第四章++基因在大肠杆菌和酵母的高效表达

大肠杆菌表达外源基因的优势
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 基因克隆及表达系统成熟完善 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
MCS lacZ
T7启动子 pET28a 结构
三、 蛋白质的融合表达
蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的 编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行 表达。
在这种融合蛋白结构中，通常载体的担体蛋白部分位于 N端，目的蛋白位于C端。
通过人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性 断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回 收目的蛋白。
糖苷（IPTG）
O 诱导
高效转录
PO
启动子的可控性
启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
cAMP
CAP
高效转录
基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
Plac 葡萄糖代谢
O cAMP浓度降低
基底水平转录
Plac
O
高效转录
Plac UV5 O
2. 核糖体结合位点
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构： ①位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列：5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它与大 肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合； ②翻译起始密码子AUG； ③ SD序列与翻译起始密码子之间的距离(7bp)及碱基 组成； ④基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
第四章 基因在大肠杆菌、 酵母中的高效表达
湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲
本章目录
4.1 基因的表达系统与表达策略 4.1.1 基因的表达系统 4.1.2 根据表达蛋白用途选择基因的表达策略
4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达 4.2.1 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 4.2.2 蛋白质的融合表达 4.2.3 蛋白质的分泌型表达 4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性
大肠杆菌高效表达设计 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 蛋白质的融合表达 蛋白质的分泌型表达 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性
一、外源基因在大肠杆菌中高效表达的设计
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子的构建
1.启动子
启动子
-35 区序列
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
精确的糖基化 胞外表达 人本身的细胞系，
人的表达系统
二、基因的高效表达策略
用于生物化学和分子生物学研究： 重点考虑如何保持 蛋白质原有的功能
表达蛋白用作抗原：合成天然蛋白及表达融合蛋白的策 略,考虑如何便于分离
用于蛋白质结构研究：形成可溶性蛋白质，保持结构 完整
第二节 基因在大肠杆菌中的高效表达
4.3 基因在酵母中的高效表达 4.3.1 酵母表达系统概述 4.3.2 甲醇酵母表达系统 4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达
第一节 基因的表达系统与表达策略
基因的表达系统 基因的高效表达策略
一、基因的表达系统
表达载体的组成：
DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 及Amp, Tet抗 性基因
TTGACA TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
-10 区序列
GATACT TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
启动子的可控性
启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
阻遏蛋白 基底水平转录
P 乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳
二、 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌 表达系统
优点： 1）T7噬菌体RNA聚合酶合成RNA的速度高于大肠杆菌5倍；
2）T7噬菌体RNA聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠 杆菌DNA任何序列的转录；
3）T7噬菌体RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素有 抗性；
4）T7噬菌体RNA聚合酶/启动子系统在一定条件下，基因表达 产物可占细胞总蛋白的25％以上。
谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫亲和层析 pRIT2T 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象 pTrxFus b-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析 泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象
谷胱甘肽S－转移 酶（GST）融合蛋 白表达系统
pGEX载体
酶促裂解法：多残基位点
启动子 担体基因 接头 目的基因
Met
Arg
Stop
Ile-Glu-gly-Arg
凝血因子Xa的识别、作用序列
表达
Ile-Glu-gly-Arg
亲和层析 酶解回收
融合型目的蛋白表达系统的构建
用于融合蛋白构建的担体蛋白：
载体与受体系统
载体：pET表达系统（pET15，pET16，pET28，pET30，pET42 等a/b/c三套，及pRSET）
大肠杆菌菌株：BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。(DE3)菌株基 因组上以溶原形式携带一个克隆的T7RNA聚合酶基因，IPTG （异丙基硫代β－D－半乳糖苷）可诱导T7RNA聚合酶大量合 成。
二）真核表达系统
酵母表达系统
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的
哺乳动物细胞系
可以悬浮培养, 生 长快, 连续传代
目的基因转录的调控系统:这一系统包括启动子,抑制物基因和 转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.
蛋白质的翻译系统:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和 终止密码子.
表达系统的种类
原核表达系统 真核表达系统
酵母 植物拟南芥 昆虫 哺乳动Leabharlann Baidu细胞系
一） 原核表达系统：细菌