstitution and allow the standard to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to making dilutions.Pipette 250 μl of Sample Diluent into each tube (S0-S6). Use the stock solution to produce a2-fold dilution series(below).Mix each tube thoroughly before the next transfer. The undiluted Standard serves as the high standard (100 ng/ml). Sample Diluent serves as the zero standard (0 ng/ml).ASSAY PROCEDUREBring all reagents and samples to room temperature before use. Centrifuge the sample again after thawing before the assay.It is recommended that all samples and standards be assayed in duplicate.1.Prepare all reagents, working standards, and samples as directed in theprevious sections.2.Refer to the Assay Layout Sheet to determine the number of wells to beused and put any remaining wells and the desiccant back into the pouch and seal the ziploc, store unused wells at 4°C.3.Add 100μl of standard and sample per well. Cover with the adhesive stripprovided.Incubate for2hours at37°C. A plate layout is provided to record standards and samples assayed.4.Remove the liquid of each well, don’t wash.5.Add100μl of Biotin-antibody(1x)to each well.Cover with a newadhesive strip. Incubate for 1 hour at 37°C. (Biotin-antibody(1x)may appear cloudy. Warm up to room temperature and mix gently until solution appears uniform.)6.Aspirate each well and wash, repeating the process two times for a totalof three washes. Wash by filling each well with Wash Buffer (200μl) usinga squirt bottle, multi-channel pipette, manifold dispenser, or autowasher,and let it stand for 2 minutes, complete removal of liquid at each step is essential to good performance. After the last wash, remove any remaining wash Buffer by aspirating or decanting. Invert the plate and blot it against clean paper towels.7.Add 100μl of HRP-avidin(1x) to each well. Cover the microtiter plate witha new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37°C.8.Repeat the aspiration/wash process for five times as in step 6.9.Add 90μl of TMB Substrate to each well. Incubate for 15-30 minutes at37°C. Protect from light.10.Add 50μl of Stop Solution to each well, gently tap the plate to ensurethorough mixing.11.Determine the optical density of each well within5minutes,using amicroplate reader set to 450 nm. If wavelength correction is available, set to 540 nm or 570 nm. Subtract readings at 540 nm or 570 nm from the readings at 450 nm. This subtraction will correct for optical imperfections in the plate. Readings made directly at 450 nm without correction may be higher and less accurate.Note:1.The final experimental results will be closely related to validity of theproducts,operation skills of the end users and the experimental environments.2.Samples or reagents addition: Please use the freshly prepared Standard.Please carefully add samples to wells and mix gently to avoid foaming.Do not touch the well wall as possible. For each step in the procedure, total dispensing time for addition of reagents or samples to the assay plate should not exceed 10 minutes. This will ensure equal elapsed time for each pipetting step, without interruption. Duplication of all standards and specimens, although not required, is recommended. To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of each standard level, between sample additions, and between reagent additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.3.Incubation: To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealersduring incubation steps is necessary. Do not allow wells to sit uncovered for extended periods between incubation steps.Once reagents have been added to the well strips, DO NOT let the strips DRY at any time during the assay. Incubation time and temperature must be observed.4.Washing: The wash procedure is critical. Complete removal of liquid ateach step is essential to good performance. After the last wash, remove any remaining Wash Solution by aspirating or decanting and remove any drop of water and fingerprint on the bottom of the plate.Insufficient washing will result in poor precision and falsely elevated absorbance reading. When using an automated plate washer, adding a 30 second soak period following the addition of wash buffer, and/or rotating the plate180 degrees between wash steps may improve assay precision.5.Controlling of reaction time: Observe the change of color after addingTMB Substrate (e.g. observation once every 10 minutes), TMB Substrate should change from colorless or light blue to gradations of blue. If the color is too deep,add Stop Solution in advance to avoid excessively strong reaction which will result in inaccurate absorbance reading.6.TMB Substrate is easily contaminated.TMB Substrate should remaincolorless or light blue until added to the plate. Please protect it from light.7.Stop Solution should be added to the plate in the same order as the TMBSubstrate. The color developed in the wells will turn from blue to yellow upon addition of the Stop Solution. Wells that are green in color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the TMB Substrate.ASSAY PROCEDURE SUMMARY*Please determine whether the sample needs to be diluted or the optimal dilution factor based on preliminary experiment result.CALCULATION OF RESULTSUsing the professional soft "Curve Expert" to make a standard curve is recommended, which can be downloaded from our web.Average the duplicate readings for each standard and sample and subtract the average zero standard optical density.Create a standard curve by reducing the data using computer software capable of generating a four parameter logistic(4-PL)curve-fit.As an alternative, construct a standard curve by plotting the mean absorbance for each standard on the x-axis against the concentration on the y-axis and draw a best fit curve through the points on the graph. The data may be linearized by plotting the log of the S100A8/A9 concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be determined by regression analysis.This procedure will produce an adequate but less precise fit of the data.If samples have been diluted, the concentration read from the standard curve must be multiplied by the dilution factor.人S100钙结合蛋白A8/A9复合物(S100A8/A9)酶联免疫试剂盒使用说明书【产品编号】CSB-E12149h【预期应用】ELISA法定量测定人血清、血浆、组织裂解液中S100A8/A9含量。

Anti-V5 Affinity Gel (Anti-V5亲和凝胶)产品编号 产品名称包装 P2289-0.5ml Anti-V5 Affinity Gel (Anti-V5亲和凝胶) 0.5ml P2289-2ml Anti-V5 Affinity Gel (Anti-V5亲和凝胶) 2ml P2289-10mlAnti-V5 Affinity Gel (Anti-V5亲和凝胶)10ml产品简介：碧云天生产的Anti-V5 Affinity Gel (Anti-V5亲和凝胶)，也称Anti-V5 IP Gel 、Anti-V5免疫沉淀凝胶或Anti-V5琼脂糖凝胶，由高质量的单克隆鼠源V5抗体与琼脂糖共价偶联而成，可与常规蛋白表达系统(如哺乳动物细胞、细菌或酵母)中含有V5标签的蛋白结合，从而用于带有V5标签的融合蛋白或蛋白复合物的免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或纯化。

V5标签(V5-tag)、Flag 标签(Flag-tag)、Myc 标签(Myc-tag)、HA 标签(HA-tag)、His 标签(His-tag)和GST 标签(GST-tag)等是表达载体上最常见的一些标签，通过与这些标签的融合表达可以非常方便地检测目的蛋白及与目的蛋白相互结合的蛋白，也可以非常方便地用于目的蛋白的纯化。

V5-tag 是从猴副流感病毒V5中分离得到的由14个氨基酸(GKPIPNPLLGLDST)组成的多肽，通过基因重组技术把V5-tag 的核酸序列与目的基因的5'端或3'端连接，就可以最终表达形成V5-tag 的目的蛋白。

V5-tag 具有以下优点：V5-tag 通常不会与目的蛋白相互作用，并且大多数情况下不会影响目的蛋白的功能；V5-tag 作为蛋白标签，后续通过V5抗体(AF2894)、Anti-V5磁珠(P2141)或Anti-V5亲和凝胶(P2289)即可对目的基因的表达、定位及功能进行检测或对目的蛋白进行纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等。

免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP），是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。

服务说明1.细胞培养（贴壁细胞：100mm细胞培养皿中单层细胞长满80％-90％或者细胞培养瓶中细胞达到2-5×107个，悬浮细胞：离心收集细胞，细胞达到2-5×107个）；2.加1ml（800uL）冰冷的 IP细胞裂解液到细胞培养皿中【IP裂解液中加入蛋白酶抑制剂（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂（1:100），注意抑制剂要现加现用】4℃裂解细胞10min，再用移液器反复吹打贴壁细胞，然后将细胞悬浮液转移到15ml离心管中；3.用1ml(400uL)冰冷的IP细胞裂解液【IP裂解液中加入蛋白酶抑制剂（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂（1:100），注意抑制剂要现加现用】洗涤细胞培养皿，将残留裂解细胞转入15ml离心管中；4.10000g、4℃离心细胞裂解悬浮液10min，将上清转入新的15ml离心管中，冰上操作，然后测定蛋白浓度（取少量细胞裂解液变性后用于WB检测目的蛋白）；选做：A.向细胞裂解液上清中加入1.0μg IgG（与IP及COIP实验一抗种属来源相同的普通IgG）和20μL A/G-珠子（使用前充分混匀），4℃摇转孵育30min；B.1000g 4℃离心细胞裂解液5min，将上清转入一个新的15ml离心管中，冰上操作，然后测定蛋白浓度（取少量细胞裂解液上清变性后用于WB检测目的蛋白）；选做步骤用于除去非特异性结合。

5. 取以上细胞裂解液上清1ml（或者100-500μg细胞总蛋白）到1.5ml离心管中，加入1-10μL（0.2-2μg）一抗（同时加相同量的与一抗种属来源相同的普通IgG作为阴性对照），然后4℃孵育1h；（一般加入1.0μg一抗，具体一抗加入量根据IP级抗体使用说明书进行稀释）6. 再加入20μL A/G-珠子（使用前充分混匀），用手指轻轻弹匀，4℃摇转孵育过夜；7. 4℃ 1000g离心5min，小心吸去上清，注意不要吸到底部的珠子，收集免疫沉淀复合物；8. 将免疫沉淀复合物用1ml冰冷的IP裂解液（不用加各种抑制剂）洗涤4次，每次4℃ 1000g离心5min，每次洗涤小心弃去上清；9. 最后一次洗涤之后，小心弃去上清后，加入40μL 1×SDS含巯基乙醇的上样缓冲液，沸水煮10min（除去Agrose-proteinA/G同时将一抗变成重链分子55KD和轻链分子25KD）后4℃1000g离心5min取上清；10. 取20μL上清样品用于WB检测（选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB 实验，可以大大减弱抗体分子的重链和轻链分子的WB信号。

碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线: 400-1683301或800-8283301订货e-mail:******************技术咨询: *****************网址: 碧云天网站 微信公众号植物RIPA裂解液(强)产品编号产品名称包装P0045-100ml 植物RIPA裂解液(强) 100ml产品简介：碧云天生产的植物RIPA裂解液(Plant RIPA Lysis Buffer)是一种传统的植物细胞、组织或原生质体快速裂解液。

植物RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的PAGE、Western、免疫沉淀(immunol precipitation，IP)、免疫共沉淀(co-IP)和ELISA 等。

本产品可以用于植物细胞、组织或原生质体样品，也可以用于动物的细胞或组织样品、真菌或细菌样品。

RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。

关于不同的RIPA裂解液以及碧云天生产的其它裂解液的主要特点和差异，以及如何选择裂解液可参考我们的相关网页：/support/lysis-buffer.htm。

植物RIPA裂解液(强)的主要有效成分包括1% Triton X-100、1% sodium deoxycholate和0.1% SDS等去垢剂，以及sodium orthovanadate、sodium fluoride、EDTA和leupeptin等多种抑制剂。

可以有效抑制蛋白降解。

用植物RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/ P0012S)测定蛋白浓度。

由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

包装清单：产品编号产品名称包装P0045-100ml 植物RIPA裂解液(强) 100ml—说明书1份保存条件：-20ºC保存，一年有效。

蛋白酶抑制剂PMSF配制
PMSF即Phenylmethanesulfonyl fluoride，中文名为苯甲基磺酰氟。

分子式为C7H7FO2S，分子量为174.19，纯度>99%。

:
1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；
2） 10mg/ml溶于异丙醇（或无水乙醇）中；
3）在室温可保存一年；
4）工作浓度：17~174ug/ml（0.1~）；
5）在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。

（见水分解，使用前加入）
(来自：汪家政蛋白质技术手册)
例:100mM PMSF
称量0.174g PMSF(针状结晶固体)溶于10ml 异丙醇,震荡混匀，保存在-20度或４度.
工作浓度我一般用1mM ,1:100(V/V)加入即可.样品处理超过1h,补加一次.
(PMSF剧毒,为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作．PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。

一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。

）
PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。

pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程（转）------一原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer 洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。