小鼠表皮细胞的原代培养---细胞生物学综合设计性实验报告学院課程实验项目实验题目专业年级、班别姓名学号任课教师完成日期实验六细胞培养——小鼠表皮细胞的原代培养摘要目的探讨体外分离和培养小鼠表皮细胞的方法。
方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠表皮细胞进行了体外分离、培养。
（用眼科剪把新生小鼠表皮细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将组织块接种于培养瓶中进行体外培养。
）结果新生小鼠表皮细胞克隆2~3d后开始形成［1］，细胞呈梭形，体外培养一个星期后仍能够保持良好的生长状态。
结论采用该方法能够实现对小鼠表皮细胞的体外原代培养，并且细胞贴壁生长的速度比单纯采用酶消化法和组织块法大大提高。
关键词原代培养小鼠表皮细胞酶消化法组织块法1前言目的：初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。
意义：细胞培养技术目前已经广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学等领域，已发展成为一种重要的生物技术。
为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。
［2］方法：结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。
结果：运用这种方法成功并比较快速地培养出原代表皮细胞。
结论：这种方法为广泛开展表皮细胞原代培养奠定了基础。
2实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用组织块培养法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
3实验用品3.1器材每小组：解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管（如有条件，吸管最好由可消毒移液器及其Tip取代）：直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶（或细胞培养皿）：小组人数+1个；青霉素瓶及瓶塞：小组人数+2个（其中一个用于分装胰酶液）；血细胞计数板1块, 盖玻片; 2～5ml注射器及注射针头1套；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。
烧杯：5～10ml 2个、100 ml1个。
分类彻底清洗、干燥、包装、消毒灭菌后备用（用于取材接种及培养）。
每大组共用：用于分装培养用液：盐水瓶250 ml1个、100 ml2个（或100、50各1个），配套100（或50ml）盐水瓶塞2个，1 ml刻度吸管2支，吸管胶头（小）2个，青霉素瓶及瓶塞1个/小组。
用于无菌操作：不锈钢杯子1个（作废液缸）；解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，酒精灯1台、打火机1个。
用于装载及包装物品：有盖白瓷盘2个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。
小培养皿(装盖玻片)1个。
用于超净工作台内放置需多次使用的吸管：试管12支；试管架1个。
记号笔1支等。
3.2试剂3.2.1清洗用液：5%稀盐酸、1%稀盐酸、2%NaOH、洗洁精、单蒸水、三蒸水、清洗液（用浓硫酸和重铬酸钾配制、全班共用）等。
3.2.2消毒剂（用前配制）：甲醛、高锰酸钾、新洁尔灭、75%酒精、碘酒、过氧乙酸等。
3.2.3 培养用液：3.2.3.1 细胞培养用液（每大组100mL，用100mL盐水瓶装）：经过滤过的F10（RPMI1640）培养基占80~90%、经过滤除菌的小牛血清占10~20%,加入经过滤除菌、终浓度各为100国际单位的抗菌素。
3.2.3.2细胞消化液（每小组1青霉素瓶，约5mL）：经过滤除菌的0.25%胰蛋白酶或EDTA—胰蛋白酶液。
3.2.3.3平衡盐溶液：不含钙、镁离子的Hank液：每组约50mL，用50（或100）mL盐水瓶装。
3.3 材料：新生小白鼠4实验方法4.1技术路线清洗玻璃仪器,胶塞→制备消毒棉球→包装分装培养液用液用品→消毒分装培养用液用品→分装培养用液→包装原代培养接种用品→实验时的准备工作如小组所示→打开腹腔，切取小鼠皮肤组织块→洗去血污→剔除多余成份→剪成小于1mm³大小的组织块→胰蛋白酶消化组织块→接种组织块→贴壁→培养→观察和记录4.2 实验步骤1 玻璃仪器的初步清洗、开始培育小白鼠（第一批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等）2 继续培养乳鼠（第二批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等），玻璃仪器的清洗（清洗液浸泡）、胶制品的清洗。
3 继续培养乳鼠（常规饲养工作）、完成清洗工作（包括各类物品）、制备消毒用棉球、包装分装培养用液用品。
4 继续培养乳鼠（常规饲养工作、留意小鼠的出生）、消毒分装培养用液用品、分装培养用液、包装原代培养接种用品。
5 消毒原代培养接种用品6 细胞原代培养［3］(1)洗手操作者用洗涤剂刷洗双手→自来水冲净→新洁尔灭浸泡→进入无菌室(2)准备工作：［1］操作者于超净台内用酒精棉球消毒双手，待酒精稍干后点燃酒精灯，然后用酒精棉球消毒工作面。
［2］去掉Hank液、细胞培养液、酶液的包装纸。
［3］打开试管、吸管胶头包装，将试管插（尽量斜插）入试管架［4］取出需用的吸管（直、弯吸管各一支，刻度吸管一支）套上胶头，试管一支，插入相应的试管中。
［5］打开培养皿以及解剖工具手持端的包装(7)处死小鼠(脱臼法) →消毒（放入含75%酒精的烧杯中浸泡数秒）。
将以处死消毒的小鼠转移至超净工作台内的培养皿盖内，背部朝上。
培养皿倒扣于包装纸上待用。
(8)解剖取皮肤：用酒精棉球擦拭背部，在腰部后缘用解剖镊提起皮肤，用解剖剪呈T形剪开皮肤，再用眼科剪切取皮肤组织块，置于无菌培养皿中。
(9)用Hank液洗涤皮肤组织2次，吸去Hank。
(10)剪碎组织块：换另一套眼科剪将组织块剪成小于1mm³的组织块（大小尽量一致）。
用Hank液洗涤，弃Hank液。
(11)酶消化：将胰蛋白酶液加入装有组织块的青霉素瓶中，盖紧盖子，置超净工作台内中消化5—10min，知道组织块变松软、粘稠状，颜色略变白色为止。
(12)将培养液直接加入盛有胰蛋白酶和皮肤组织块的青霉素瓶中，利用其中的牛血清终止酶消化的作用，弃去酶液和培养液的混合液。
加入培养液重复此操作2—3次。
(13)取一培养瓶，在培养瓶的上面做好标志（在瓶侧注明班、组别、姓名、材料名称等信息）(14) 用培养液湿润的吸管小心吸取组织块,轻轻吹出到培养瓶的培养瓶面内,按照一定的间隔和形式用弯吸管将植块排列好(15) 翻转培养瓶（培养面在上方），加入4ml的培养液。
(16) 将培养皿加盖封口,送入37度恒温箱内,静置（加入的培养液不浸泡植块，不从瓶口流出）(17) 4小时后，待组织块充分贴壁后，翻转培养瓶使植块浸于培养液中且不漂浮；(18) 观察至于37度培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：［1］培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。
［2］细胞生长与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。
可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。
［3］培养液若变为桔红色，一般表示细胞生长良好。
经过1～2天培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。
换液时也要注意无菌操作（若经过1～2天培养后,若细胞生长情况较差或培养液变红,则需换液。
a 无菌室的准备工作如小组方案中所示b 从37摄氏度培养箱中取出培养瓶，于超净工作台内吸去全部旧培养液c 用平衡盐溶液轻缓漂洗培养物1～2次,弃平衡盐溶液d 加入与换液前相同的量的培养液e 放回原来的培养箱继续培养若经2～3天后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。
每日观察结果用文字记录，换液也需记录，在整个培养过程的不同阶段（最少在前、中、后阶段）置倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。
5实验结果5.1.图片展示图一:第二天小白鼠的皮肤组织的生长情况生长情况（第一次换液后一天）5.2.结果分析形态学观察结果分离的表皮细胞，在培养3h后即能够充分贴壁生长。
（1）表皮细胞在生长的早期（24～48h）已有比较多的细胞进行了贴壁生长，细胞多数呈梭形，并且细胞状态较好（如图一所示）。
这时，培养液变为橙黄色，证明细胞已生长。
6 结果分析与讨论本实验结合酶消化法和组织块法成功地培养出小鼠表皮细胞，并且相对单一采用酶消化法或者组织块法细胞贴壁生长的速度要大大提高了。
原因是因为皮片经胰蛋白酶消化后，表皮很容易从真皮上分离下来。
此时基底细胞联接较松散，把组织块放置于培养瓶中培养时，基底细胞即可轻易地游离到培养液中，然后在培养瓶底部进行贴壁生长。
［4］而单纯的组织块培养没有经过酶消化，单个的细胞不易从组织块上脱落，因此细胞游离出来贴壁生长的速度比较慢。
因此，通过该实验证明，经过酶消化进行的组织块培养的这种方法是一种改良后的细胞培养的方法，此方法培养的细胞不仅细胞贴壁生长速度快，而且细胞生长的状态也很好。
因此本实验成功地探讨出了一种细胞培养的方法，为以后的细胞培养提供了一种更加简便、更为可靠的方法，为广泛开展表皮细胞培养提供了基础。
7 参考文献[1]王丽娟,孙耀兰等.小鼠表皮干细胞的分离与培养.生物技术通讯,Vol.22 No.3 May,2011.[2]杨汉民.细胞生物学实验.第二版. 北京:高等教育出版社，1997.[3]薜庆善.体外培养原理与技术［M］. 北京:科学出版社.2001.[4]王亮.新生小鼠表皮细胞的培养.日用化学工业，第1期， 2001年2月.。
