木聚糖酶在大肠杆菌中的表达

嗜热内切木聚糖酶基因xyn10B 克隆及其在大肠杆菌中的表达 食品科学093 谢江英 2009016513 自 Horflcoshi 于 1973 年首次报道了来自细菌中的木聚糖酶以来，国外科研工作者已分离出百余种不同微生物来源的木聚糖酶，并将其基因在各种宿主菌中得到活性表达。由于高产野生的微生物生产木聚糖酶时，释放出的产物较为复杂，往往产生大量的纤维素酶，导致在应用中产生不必要的麻烦。如在纸浆预漂白时，纤维素会被意外降解。并且这些酶的性质极为相近，分离纯化的成本较高，不利于木聚糖酶的推广使用，通过基因工程的方法来构建一些高效表达或胞外分泌的工程菌株，将有助于解决木聚糖酶的大量收集和纯化问题。我国对木聚糖酶的研究最近十几年才开始，大多限于天然木聚糖酶高产菌株的筛选，木聚糖酶的分离、纯化及性质分析，仅克隆和表达了少数木聚糖酶基因，而运用基因工程手段产业化生产木聚糖酶制剂在国内还刚刚起步。本研究从Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 分离出木聚糖酶基因 xyn10B，连接于表达载体 pET-28a（+）的 NcoⅠ和 XhoⅠ酶切位点之间，构建重组表达质粒pET28a-xyn10B，转化大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）codon plus-RIL，构建基因工程菌，实现木聚糖酶高效表达。 1 实验材料 1.1 菌株和质粒 （1）热解纤维素菌Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725； （2）质粒 pET-28a； （3）大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）codonplus-RIL； 1.2 实验材料及主要试剂 1.2.1抗生素 氨苄青霉素，卡那霉素 1.2.2 试剂 胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖；PCR引物合成；DNA测序；不同来源底物； 其他常用化学试剂。 1.2.3 工具酶 限制性内切酶Nco I、Xho I、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000 DNA Marker和λ-HindⅢ digest DNA Marker）。 1.2.4 试剂盒 PCR产物回收试剂盒，质粒小提试剂盒，细菌基因组提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒， Ni-柱纯化柱料。 2.培养基及主要试剂配制 （1）TAE buffer：核酸电泳缓冲液 Tris-乙酸 0.04 mol/L EDTA 0.001 mol/L （2）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液： Tris碱 15.1 g 甘氨酸 94 g SDS 5 g 去离子水补齐至1000ml。 （3）考马斯亮蓝染色液配方 甲醇/水（1 :1，v/v） 90 ml 冰醋酸 10 ml 考马斯亮蓝R250 0.25 g 应用What man1号滤纸过滤，除去杂质，室温；备用。 （4）考马斯亮蓝脱色液 乙醇 100mL 乙酸 50mL 蒸馏水定容至1L。 （5）8×bindingbuffer（连接缓冲液） NaCl 4 M Tris-HCl（pH 7.9） 160 mM （6）8×charge buffer NiSO4 800 mM （7）8×washbuffer（洗涤缓冲液） 咪唑 800 mM NaCl 4 M Tris-HCl（pH 7.9） 160 mM （8）4×strip buffer EDTA 400 mM NaCl 2 M Tris-HCl（pH 7.9） 80 mM （9）蛋白质 SDS-PAGE 凝胶的配制 溶液成分 分离胶 12%（5mL） 浓缩胶 5%（2mL） H2O 1.6 1.4 30%丙烯酰胺溶液 2.0 0.33 1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8） 1.3 --- 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8） --- 0.25 10%SDS 0.05 0.02 10%过硫酸铵 0.05 0.02 TEMED 0.005 0.002 （10）宽范围缓冲液 乙酸 100mM N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPS） 100mM N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸（TAPS） 100mM 3-环已胺基丙磺酸（CAPS） 100mM 2-码啉乙磺酸（MES） 100mM 分别在60℃，70℃下精确配制100mM不同pH的缓冲液，使用1M NaOH调节 至所需的pH值。 3.实验仪器 振荡培养箱、无菌操作台、0.22μm无菌滤器、冷冻高速离心机、2550 紫外分光光度计、Gene pulser Xcell、实验室水纯化系统、超滤管 Ultrafreet-MC 10kDa、垂直电泳仪、无油真空抽滤仪、AKTA prime plus 蛋白层析仪、聚合酶链式反应器

⑴.Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 的液体培养 按照 DSMZ 的配方，配置厌氧培养基，分装于厌氧试管中，每管 5ml，培养基封闭后用真空泵将试管中的空气抽干，并充入一定量的氮气和二氧化碳的混合气体（80%N2和 20%CO2）。在厌氧箱中用培养基1m溶解购买于 DSMZ的 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，按照 1%的接菌量接种于5ml 试管中，混匀，75℃静置培养数天，直至细菌开始生长起来。然后转移至装有100ml培养基的锥形瓶中 75℃培养数天，-80℃保存菌体备用。 ⑵.基因组 DNA 的提取 取5ml小试管培养的 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，用细菌基因组 DNA 小量提取试剂盒提取细菌的基因组，所得染色体 DNA 溶液放 4℃冰箱备用。 ⑶. Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 xyn10B 基因的序列分析

⑶.Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 xyn10B 基因的克隆 以嗜热细菌 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 xyn10B的基因组 DNA为模板 ，通过上游引物和下游引物进行嗜热木聚糖酶基因（xyn10B）的扩增。 上游引物：5’CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3’，划线部分为 NcoⅠ酶切位点； 下游引物：5’CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3’，划线部分为 XhoⅠ酶切位点； xyn10B 基因全长 1014bp，在 50 ul PCR 反应体系中，以基因组 DNA 第一链为模板，在无菌微量离心管中依次加入下述试剂（表 2-1）。

轻轻混匀后迅速离心，95℃预变性3 min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃，延伸 90s，进行32个循环，然后 72℃延伸 20min，4℃保存。PCR 完成后，取 2u1扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，ChampGel 1000 型凝胶成像系统中进行图像采集与分析。 通过 PCR 发现在退火温度梯度 50-60℃内都有产物，其中 55℃产物的浓度及纯度最好（图 2-3），电泳结果表明 PCR 产物与理论长度相符。PCR 产物使用 PCR 清洁试剂盒回收，双酶切后电泳鉴定并估计浓度，-20℃保存，备用。

⑷.载体制备及重组质粒的构建 使用 NcoⅠ和 XhoⅠ酶切质粒载体pET-28a，去磷酸化后使用 PCR 产物纯化试剂盒回收，电泳鉴定并估计浓度，-20℃保存，备用。 xyn10B 与 pET-28a 连接反应，将下列试剂加入标记的无菌微量离心管中（表 2-4）。加完试剂，轻轻混匀后迅速离心，16℃孵育 2 h；4℃水浴中过夜连接。

通过目的基因与载体的连接，构建重组表达质粒，构建的流程如图2-4 所示。

⑸.重组质粒转化大肠杆菌及阳性转化子的筛选 通过 PCR 方法鉴定随机挑取的 10 个重组子，将经过 PCR 鉴定的阳性重组子基因进行测序，经测序确认序列完全正确，证明 xyn10B 基因克隆成功。提取阳性质粒，转化到表达宿主大肠杆菌中，并表达目标蛋白。 ⑹.重组蛋白的诱导表达、鉴定以及纯化 以 pET-28a 为载体，大肠杆菌为宿主细胞菌进行优化表达。将重组菌按 1%接种量接种于 5ml 含 100μg/ml 卡那霉素的2YT 培养基，在 37℃下震荡培养过夜。然后按 1%的接种量转接 1000ml 2YT 培养基，37℃震荡培养至OD600达到 1.0 左右时，加入诱导剂 IPTG至终浓度 1mM，27℃诱导 18-24h后，在 5000rpm 离心 20min 收集菌体，菌体重悬于6倍体积 50mMTris-HCl（pH8.0）缓冲液中，超声破碎后离心得到可溶性的上清组分和沉淀组分。上清组分 56℃热处理 20 分钟后离心即得粗酶液；SDS-PAGE 结果显示（图2-5），在预测的 xyn10B 理论分子量（40.2kDa）处出现一条明显的蛋白条带，占总蛋白量约 50%，说明目的蛋白表达成功。 将粗酶液进行 Ni 柱纯化，由于粗酶本身的纯度就很高，尤其上清组分纯度能达到 80%以上，所以经过一步 Ni 柱处理后就能得到 95%以上纯度的目的蛋白（图 2-5），可以用于各种酶学性质表征等实验。 纯化过程中，在 pH7.2，温度 56℃条件下，以 Beechhood xylan 为底物测定不同处理后的酶活力以及相应的蛋白浓度，得到不同处理后的蛋白纯化表（如表2-5）。由图和表格知，经过热失活和亲和层析，几乎不含有任何杂蛋白，在SDS-PAGE 上呈现出清晰的单一条带，酶蛋白的纯化倍数为 2.47 倍，酶蛋白的回收率高达 79.2%，重组嗜热木聚糖酶 xyn10B 的蛋白分泌量高达 1370mg/ml。纯酶调整蛋白浓度为 10mg/ml 左右后，-20℃保存备用。

参考文献： [1]田东升.嗜热内切木聚糖酶的克隆、表达及其酶学性质的研究[D].上海交通大学生命科学技术学院,2012:18-30. [2]高海有,刘正初,段盛文,成莉凤.β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因在大肠杆菌中共表达[J]. 微生物学通报,2012,39(3):344-347. [3]莫毅.木聚糖酶产生菌的筛选鉴定及木聚糖酶基因(Xyn B)的克隆[J].中国饲料，2011（3）：20-23. [4]杨然,李秀婷.微生物木聚糖酶的研究进展[J].中国食品科学技术学会第七届年会论文摘要集:61-64.