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doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2017.06.021研究报告成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性陈雪梅a，薛斯亮b，吴思思a四川大学华西医院a.公共实验技术中心；b.皮肤性病科；四川成都610041［摘要］目的：建立一种周期短、成本低的成年小鼠原代皮肤成纤维细胞分离培养方法，并探索其生物学特性。
方法：取8~12周龄BALB/c小鼠背部、尾尖、耳部皮肤，配制2种血清的细胞培养液，采用组织块贴壁法、酶消化法、酶消化组织块贴壁法进行原代皮肤成纤维细胞的培养，通过显微镜观察比较原代细胞的数量、形态、培养周期及纯度；通过免疫荧光、CCK-8、UVB辐照、流式细胞术进行生物学特性鉴别。
结果：背部皮肤组织块贴壁使用Gibco胎牛血清培养7d无细胞游出，CLARK特级胎牛血清细胞游出较多。
背部皮肤经酶消化法得到细胞贴壁少；经组织块贴壁法细胞生长慢，培养周期长；酶消化组织块贴壁法细胞游出速度快、数量多、呈长梭形。
尾尖取材量少，得到细胞少；耳部皮肤取材方便，但细胞纯度低。
CCK8增殖曲线呈S型；相较于对照组，UVB辐照后细胞凋亡率增高17%。
结论：CLARK特级胎牛血清、背部皮肤取材、酶消化组织块贴壁法是培养成年小鼠原代皮肤成纤维细胞最优的方案，可增加细胞得量、缩短培养周期，降低成本。
［关键词］成年小鼠；原代皮肤成纤维细胞；酶消化法；组织块贴壁法［中图分类号］Q813.1［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2017）06-0823-05 Separation and Biological Characteristics of Primary Skin Fibroblasts from Adult Mice SkinCHEN Xue-Mei a,XUE Si-Liang b,WU Si-Si a*a.Core Facility;b.Dermatology＆STD;West China Hospital,Sichuan University,Chengdu610041,China*Corresponding author,E-mail:949189109@［Abstract］Objective:To establish time and cost saved method for culturing adult mice primary skin fibro⁃blasts,and to explore its biological characteristics by immunofluorescence assay.Methods:The back skin,tail tip skin and ear skin were striping from adult mice（8~12weeks）,we chose two different DMEM high glucose ex⁃tracts,three methods including tissue adherence method,enzyme digestion method and enzyme digestion tissue ad⁃herence method to culture adult mice primary skin fibroblasts.Evaluate those methods by microscopic observation through the cell numbers,the cell status,the length of culture cycle and cells'purity.The biological characteris⁃tics of the cells were identified by immunofluorescence,CCK-8and flow cytometry.Results:When using tissue adherent method to culture primary fibroblasts of adult mice's back skin,the Gibco fetal bovine serum（FBS）has little cell migrate out,the CLARK FBS has much more cell migration.The back skin was chosen to compare the different culture methods.When using enzyme digestion method,a very small amount cells were received and it has a terrible status,the tissue adherence method can provide more cells,but it took long time for the primary 收稿日期：2017-06-27基金项目：青年科学基金（81502747）作者简介：陈雪梅（1990-），女，学士，助理实验师，（E-mail）731078695@通信作者：吴思思，（E-mail）949189109@cell to migrate out.The method combining the enzyme digestion and tissue adherence can provide more cells and shorten the culture cycle.About the purity of cells,back skin was higher than that of the tail tip skin,the tail tip skin was higher than the ear skin.The proliferation curve of primary skin fibroblasts was presented a typical "S"pared with the control group,UVB irradiation increased the apoptosis rate by17%.Conclusion: The optimal method for primary skin fibroblasts culture is the Clark grade fetal bovine serum total extracts,adult mice back skin extraction,and enzyme digestion tissue adherence method.This combination can provide a large number of cells,shorten the culture cycle,reduce the cost.［Key words］adult mice;primary skin fibroblasts;enzyme digestion method;tissue adherence method皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，成纤维细胞是真皮层主要构成细胞，能促进表皮细胞迁移、增殖和分化，分泌大量胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，是皮肤组织受损或衰老后的主要修复细胞[1-2]。
临床医学研究与实践2020年12月第5卷第35期DOI :10.19347/ki.2096-1413.202035001基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.82000959）；陕西省自然科学基础研究计划（No.2019JQ -434）；陕西省卫生健康科研基金项目（No.2020JM -606）。
作者简介：常换换（1988-），女，汉族，陕西西安人，主治医师，硕士。
研究方向：耳鼻咽喉疾病的基础与临床。
*通讯作者：王洁，E -mail :wangjie0112@.Primary culture and identification of mouse nasal mucosal epithelial cellsCHANG Huanhuan 1,CUI Mu 2,WANG Jie 1*(1.Otolaryngology Department,Children's Hospital Affiliated to Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710003;2.School ofNursing,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,China)ABSTRACT:Objective To explore the experimental steps and technical points of enzyme digestion and isolation for primary culture of mouse nasal mucosal epithelial cells,so as to improve the success rate of primary culture,and provide agood culture model for subsequent experiments.Methods 0.1%collagenase of type Ⅰ(about 5times the volume of the tissue block)was added into the nasal mucosa tissue block of mice and mixed evenly,incubated in 37℃incubator for 10min,andappropriate amount of FBS was added to terminate the digestion reaction.After the enzyme solution was removed,the same amount of 0.25%trypsin was added and mixed evenly,incubated in 37℃incubator for 2h,and appropriate amount of FBSwas added to terminate the digestion reaction.The 200mesh cell filter was used to filter the cell liquid,the filtrate was put into a centrifuge tube,centrifuged at 1000r/min for 10min,and then the supernatant was discarded.HBSS was added into the precipitate,washed once,centrifuged at 1000r/min for 5min,and the supernatant was discarded;the remaining cells were added into DMEM/F12medium containing serum and mixed evenly.The culture dish was placed in the incubator with 5%CO 2and 95%O 2at 37℃,the fluid was changed after 2-3days.The morphology and growth of the cells were observed under the inverted microscope,and the nature and purity of the cells were identified by immunofluorescence.Results Theprimary culture nasal mucosal epithelial cells could be observed on the 7th day,cover about 50%of the culture dish on the 14th day,and cover the whole culture dish on the 21st day of culture;the nasal mucosal epithelial cells had clear edges,large numbers and good activity,which could be used for further experimental study;the cells was epithelial-derived cells by CK18identification,and the purity of nasal mucosal epithelial cells was as high as 90%.Conclusion This culture method is simple,with good nasal mucosal epithelial cells proliferation and high purity.KEYWORDS:nasal mucosal epithelial cells;cell culture;anti-cytokeratin 18小鼠鼻黏膜上皮细胞的原代培养和鉴定常换换1，崔沐2，王洁1*（1.西安交通大学附属儿童医院耳鼻喉科，陕西西安，710003；2.西安医学院护理系，陕西西安，710021）摘要：目的探讨酶消化分离法原代培养小鼠鼻黏膜上皮细胞的实验步骤和技术要点，提高原代培养成功率，为后续实验提供良好的培养模型。
小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定山东大学实验报告山东大学实验报告 2013年6月8日姓名陈少坤系年级 2011级生科2班同组者张劲松王洪善科目细胞实验题目小鼠脾细胞原代培养，死活细胞鉴定一、前言细胞培养的概念:多细胞生物的细胞可以被分离出来，然后在体外特殊培养环境中继续存活，并保持其生理、生化特性直接从生物体分离出来，在体外培养过程中尚未分裂、增殖的细胞，称为原代培养细胞。
原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，这时就成为继代培养细胞。
细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括 pH、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。
细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。
细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。
它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。
二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。
超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。
细胞培养特点:大量实验材料单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基易于观察易于操作，改造活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。
细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。
台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞。
因此，活细胞一般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。
伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。
山东大学实验报告山东大学实验报告二、实验目的回顾细胞培养的有关学习分离小鼠脾细胞的技术学习悬浮细胞的计数学习简单的细胞培养技术学习实验过程的详细描述及实验记录三、实验用品试剂:小鼠，70%酒精，蒸馏水， PBS, 细胞培养液，台盘蓝，伊红溶液仪器解剖盘，镊子，剪子，盖玻片，载玻片，显微镜，吸管，血细胞计数器四、实验步骤一、原代培养1.采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。
2.将小鼠浸泡在 70%酒精中几分钟。
小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。
原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。
原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。
原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。
因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。
一般采用2-5代的细胞进行实验。
当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。
原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。
组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。
但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。
组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。
2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。
细胞生物学名词解释一．绪论细胞生物学是从细胞的整体水平，亚显微水平，分子水平3 个层次，以整体与动态的观点研究细胞的结构，功能，以及各种生命活动本质和基本活动的科学。
二．细胞生物学的研究方法1.细胞培养（cell culture）：从活体中取出的细胞或其他建系细胞，在体外无菌条件下，给予一定的条件进行培养，使其能继续生存、生长和繁殖的一种方法。
2.原代培养（primary culture）：直接取材于有机体组织的细胞培养。
3.传代培养（secondary culture）：将原代培养的细胞取出，以1:2以上的比例转移到另一盛有新鲜培养液的器皿中进行培养的过程称传代培养。
用这种方法可重复传代。
4.接触抑制：一般分散的细胞悬液在培养瓶中很快就贴壁铺展并进行分裂繁殖，形成紧密的单层细胞，当这些细胞表面互相接触时，就停止分裂增殖，不再进入S期，这种现象称细胞的接触抑制。
5.细胞系（cell line）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。
有限细胞系（50代以内）6.细胞融合：是指用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。
7.Southern杂交：是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。
8.Northern杂交9.PCR技术：是在体外快速扩增特异性DNA片段的技术，它利用DNA半保留复制原理，通过控制温度，使DNA 处于“变性—复性—合成”反复循环中。
每一个循环的产物又作为下一个循环的模板，每循环一次，DNA分子就按2n指数倍增，结果可获得数百万个拷贝的目的DNA片段。
三．细胞概述细胞是一切有机体的基本结构和功能单位，各种生命活动都是以细胞为单位进行的，细胞的形态结构和功能特异，但其化学组成基本相似。
1.生物大分子：细胞内由小分子物质聚合而成的结构复杂，具独特特性，负责装配细胞组成，催化细胞内化学变化，产生运动，反应以及遗传变异的生命活动的物质。
小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展摘要综述了有关于小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法的研究进展,阐述了乳腺细胞培养的意义,介绍了乳腺组织原代培养的过程, 并分析了所取得的研究成果。
关键词小鼠;乳腺上皮细胞;原代培养;细胞工程原代培养即直接从有机体摘取细胞、组织或器官,使其在体外维持与生长。
合适的培养条件对体外培养细胞的生存和增殖都十分重要。
一般而言,不同动物、不同组织器官来源的细胞对培养条件的要求存在一定差异,因此,需要使体外环境下的培养条件尽可能地模拟体内环境。
体内乳腺组织的增殖、分化和组织结构重塑受内环境(如类固醇、生长因子、结合蛋白及细胞外基质间复杂的相互作用等)因素的影响和作用,这些因素同样也影响体外培养乳腺上皮细胞的增殖分化和功能表现。
对于某种动物特定组织细胞的体外培养,对培养液、添加因子、附着底物及培养温度、pH值等都需进行仔细的选择,乳腺上皮细胞的体外培养建立在乳腺上皮原代培养细胞的基础上,针对不同的研究目的应采取不同的培养方法,以对细胞进行分化诱导。
张以涛比较了不同pH值、不同血清浓度配比的生长培养液对小鼠乳腺上皮细胞生长的影响,结果表明, pH值7. 4含10%血清的培养基为最佳生长液。
现代研究普遍认为,内分泌激素在乳腺上皮细胞发育各个阶段都发挥影响作用,不同时期乳腺组织的形态、组成及功能均有差异,这对选择乳腺上皮细胞体外培养的取材时间有指导意义。
张以涛比较了取自不同时期乳腺上皮细胞的生物学特性,得出妊娠期细胞生存、增殖能力均强于泌乳期细胞,妊娠期小鼠乳腺为获得细胞的最佳取材时期。
乳腺上皮细胞的原代培养,首先是尽可能地分离出乳腺上皮细胞,同时减少分离过程对细胞的损伤和浪费,以及通过采用一定的方法,使最终得到富集的乳腺上皮细胞及杂质细胞尽可能少甚至被完全清除。
1乳腺细胞培养的意义将动物细胞或组织在体外进行培养,能有效排除神经体液等因素对其造成的影响,可直接进行药物对细胞的活动代谢、毒性和杀伤作用等检测,如秦君等以王不留行为试验材料,对其3类主要成分(皂甙类、黄酮甙类及香豆素类)进行提取,分别以不同浓度添加到细胞培养液中,寻找王不留行促进泌乳的有效成分。
《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。
动物医学进展,2009,30(2):30-34Progress in Veterinary Medicine小鼠输卵管上皮细胞的原代培养及纯化方法研究＊赵晓娥,兰 杰,王 妍,杨培先,胡林勇,马保华＊(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵712100) 摘 要:建立小鼠输卵管上皮细胞原代培养及纯化方法。
小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用组织块培养法和酶消化法。
酶消化法于37℃分为4个处理组进行。
处理1以2.5g/L胰酶+0.4g/L EDTA消化5、10、20min;处理2以0.5g/L胰酶+0.08g/L EDTA消化35、50、75min;处理3以0.3g/L的Ⅰ型胶原酶消化60、90、240min;处理4以2.5g/L胰酶+0.4g/L EDTA和0.3g/LⅠ型胶原酶(1∶2)消化60min,150min。
原代细胞纯化采用差速贴壁和反复差速贴壁法。
传代采用胰酶两步消化法进一步纯化输卵管上皮细胞。
组织块法原代培养成纤维细胞生长优势明显,传代纯化细胞效果不佳。
用酶消化法原代培养时,处理1效果不理想;处理2采用3个消化时间时均取得比较理想的结果;处理3消化240min时结果较好;处理4消化150min效果较好。
原代细胞纯化,反复差速贴壁得到的上皮细胞较纯,进一步传代纯化细胞取得了理想的结果。
小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用酶消化法结合反复差速贴壁分离纯化细胞,传代采用两步消化法,可以成功地进行小鼠输卵管上皮细胞的分离纯化培养。
关键词:输卵管上皮细胞;细胞培养;细胞纯化;小鼠中图分类号:Q343.6;Q813.11文献标识码:A文章编号:1007-5038(2009)02-0030-05 输卵管作为早期胚胎发育的场所之一,为其提供相互作用的微环境,因而倍受研究者的关注。
输卵管上皮细胞培养可为研究配子输送、受精和早期胚胎发育提供良好的基础。
目前,利用输卵管上皮细胞构建的共培养体系,已证明可以有效地促进哺乳动物早期胚胎的发育,克服胚胎的体外阻滞,提高妊娠率[1]。
小鼠表皮细胞的原代培养---细胞生物学综合设计性实验报告学院課程实验项目实验题目专业年级、班别姓名学号任课教师完成日期实验六细胞培养——小鼠表皮细胞的原代培养摘要目的探讨体外分离和培养小鼠表皮细胞的方法。
方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠表皮细胞进行了体外分离、培养。
（用眼科剪把新生小鼠表皮细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将组织块接种于培养瓶中进行体外培养。
）结果新生小鼠表皮细胞克隆2~3d后开始形成［1］，细胞呈梭形，体外培养一个星期后仍能够保持良好的生长状态。
结论采用该方法能够实现对小鼠表皮细胞的体外原代培养，并且细胞贴壁生长的速度比单纯采用酶消化法和组织块法大大提高。
关键词原代培养小鼠表皮细胞酶消化法组织块法1前言目的：初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。
意义：细胞培养技术目前已经广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学等领域，已发展成为一种重要的生物技术。
为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。
［2］方法：结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。
结果：运用这种方法成功并比较快速地培养出原代表皮细胞。
结论：这种方法为广泛开展表皮细胞原代培养奠定了基础。
2实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用组织块培养法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
3实验用品3.1器材每小组：解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管（如有条件，吸管最好由可消毒移液器及其Tip取代）：直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶（或细胞培养皿）：小组人数+1个；青霉素瓶及瓶塞：小组人数+2个（其中一个用于分装胰酶液）；血细胞计数板1块, 盖玻片; 2～5ml注射器及注射针头1套；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。
烧杯：5～10ml 2个、100 ml1个。
分类彻底清洗、干燥、包装、消毒灭菌后备用（用于取材接种及培养）。
每大组共用：用于分装培养用液：盐水瓶250 ml1个、100 ml2个（或100、50各1个），配套100（或50ml）盐水瓶塞2个，1 ml刻度吸管2支，吸管胶头（小）2个，青霉素瓶及瓶塞1个/小组。
用于无菌操作：不锈钢杯子1个（作废液缸）；解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，酒精灯1台、打火机1个。
用于装载及包装物品：有盖白瓷盘2个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。
小培养皿(装盖玻片)1个。
用于超净工作台内放置需多次使用的吸管：试管12支；试管架1个。
记号笔1支等。
3.2试剂3.2.1清洗用液：5%稀盐酸、1%稀盐酸、2%NaOH、洗洁精、单蒸水、三蒸水、清洗液（用浓硫酸和重铬酸钾配制、全班共用）等。
3.2.2消毒剂（用前配制）：甲醛、高锰酸钾、新洁尔灭、75%酒精、碘酒、过氧乙酸等。
3.2.3 培养用液：3.2.3.1 细胞培养用液（每大组100mL，用100mL盐水瓶装）：经过滤过的F10（RPMI1640）培养基占80~90%、经过滤除菌的小牛血清占10~20%,加入经过滤除菌、终浓度各为100国际单位的抗菌素。
3.2.3.2细胞消化液（每小组1青霉素瓶，约5mL）：经过滤除菌的0.25%胰蛋白酶或EDTA—胰蛋白酶液。
3.2.3.3平衡盐溶液：不含钙、镁离子的Hank液：每组约50mL，用50（或100）mL盐水瓶装。
3.3 材料：新生小白鼠4实验方法4.1技术路线清洗玻璃仪器,胶塞→制备消毒棉球→包装分装培养液用液用品→消毒分装培养用液用品→分装培养用液→包装原代培养接种用品→实验时的准备工作如小组所示→打开腹腔，切取小鼠皮肤组织块→洗去血污→剔除多余成份→剪成小于1mm³大小的组织块→胰蛋白酶消化组织块→接种组织块→贴壁→培养→观察和记录4.2 实验步骤1 玻璃仪器的初步清洗、开始培育小白鼠（第一批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等）2 继续培养乳鼠（第二批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等），玻璃仪器的清洗（清洗液浸泡）、胶制品的清洗。
3 继续培养乳鼠（常规饲养工作）、完成清洗工作（包括各类物品）、制备消毒用棉球、包装分装培养用液用品。
4 继续培养乳鼠（常规饲养工作、留意小鼠的出生）、消毒分装培养用液用品、分装培养用液、包装原代培养接种用品。
5 消毒原代培养接种用品6 细胞原代培养［3］(1)洗手操作者用洗涤剂刷洗双手→自来水冲净→新洁尔灭浸泡→进入无菌室(2)准备工作：［1］操作者于超净台内用酒精棉球消毒双手，待酒精稍干后点燃酒精灯，然后用酒精棉球消毒工作面。
［2］去掉Hank液、细胞培养液、酶液的包装纸。
［3］打开试管、吸管胶头包装，将试管插（尽量斜插）入试管架［4］取出需用的吸管（直、弯吸管各一支，刻度吸管一支）套上胶头，试管一支，插入相应的试管中。
［5］打开培养皿以及解剖工具手持端的包装(7)处死小鼠(脱臼法) →消毒（放入含75%酒精的烧杯中浸泡数秒）。
将以处死消毒的小鼠转移至超净工作台内的培养皿盖内，背部朝上。
培养皿倒扣于包装纸上待用。
(8)解剖取皮肤：用酒精棉球擦拭背部，在腰部后缘用解剖镊提起皮肤，用解剖剪呈T形剪开皮肤，再用眼科剪切取皮肤组织块，置于无菌培养皿中。
(9)用Hank液洗涤皮肤组织2次，吸去Hank。
(10)剪碎组织块：换另一套眼科剪将组织块剪成小于1mm³的组织块（大小尽量一致）。
用Hank液洗涤，弃Hank液。
(11)酶消化：将胰蛋白酶液加入装有组织块的青霉素瓶中，盖紧盖子，置超净工作台内中消化5—10min，知道组织块变松软、粘稠状，颜色略变白色为止。
(12)将培养液直接加入盛有胰蛋白酶和皮肤组织块的青霉素瓶中，利用其中的牛血清终止酶消化的作用，弃去酶液和培养液的混合液。
加入培养液重复此操作2—3次。
(13)取一培养瓶，在培养瓶的上面做好标志（在瓶侧注明班、组别、姓名、材料名称等信息）(14) 用培养液湿润的吸管小心吸取组织块,轻轻吹出到培养瓶的培养瓶面内,按照一定的间隔和形式用弯吸管将植块排列好(15) 翻转培养瓶（培养面在上方），加入4ml的培养液。
(16) 将培养皿加盖封口,送入37度恒温箱内,静置（加入的培养液不浸泡植块，不从瓶口流出）(17) 4小时后，待组织块充分贴壁后，翻转培养瓶使植块浸于培养液中且不漂浮；(18) 观察至于37度培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：［1］培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。
［2］细胞生长与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。
可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。
［3］培养液若变为桔红色，一般表示细胞生长良好。
经过1～2天培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。
换液时也要注意无菌操作（若经过1～2天培养后,若细胞生长情况较差或培养液变红,则需换液。
a 无菌室的准备工作如小组方案中所示b 从37摄氏度培养箱中取出培养瓶，于超净工作台内吸去全部旧培养液c 用平衡盐溶液轻缓漂洗培养物1～2次,弃平衡盐溶液d 加入与换液前相同的量的培养液e 放回原来的培养箱继续培养若经2～3天后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。
每日观察结果用文字记录，换液也需记录，在整个培养过程的不同阶段（最少在前、中、后阶段）置倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。
5实验结果5.1.图片展示图一:第二天小白鼠的皮肤组织的生长情况生长情况（第一次换液后一天）5.2.结果分析形态学观察结果分离的表皮细胞，在培养3h后即能够充分贴壁生长。
（1）表皮细胞在生长的早期（24～48h）已有比较多的细胞进行了贴壁生长，细胞多数呈梭形，并且细胞状态较好（如图一所示）。
这时，培养液变为橙黄色，证明细胞已生长。
6 结果分析与讨论本实验结合酶消化法和组织块法成功地培养出小鼠表皮细胞，并且相对单一采用酶消化法或者组织块法细胞贴壁生长的速度要大大提高了。
原因是因为皮片经胰蛋白酶消化后，表皮很容易从真皮上分离下来。
此时基底细胞联接较松散，把组织块放置于培养瓶中培养时，基底细胞即可轻易地游离到培养液中，然后在培养瓶底部进行贴壁生长。
［4］而单纯的组织块培养没有经过酶消化，单个的细胞不易从组织块上脱落，因此细胞游离出来贴壁生长的速度比较慢。
因此，通过该实验证明，经过酶消化进行的组织块培养的这种方法是一种改良后的细胞培养的方法，此方法培养的细胞不仅细胞贴壁生长速度快，而且细胞生长的状态也很好。
因此本实验成功地探讨出了一种细胞培养的方法，为以后的细胞培养提供了一种更加简便、更为可靠的方法，为广泛开展表皮细胞培养提供了基础。
7 参考文献[1]王丽娟,孙耀兰等.小鼠表皮干细胞的分离与培养.生物技术通讯,Vol.22 No.3 May,2011.[2]杨汉民.细胞生物学实验.第二版. 北京:高等教育出版社，1997.[3]薜庆善.体外培养原理与技术［M］. 北京:科学出版社.2001.[4]王亮.新生小鼠表皮细胞的培养.日用化学工业，第1期， 2001年2月.。
