木质素酶活测定方法

固态发酵漆酶活性测定：酶液制取：5g 发酵样品以1:20（W/V ）比例用蒸馏水悬浮，200 r/min 摇3h ，之后5000 r/min 离心20min 。

（上清用0.45µm 滤纸过滤，于-20℃保存滤液，取能整除的滤液体积用于漆酶活性测定。

）酶活反应体系3.0mL （2.3mL 0.2mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液；pH=4.50.5mL 粗酶液稀释液；0.2mL 1mmol/L 的ABTS ）420nm 处测定吸光值的变化。

此实验固态发酵漆酶活性计算公式：5g 0.5mL 100mL L T 36000V 10)g (/U 3420⨯⨯⨯⨯⨯⨯∆⨯⨯=酶总OD V NN ：酶液稀释倍数V 总: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL ）V 酶: 反应添加的酶液体积（mL ）△OD 420: t 时间内反应液在420nm 处吸光度的增加值36000: 420nm 处ABTS 氧化态的摩尔吸光系数(L/mol ·cm)T ：反应时间（min ）L 为比色皿的直径（cm ）。

100mL/(0.5mL ×5g)：固态变成液态的稀释倍数液态发酵漆酶活性测定：酶活反应体系3.0mL （2.3mL 0.2mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液；pH=4.50.5mL 粗酶液稀释液；0.2mL 1mmol/L 的ABTS ）L T 36000V 10)g (/U 酶3420总⨯⨯⨯⨯∆⨯⨯=OD V NN ：酶液稀释倍数 V 总: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL ）V 酶: 反应添加的酶液体积（mL ）△OD 420: t 时间内反应液在420nm 处吸光度的增加值36000: 420nm 处ABTS 氧化态的摩尔吸光系数(L/mol ·cm)T ：反应时间（min ）L 为比色皿的直径（cm ）。

固态发酵锰过氧化物酶（MnP ）活性测定：酶液制取：粗酶液制备发酵过程中每隔 2 d 取 5 g 发酵物于 250 mL 三角瓶中，加入 100 mL H 2O ，在 200 r / min 的摇床中振荡提取 3 h ，之后5000 r/min 离心20min 。

1前言草菇是一种著名的食用菌，营养丰富，味鲜美，深受人们的喜爱。

草菇子实体含有人体必需的8种氨基酸，占其他氨基酸总量得38.2%，还含有14种维生素[1]，不愧为一种比较理想的天然保健食品。

草菇喜高温高湿，生长速度快，生长周期短，一糙只需25天左右，在广西每年4月至9月均可以种植，是一种很有发展前途的食用菌，生产和市场前景广阔。

栽培草菇的生物学效率比较低（鲜菇与栽培料的比值），用稻草栽培草菇的生物学效率大都在10—15%左右。

过去研究认为草菇主要利用纤维素、淀粉，不大利用半纤维素以及木质素。

因为草菇的半纤维素酶活性低，又缺乏降解木质素的酶类，但是农作物秸杆中一般含有半纤维素15—30%，木质素占10—30%。

为此，本试验用透明圈法、氧化圈法观测V展1、V展2、V展3、V6、V广、V11六个菌株所产的胞外酶利用分解半纤维素，木质素的能力，看是否能够从其中初步筛选出利用半纤维素、木质素较强的菌株来。

探讨更合理地配制栽培料的途径对提高草菇的生物转化率有重要意义。

2 实验原理半纤维素是由五个碳原子为主的木糖聚合的高分子化合物，经木聚糖酶降解利用之后，基质生成透明圈[2]。

木质素是以苯环为基本结构的复杂大分子的有机化合物，含碳60—66%，在多酚氧化酶、过氧化酶降解后，能与愈创木酚进行反应生成棕红色或棕褐色轮环[3]。

亮兰试剂与蛋白质结合兰青色、在与过氧化酶作用则呈黄色透明圈[4]。

通过相应的平板基质培养，草菇菌丝分泌的酶类降解利用后，形成的透明圈迟早、直径大小、色泽深度等初步判断是否存在半纤维素酶和木质素酶降解酶类及其活性。

3 材料与方法3.1 材料3.1.1 菌株V 9购至广西大学微生物研究所，V广、V11购至广西农业科学院生物技术研究所，V展1、V展2、V展3采至广西现代农业展示中心经组织培养所得。

3.1.2 试剂可溶性淀粉、亮兰溶液自配、半纤维素自已提制、愈创木酚为国产分析纯、木聚糖为进口。

3.2 试验方法3.2.1 试剂配制3.2.1.1 亮兰溶液配制25 ml亮兰溶于25ml浓度为90%乙醇中，加入85%的H3PO4，最后定溶至500ml，灭菌。

一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法一、概述羧甲基纤维素酶（carboxymethylcellulase，CMCase）是一种重要的木质素酶，它可以将木质素分解为更小体积的产物，从而可促进木质素利用。

因此，测定CMCase活性对于研究木质素加工过程和利用资源至关重要。

二、试剂①P-nitrophenyl 葡糖苷（PNPG）：20 mg/ml;②NaHCO3：0.1 mol/L;③Tris-HCl buffer：50 mmol/L, pH 7.2;④凝胶分离 Buffer：30 mmol/L Tris-HCl，1.5 mmol/L EDTA，10 mmol/L Na2SO4，pH=7.2三、实验步骤1.溶质处理：将木质素细胞壁材料（包括原料和残渣）用凝胶分离buffer缓慢搅拌，直至得到悬浮液。

2.仪器设置：将悬浮液100 μL加入定量瓶中，并加入足量的Tris-HCl缓冲液（50 mL）。

然后安装溶解度仪，并调节机器的参数，使水温调节在28-30℃，波速调节在400 Hz左右，进行10min的研磨处理。

3.测定：将研磨后的悬浮液取出，加入0.1mol/L NaHCO3 10 ml和P-nitrophenyl 葡糖苷（100 μL），搅拌均匀，测定其吸光度，以425nm波长，示定测定CMCase活性。

4.计算：根据吸光度值计算CMCase活性：CMCase活性（U/ml）=A/B，其中A为PNPG测定液的吸光度，B为研磨后悬浮液的吸光度。

四、安全措施1.实验时应戴好实验手套，操作时要注意卫生。

2.羧甲基纤维素酶属于酶分类，易挥发，操作时应尽量避免空气污染。

3.在实验室进行实验时，应注意实验室温度和湿度，使实验条件尽量达到推荐的实验要求。

4.搅拌完毕后，实验材料用大量水冲洗，然后再投入污水处理系统处理。

五、结论本实验介绍了一种简便、高效的羧甲基纤维素酶活性测定方法，建立的方法可以准确、灵敏地测定羧甲基纤维素酶活性，可广泛应用于木质素加工过程和资源利用的研究中。

植物酶活指标植物酶活性指的是植物体内酶的催化活性程度，也称为酶活力。

植物体内酶活性与植物生长发育、代谢、环境适应能力等密切相关。

因此，研究植物酶活性指标具有重要的科学意义和应用价值。

一、植物酶活指标的类型1、氧化还原酶：包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等。

2、酯酶：包括脂肪酶（LIP）和酯酶（EST）等。

3、氨基酸、蛋白质和多糖酶：包括谷氨酸脱氢酶（GDH）、丝氨酸脱酸酶（SDH）、多酚氧化酶（PPO）、多酚酶（POD）、木质素过氧化物酶（LPO）和纤维素酶等。

二、植物酶活指标的意义1、判断环境胁迫：有研究表明，氧气自由基及其产生的活性氧分子是植物生长发育、代谢过程中的一个重要因素。

而氧化还原酶在植物体内具有极高的活性，能够迅速清除氧气自由基及其产生的活性氧分子。

因此，通过测定植物体内氧化还原酶活性，可以判断环境胁迫程度及其对植物的影响。

2、评估生长发育状态：氨基酸、蛋白质和多糖酶等酶在植物体内能够催化孢子、芽、花、果实等生长发育过程中的代谢反应。

因此，可以通过测定这些酶活性的变化，来评估植物的生长发育状态。

3、诊断植物病害：植物病害的发生与否及其严重程度，常常会影响植物体内某些酶的活性，如过氧化物酶和谷氨酸脱氢酶等。

因此，通过测定植物体内的酶活性，可以较为准确地诊断植物病害。

三、植物酶活指标的测定方法1、样品的预处理：将植物材料（如叶片、根、果实等）取出后，立即将其冷冻或干燥，以避免其酶活性受到破坏。

2、酶活测定方法：根据不同酶的特点和催化反应特性，选择相应的酶活测定方法。

如氧化还原酶可以采用光谱方法或电化学法进行测定，酯酶可以采用碳酸酯法、碱式溶液法或带有色团的底物法进行测定，而氨基酸、蛋白质和多糖酶可以采用比色法、光度法或重量法进行测定。

四、植物酶活指标的应用1、农业生产领域：在农业生产中，常常需要对作物的生长发育状态和抗逆能力进行评估，而植物酶活指标的变化能够反映出相应的信息，因此可以用于指导作物的种植和环境调控。

漆酶高产菌株的筛选实验方案漆酶是一种能够分解木质素的酶，被广泛应用于漆酶工业生产中。

为了获得高产漆酶的菌株，可以采用以下筛选实验方案。

首先，准备木材素作为酶的底物。

木材素是漆酶的天然底物，因此使用木材素可以更好地模拟真实环境，提高筛选的准确性。

接下来，采集不同环境中的泥土样品。

漆酶产生菌株存在于自然环境中的泥土中，因此从不同环境中采集泥土样品能够获得更多潜在的高产漆酶菌株。

然后，制备泥土微生物的培养基。

泥土样品中的微生物需要合适的培养基进行生长，通常可以使用Czapek-Dox培养基作为基础培养基，并根据实际情况进行优化。

随后，进行菌株的分离与纯化。

将采集的泥土样品进行稀释，并分别洒在含有木材素的琼脂板上。

通过观察是否存在环带或透明圈，从木材素周围分离出对木材素具有降解能力的菌株。

然后将菌株进行连续传代，并进行单菌落的分离，最终得到纯化的菌株。

接着，筛选高产漆酶的菌株。

采用固体培养，将纯化的菌株接种到含有木材素的琼脂板上，培养一定时间后，观察琼脂板上是否出现降解区域。

根据降解区域的大小和颜色的深浅，可以初步评估出菌株的木质素降解能力。

然后，选取降解能力较强的菌株进行液体培养。

将选取的菌株接种到含有木材素的液体培养基中，进行摇瓶培养。

培养一定时间后，通过测定液体培养基中木质素的降解率来评估菌株的降解能力。

最后，通过PCR扩增和酶活测定等分子技术手段对菌株进行鉴定与验证。

通过PCR扩增菌株的漆酶基因序列，并与已知的漆酶基因序列进行比对，验证菌株是否真正具有漆酶产生能力。

同时，使用酶活测定方法对菌株中的漆酶酶活进行测定，验证菌株的漆酶活性。

以上是一种对漆酶高产菌株进行筛选的实验方案。

通过以上步骤，可以筛选到具有高降解能力和高酶活的漆酶菌株，为漆酶产业的发展提供有力支持。

1 前言草菇是一种著名的食用菌，营养丰富，味鲜美，深受人们的喜爱。

草菇子实体含有人体必需的8种氨基酸，占其他氨基酸总量得38.2%，还含有14种维生素[1]，不愧为一种比较理想的天然保健食品。

草菇喜高温高湿，生长速度快，生长周期短，一糙只需25天左右，在广西每年4月至9月均可以种植，是一种很有发展前途的食用菌，生产和市场前景广阔。

栽培草菇的生物学效率比较低（鲜菇与栽培料的比值），用稻草栽培草菇的生物学效率大都在10—15%左右。

过去研究认为草菇主要利用纤维素、淀粉，不大利用半纤维素以及木质素。

因为草菇的半纤维素酶活性低，又缺乏降解木质素的酶类，但是农作物秸杆中一般含有半纤维素15—30%，木质素占10—30%。

为此，本试验用透明圈法、氧化圈法观测V展1、V展2、V展3、V6、V广、V11六个菌株所产的胞外酶利用分解半纤维素，木质素的能力，看是否能够从其中初步筛选出利用半纤维素、木质素较强的菌株来。

探讨更合理地配制栽培料的途径对提高草菇的生物转化率有重要意义。

2 实验原理半纤维素是由五个碳原子为主的木糖聚合的高分子化合物，经木聚糖酶降解利用之后，基质生成透明圈[2]。

木质素是以苯环为基本结构的复杂大分子的有机化合物，含碳60—66%，在多酚氧化酶、过氧化酶降解后，能与愈创木酚进行反应生成棕红色或棕褐色轮环[3]。

亮兰试剂与蛋白质结合兰青色、在与过氧化酶作用则呈黄色透明圈[4]。

通过相应的平板基质培养，草菇菌丝分泌的酶类降解利用后，形成的透明圈迟早、直径大小、色泽深度等初步判断是否存在半纤维素酶和木质素酶降解酶类及其活性。

3 材料与方法3.1 材料3.1.1 菌株V 9购至广西大学微生物研究所，V广、V11购至广西农业科学院生物技术研究所，V展1、V展2、V展3采至广西现代农业展示中心经组织培养所得。

3.1.2 试剂可溶性淀粉、亮兰溶液自配、半纤维素自已提制、愈创木酚为国产分析纯、木聚糖为进口。

3.2 试验方法3.2.1 试剂配制3.2.1.1 亮兰溶液配制25 ml亮兰溶于25ml浓度为90%乙醇中，加入85%的H3PO4，最后定溶至500ml，灭菌。

木质素过氧化物酶（Lip）活性检测试剂盒说明书注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：UPLC-MS-4258规格：100T/96S微量法产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件试剂一液体115mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体5mL×1瓶2-8℃保存试剂三液体3mL×1瓶2-8℃保存产品说明：木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）（Lip）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，是木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类。

Lip在饲料资源开发以及废水、废物处理领域有着广阔的应用前景。

藜芦醇可以被Lip催化发生氧化反应，其产物藜芦醛在310nm处有最大吸收峰，以藜芦醇为反应底物，通过测定310nm处藜芦醛的吸光值，可以判定Lip的酶活性。

LipVeratryl Alcohol Veratraldehyde(310nm)注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声波细胞破碎仪、研钵/匀浆器、微量玻璃比色皿/96孔（UV板）、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织：按照样本质量（g）：试剂一体积（mL）为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆；10000g4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一）加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率300W，超声3s，间隔7s，总时间3min），10000g4℃离心10min，取上清置冰上待测。

XX本科毕业设计（论文）题目：木质素细菌降解酶的分离、筛选与优化学院：专业：学号：学生姓名：指导教师：职称：二O一年月日摘要生物质原料作为地球上数量最大的可再生资源之一，逐渐受到人们的重视。

目前，采用木质素细菌降解酶作为预处理微生物，正成为新的研究方向。

本实验以南京紫金山土壤为原料，通过稀释平板法，固体培养基培养以及试管斜面保种等步骤，筛选得到纯种细菌。

在筛选细菌过程中，挑选部分采用液体培养基培养，得到细菌降解酶，并测其漆酶和锰过氧化物酶的酶活力，结果发现酶活力都不高。

最后通过正交试验优化菌28的产酶条件，发现在pH为3、Cu2+ 浓度为5mol/100mL、Mn2+浓度为1mg/100mL的条件下，细菌产漆酶量最大。

关键字：木质素；稀释分离；酶活；优化AbstractAs one of the largest number of renewable resources on the earth, biological raw material has been paid more and more attention. At present, biological pretreatment used by bacteria lignin degrading enzymes is becoming a new kind of research interest. In this paper, raw material was obtained the soil in the Nanjing Zijin Mountain, and then finally lignin degradation bacterium were isolated. in test tubes which were preserved in refrigerator with suitable centigrade by means like dilution，screening and solid nutrient medium. During the process in screening,we selected some bacteria to be fostered in liquid nutrient medium and measured their laccase enzymes activity and manganese peroxidase activity.The result indicated that both laccase enzymes activity and manganese peroxidase activity were not high .At last, we tried to optimize the requirement that the bacteria No.28 need to produce enzymes by orthogonal test,and discovered that the bacteria could produce the largest quantity of Lac in the condition where the pH was 3,and the consistence of Cu2+was 5mol/100mL,and the consistence of Mn2+was 1mg/100mL.Key words: lignin，isolation，enzymes activity，optimization目录第一章绪论 (1)1.1 本课题的目的、意义 (1)1.2 本课题的研究内容 (1)1.3 文献综述 (1)1.3.1 木质素的生物降解 (1)1.3.2 木质素降解菌 (2)1.3.3 国内外研究概况 (2)1.3.4 木质素降解酶及其作用机理 (3)1.3.5 微生物产木质素降解酶的影响因素 (4)1.3.6 木质素降解酶的应用 (5)第二章实验部分 (5)2.1 实验仪器 (5)2.2 实验试剂及材料 (6)2.3 实验内容与步骤（第一部分） (6)2.3.1 菌种土壤的采集 (6)2.3.2 培养基的制备 (6)2.3.3 细菌的初步纯种分离 (8)2.3.4 细菌的纯种分离 (8)2.3.5 纯种细菌的保种 (8)2.3.6 液体接种 (9)2.4 实验内容与步骤（第二部分） (9)2.4.1 漆酶（Lac）酶活的测定 (9)2.4.2 锰过氧化物酶(Mnp)酶活的测定 (11)2.4.3 木质素提纯 (11)2.4.4 产酶条件的优化 (12)第三章实验数据及分析 (13)3.1 漆酶酶活 (13)3.2 锰过氧化物酶活 (14)3.3 正交试验漆酶酶活 (16)3.4 正交试验锰过氧化物酶活 (18)3.5 数据与分析 (18)3.6结论与展望 (20)参考文献 (21)致谢 (24)第一章绪论1.1 本课题的目的、意义生物质原料作为地球上数量最大的可再生资源之一，逐渐受到人们的重视。

一株木质素降解菌的鉴定及其降解特性胡笑峰; 张朵朵; 周云横; 卫亚红; 陈少林【期刊名称】《《生物技术通报》》【年(卷),期】2019(035)009【总页数】6页(P172-177)【关键词】碱木质素; 木质素降解菌; 欧文氏菌属【作者】胡笑峰; 张朵朵; 周云横; 卫亚红; 陈少林【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院旱区生物质能研究中心杨凌712100【正文语种】中文木质素是地球上数量最多的芳香族聚合物［1]，与纤维素、半纤维素共同组成木质纤维素。

木质纤维素是目前生物质能源可研究和利用的主要材料。

作为一种可再生能源，生物质的开发利用是解决目前人类能源危机的重要途径之一，但是天然纤维质原料的木质化很大程度上限制了其可利用性［2]。

在地球碳循环中，木质素降解处于中心地位，因为大多数碳或者存在于木质素中，或者存在于受木质素保护免受酶降解的纤维素和半纤维素中［3]，所以木质素能否顺利降解也极大地影响着纤维素的有效利用。

此外，木质素作为一种造纸工业的副产物，由于很难被降解，排放到环境中后会导致严重的水生态污染［4]。

相较于传统的物理转化和化学转化，开发低能耗、清洁度高和对环境友好的生物法降解木质素正成为研究者关注的焦点。

白腐真菌是木质素降解中最主要的微生物，对其木质素降解，产酶条件的优化等方面的研究是目前生物技术应用的热点［5-6]。

然而，细菌具有来源广、生长快、便于工程改造且易于工业化生产等优势，因此，细菌降解木质素的研究也具有广阔的前景。

本研究利用选择培养基初步筛选具有木质素降解功能的细菌，通过16S rRNA基因序列分析鉴定菌株，进一步明确了菌株QL-Z3具有以碱木质素为唯一碳源进行生长代谢的木质素潜在降解性能。

并对其相关酶学展开研究，为具有实际应用价值的木质素生物降解技术的开发提供途径。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土壤样品供试土壤采样地位于秦岭西部的辛家山林区（海拔：1 500-2 000 m；经纬度：106°E，34°N），土样采集点的植物群落为华山松，采样深度为0-10 cm。

西 南 大 学 资源 环 境 学 院 ，重 庆 ４ ０ ０ ７ １ ５
摘 要 ：从 缙 云 山森 林 土 壤 中分 离 获 得 几 株 真 菌 （ Ｊ ２ ０ １ ， Ｊ ３ Ｏ ２ ， Ｊ ４ Ｏ ３ ， Ｊ ５ Ｏ ４ ） ， 以 黑木 耳 为对 照 ， 经 愈 创 木 酚 显 色 反 应 表
２ Ｏ时 ，菌 株 Ｊ ２ Ｏｌ产 酶 最 佳 ．
关
键
词： 真 菌 ；木质 素 ； 过氧化物酶 ； 锰过氧化物酶 ； 漆 酶
文献 标 志 码 ：Ａ
中图 分 类 号 ：Ｑ９ ３ ９ ． ９
在 自然界 中，木质 素 的储 量仅 次于纤 维 素 ，据估计 全球 每年产 量约有 ６ ０ ０万亿 ｔ Ｌ １ ］ ． 木质 素是 可再 生 利
细菌与 软腐 真菌协 作使 木质 素易 于受到 真菌 的攻击 ，且可 去 除对 腐朽 真 菌有 毒 性 的物 质［ ４ － ５ ］ ． 放 线 菌对 木 质素 的降解 作用 主要 在于增 加它 的水溶 性．由于放 线菌 能 穿 透木 质 纤 维素 等不 溶 基 质 ， 在 中性 、微碱 性 土 壤或 堆 肥 中 ，放 线 菌参 与 有机 质 的初 始 降 解 和腐 殖 化． 其 中属于 链 霉 菌 的丝 状 细 菌 降解 木 质 素最 高 可 达
第 ３ ８卷 第 １ ｌ 期
Ｖｏ １ ．３ ８ Ｎｏ ． １ １
西 南 师 范 大 学 学 报 （ 自然 科 学 版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｓ ｔ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｎｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ｎａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）

土壤木质素过氧化物酶（S-Lip）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号：BC1970规格：50T/24S产品内容：试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存；临用前加入5mL乙醇溶解。

试剂三：液体10μL×1瓶，4℃保存。

临用前加入5mL蒸馏水备用。

产品说明：木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶系，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有较大的应用潜力。

木质素过氧化物酶氧化藜芦醇生成藜芦醛，在310nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：天平、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、震荡仪、甲苯、乙醇、30-50目筛（或更小）。

操作步骤：一、样本处理：土样自然风干，过30-50目筛。

二、测定操作：1、紫外分光光度计预热30min以上，波长调至310nm，蒸馏水调零。

2、将试剂二用乙醇稀释10倍备用，用多少配多少。

测定管对照管上样（g）0.10.1甲苯（μL）5050室温静置15min。

试剂一（μL）800800试剂二（μL）100-试剂三（μL）50-30℃水浴反应1h后立刻煮沸5min。

试剂二（μL）-100试剂三（μL）-5012000g常温离心10min，取上清于310nm处测定吸光值，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照顾管。

三、酶活计算公式：酶活性定义：每克土壤每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。

S-LiP活性（U/g）=△A/(ε×d)×109×V反总÷W÷T= 1.792×△A÷W。

ε：藜芦醛摩尔消光系数：9300L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，1mL=0.001L；W：土样质量，g；T：反应时间，60min；109：1mol=109nmol。

桑粒肩天牛肠道木质纤维素分解细菌的分离和鉴定刘晨娟;蔡皓;李庆;喻子牛【摘要】利用纤维素-刚果红选择培养基和苯胺蓝培养基从桑粒肩天牛肠道中筛选出一株同时具有纤维素酶活和木质素酶活的细菌.通过形态学观察和生理生化鉴定,确定为枯草芽孢杆菌.该菌在纤维素发酵培养基中,最高活力为0.51 IU· mL-1;在木质素发酵培养基中,锰过氧化物酶(Mnp)和漆酶(Lac)活力分别为0.1841 IU· mL-1(96 h)、0.0633 IU· mL-1(48 h),没有检测到过氧化物酶(Lip)活力.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2010(027)007【总页数】4页(P66-68,91)【关键词】桑粒肩天牛;筛选;纤维素;木质素【作者】刘晨娟;蔡皓;李庆;喻子牛【作者单位】华中农业大学生命科学技术学院,农业微生物学国家重点实验室,微生物农药国家工程研究中心,湖北,武汉,430070;华中农业大学生命科学技术学院,农业微生物学国家重点实验室,微生物农药国家工程研究中心,湖北,武汉,430070;华中农业大学理学院,湖北,武汉,430070;华中农业大学生命科学技术学院,农业微生物学国家重点实验室,微生物农药国家工程研究中心,湖北,武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】Q939.1近年来,全世界对能源的需求量急剧增加，加速了对有限的不可再生矿物能源的消耗。

因此，可再生的、清洁的生物质能成为人们关注的热点，其中燃料乙醇工业在世界范围内得到了广泛的发展，而以大量木质纤维素生物质材料为基础的燃料乙醇行业更是热点中的焦点[1]。

迄今较成熟的燃料乙醇的生物转化方法是以玉米、小麦等粮食为原料，但其原料成本高昂，同时受到人口增加和耕地减少的限制。

而贮存于作物秸秆中的木质纤维素来自植物的光合作用，是地球上可用于生产生物燃料最丰富、最廉价的可再生资源[2]，利用木质纤维素生产乙醇是降低燃料乙醇生产成本的根本出路。

固态发酵漆酶活性测定:酶液制取:5g发酵样品以1:20(W/Ｖ）比例用蒸馏水悬浮,２０0 ｒ／ｍin摇3ｈ，之后5000 r/min离心２0ｍin.（上清用０、45µｍ滤纸过滤,于－２0℃保存滤液，取能整除得滤液体积用于漆酶活性测定。

)酶活反应体系3、0mL（２、3mL 0、２mol/L醋酸－醋酸钠缓冲液；pＨ=４、50、5mL粗酶液稀释液;０、２mL 1mｍｏｌ/Ｌ得ABTＳ）420nm处测定吸光值得变化。

此实验固态发酵漆酶活性计算公式：Ｎ：酶液稀释倍数V总：漆酶酶活测定反应体体系得终体积（mＬ）V 酶：反应添加得酶液体积（mL): t时间内反应液在42０nm处吸光度得增加值△OＤ４2036０00: 42０nｍ处ABTS氧化态得摩尔吸光系数（L/mｏl·ｃｍ)T：反应时间（ｍｉn）Ｌ为比色皿得直径（ｃm）。

1０0mL/(0、5ｍL×5ｇ)：固态变成液态得稀释倍数液态发酵漆酶活性测定：酶活反应体系３、0mL(2、3mL 0、2ｍｏl／L醋酸—醋酸钠缓冲液;ｐH＝4、５0、5ｍL粗酶液稀释液；0、2mＬ 1mmoｌ／L得ＡBT Ｓ)N：酶液稀释倍数：漆酶酶活测定反应体体系得终体积（mL）Ｖ总V 酶:反应添加得酶液体积(ｍL）：ｔ时间内反应液在420ｎm处吸光度得增加值△OD4２0３60００：420ｎｍ处AＢTS氧化态得摩尔吸光系数(Ｌ/mol·cm)Ｔ：反应时间(min）L为比色皿得直径（cｍ)。

固态发酵锰过氧化物酶(ＭnP）活性测定：酶液制取：粗酶液制备发酵过程中每隔2 d 取 5 ｇ发酵物于250 mL 三角瓶中，加入100ｍL H2O，在200r /min 得摇床中振荡提取3 h,之后５0０0r/mｉn离心20min。

（用滤纸过滤后,取滤液用于测定MnP 酶活性。

）在4mＬ反应体系中含５０mｍol/L( ｐH 4 ～5）得乳酸钠缓冲液3、４mＬ，1、6mｍｏl/L得硫酸锰溶液0、１mL，酶液０、4 mＬ，预热至３７℃时，加1、６mmol / L得H２O2溶液0、1mL 启动反应。

旋光性 的 、 键 合 、 度 分散性 及 高度抗 生物 降解性 的芳香 高聚物 ， 绝 大多数 微生 物 的攻 击均 有 抗性 ， 交叉 高 对
因而 ， 木质素的分解特别慢 ， 而且 ， 在完整的木质组织中， 木质素是以一种物理屏障存在的， 它包围纤维素 ， 成为外围基质 ， 保护纤维素免遭微生物袭击和降解酶 的进攻 ， 降解必须先于纤维素分解 ， 其 是地球上碳素 循 环 的限速过 程 ， 木质 素 的降解 在碳 素循 环及植 物纤 维素 材料 有效 利用 中占有非 常重 要 的地位 ［ ５。 故 ２ Ｊ － １２ 木质素的降解酶系是非常复杂的体系 ， ． 目前对它的研究较多， 认为最重要的木质素降解酶有 ３ ： 种 木
ｃｓ ． ｉ ｓ）酚氧化酶 、 ｏｅｏ ｄ ｅ、 １ｘ ａ 过氧化氢酶等都参与了木质素的降解或对其降解产生一定 的影响。
收稿 日期 ： ０ ８—０ ２０ ２—１ ８ 修 回 日期 ： ０ ８—０ ２０ ２—１ ７
项目 来源 ： 广西高校百名 中青年学科带头人资助计划（ 目 Ｒ ２ ０ ０ ３ ０ ５ ； 市科学研究与技术开发计划（ ５ １４ ２ 。 项 号 Ｃ ０ ６ ８ ０ １ ）桂林 ００ １ — ） 第一作者简介：倪启亮 ， ，９ ２年生 ， 男 １８ 浙江嘉兴 ， 在读硕 士研究生 ， 从事环境 工程方 面的研究 。
和农作物废弃秸杆形式存在【 ， ｌ 它是一种量大而又可再生的有机资源。 Ｊ 能源紧张、 粮食短缺及环境污染的 日 趋严重是 目前世界各国所 面临的难题 。通过对可再生资源的转
化 利用 ， 能在有 利于 生态 平衡 的条 件 下缓 解 或解决 这些 问题 。 而这些 清 洁 、 保产 业正 作 为 一种新 的工业 环 生产 方式 日益受 到技 术发 达 国家 的重视 。

酶活性检测④分光光度法利⽤底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。

⼏乎所有的氧化还原酶都使⽤该法测定。

如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，⽽NAD和NADP在该波长下⽆吸收，脱氢酶类可⽤该法测定。

该法测定迅速简便，⾃动扫描分光光度计的使⽤对酶活⼒的快速准确的测定提供的极⼤的⽅便。

酶在⾷品加⼯中的作⽤就像⼀把双刃剑，我们要趋利避害。

酶的积极作⽤我们要加强，在⾷品加⼯过程中添加酶制剂，使其作⽤充分发挥;消极作⽤我们要尽量避免，可以通过加热等⽅法将酶灭活，消除其不利影响。

为了将酶更好地应⽤于⾷品加⼯，研究酶的性质是⼗分必要的。

⽽紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要⽅法之⼀。

下⾯我们来介绍⽤-可见分光光度计测定酶活的具体⽅法。

紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β⼀半乳糖苷酶β⼀半乳糖苷酶，⼜称乳糖酶(Lactase)。

能⽔解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从⽽提⾼乳制品的可消化性，⽤于低乳糖⽜奶和⾮结晶型浓缩⽜奶的⽣产及奶酪风味的改变，同时还可⽤于⽣产低聚半乳糖。

【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活⼒。

【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lµmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活⼒单位。

2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是⼀种⼗分重要的⽣物体防⽌氧化损伤的酶类，是⽣物体内超氧阴离⼦清除剂，保护细胞免受损伤。

SOD⼴泛存在于各类⽣物体内，所有好氧微⽣物细胞中都含有SOD。

⾃1969年Mccord等⼈⾸次发现了SOD ⽣物活性后，医学界对其医疗作⽤做了许多研究，证明它具有抗衰⽼、抗肿瘤、抗辐射、抗缺⾎、提⾼⼈体免疫⼒等作⽤，被专家称为21世纪最有前途的药⽤酶。

欧美国家已开始将其应⽤于医疗、⾷品、保健、化妆品等领域。

【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加⼊待测SOD样液，再加⼊10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒⼈光径lcm 的⽐⾊杯，在325nm波长下每隔30s测⼀次A值。

固态发酵漆酶活性测定：酶液制取：5g 发酵样品以1:20（W/V ）比例用蒸馏水悬浮，200 r/min 摇3h ，之后5000 r/min 离心20min 。

（上清用0.45µm 滤纸过滤，于-20℃保存滤液，取能整除的滤液体积用于漆酶活性测定。

）酶活反应体系3.0mL （2.3mL 0.2mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液；pH=4.50.5mL 粗酶液稀释液；0.2mL 1mmol/L 的ABTS ） 420nm 处测定吸光值的变化。

此实验固态发酵漆酶活性计算公式：5g 0.5mL 100mL L T 36000V 10)g (/U 3420⨯⨯⨯⨯⨯⨯∆⨯⨯=酶总OD V NN ：酶液稀释倍数V 总: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL ）V 酶: 反应添加的酶液体积（mL ）△OD 420: t 时间内反应液在420nm 处吸光度的增加值36000: 420nm 处ABTS 氧化态的摩尔吸光系数(L/mol ·cm)T ：反应时间（min ）L 为比色皿的直径（cm ）。

100mL/(0.5mL ×5g)：固态变成液态的稀释倍数液态发酵漆酶活性测定：酶活反应体系3.0mL （2.3mL 0.2mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液；pH=4.5 0.5mL 粗酶液稀释液；0.2mL 1mmol/L 的ABTS ）L T 36000V 10)g (/U 酶3420总⨯⨯⨯⨯∆⨯⨯=OD V NN ：酶液稀释倍数 V 总: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL ）V 酶: 反应添加的酶液体积（mL ）△OD 420: t 时间内反应液在420nm 处吸光度的增加值36000: 420nm 处ABTS 氧化态的摩尔吸光系数(L/mol ·cm)T ：反应时间（min ）L 为比色皿的直径（cm ）。

固态发酵锰过氧化物酶（MnP ）活性测定：酶液制取：粗酶液制备发酵过程中每隔 2 d 取 5 g 发酵物于 250 mL 三角瓶中，加入 100 mL H 2O ，在 200 r / min 的摇床中振荡提取 3 h ，之后5000 r/min 离心20min 。