水稻稻瘟病菌基因组中疏水蛋白的分布与聚类分析

全省稻瘟病菌无毒基因鉴定及分析摘要：为了明确无毒基因在吉林省不同稻区的分布及变异情况，将PCR检测技术与接种鉴定技术相结合，分析2014年吉林、长春、通化、四平、延边、松原、白城、辽源等稻区的24株优势单孢菌株中无毒基因的情况。

结果表明，24个优势稻瘟病菌株含无毒基因的比率较高，5个稻区的优势菌株100%含有无毒基因，松原稻区1株优势菌株PCR检测到无毒基因，但对[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]单基因品系IRBL9-W仍有致病性，说明该菌株无毒基因结构发生了变化，其他PCR结果均与接种结果相一致。

关键词：稻瘟病；抗病基因；无毒基因；；接种鉴定；PCR检测稻瘟病是世界范围内的主要水稻病害之一。

在我国各水稻栽培地区均经常发生稻瘟病，吉林省也是稻瘟病经常流行的主要地区，如果不防治可导致稻谷损失30%以上，局部田块甚至出现绝收的情况[1]。

稻瘟病的病原为稻巨座壳（Magnaporthe oryzae B.C.Couch），隶属于子囊门巨壳属。

其无性阶段为稻梨孢（Pyriculariaoryzae Cavara），属于子囊菌无性型梨孢属。

稻瘟病是完全符合基因对基因假说的病害[2-3]，稻瘟病的发生程度取决于田间菌群的无毒基因类型，当种植的水稻所含抗瘟基因与田间菌群所含的无毒基因相对应时，水稻则表现抗病；若水稻的抗病基因与菌群的无毒基因不对应，则表现感病，在适宜的气候条件下极易造成灾变。

种植抗瘟品种是防治稻瘟病最经济有效的方法，但一个抗病品种在推广3～5年后就失去对当地稻瘟病菌的抗性[4]，主要是由稻瘟病菌变异及其上升为优势菌群所致。

引起稻瘟病菌变异的因素很多[5-10]，但田间稻瘟病致病性的变异实质是田间无毒基因功能的缺失或获得[11]。

吉林省是优质粳稻主产区，粳稻种植面积超过70万hm2[12]，稻瘟病的控制对我国优质米的保障尤为重要。

截至2015年3月，已至少报道了69个抗稻瘟病位点共84个主效基因，其中24个基因已被成功克隆[13]，抗瘟基因中[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]抗谱较广，对来自13个国家的43个稻瘟病菌株均表现出很高的抗性[14]，抗瘟基因[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]对应的无毒基因已被克隆[15]，因此明确吉林省稻瘟病菌无毒基因分布情况对吉林省稻区水稻品种布局具有较好的指导意义。

第50卷第3期2021年5月福建农林大学学报(自然科学版)Journal of Fujian Agriculture and Forestry University ( Natural Science Edition )稻瘟病菌MoSCJ l 基因的生物学功能分析陈浩，王敏，杨子峰，廖煌，吴欢，凌菡，汤蔚(福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福建福州350002)摘要：以稻瘟病菌野生型菌株Guyll 为材料，利用基因敲除和回补得到稻瘟病菌的突变体\Moscj 1和互补菌株A Moscjl / MoSCJ l,并以野生型为对照,分析了 MoSCJ l 的生物学功能.结果发现:突变体b Moscj l 在基本培养基上的生长速率显著下 降,同时,MoSCJ l 基因的缺失导致突变体对细胞壁胁迫剂更加敏感;但MoSCJ l 基因的缺失并不影响稻瘟病菌的无性繁殖、 附着胞发育及致病性.这说明MoSCJ l 参与调控稻瘟病菌的营养生长和对细胞壁胁迫剂的应答过程,不参与调控该菌的无性繁殖及致病过程.关键词：稻瘟病菌；MoSCJ l ；营养生长；细胞壁完整性中图分类号：S432.44 文献标识码：A文章编号：l67l-5470(202l)03-0309-08DOI ：l0.l3323/ki.j.fafu(nat.sci.) .202l.03.003开放科学(资源服务)标识码(OS1D )Biological function of MoSCJl in Magnaporthe oryzaeCHEN Hao, WANG Min, YANG Zifeng, L1AO Huang, WU Huan, L1NG Han, TANG Wei (State Key Laboratory of Ecological Pest Control for Fujian and Taiwan Crops , Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou, Fujian 350002, China)Abstract : We obtained the MoSCJ l gene deletion mutant from the wild type Guyll of Magnaporthe oryzae and the complemented strain via gene knock-out and complementation technologies , and then analyzed the biological functions of MoSCJ l in rice blast fun ­gus. We found that the deletion of MoSCJ l significantly impaired the vegetative growth of M. oryzae on basic medium and led to high ­er sensitivity to cell wall stressors. However , the loss of MoSCJ l had no effects on the sporulation , appressorium development and pathogenicity. 1n conclusion , MoSCJ l is likely to be involved in the regulation of vegetative growth and cell wall integrity of M. oryzae , instead of the regulation of asexual propagation and pathogenicity.Key words : Magnaporthe oryzae ； MoSCJ l ； vegetative growth ； cell wall integrity稻瘟病是全球水稻生产上的重要病害之一，对水稻的产量和品质具有巨大的威胁，发生严重时能造成 整片稻田绝收.稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae )通过分生抱子传播，分生抱子在水稻叶片表面萌发产生芽管 并形成附着胞，后产生侵染栓穿透叶片的角质层和表皮细胞壁，在寄主细胞内分化产生次生菌丝并侵染邻 近细胞和组织，继而发病.内质网是由囊状、管状和泡状结构组成的一个连续的网膜系统.真核细胞中，在折叠酶、伴侣结合蛋白 等协助下，内质网对分泌性蛋白质合成、转运和加工并运输到相关的细胞部位发挥功能.为了保证蛋白质 能正确折叠和修饰,以达到天然构象从而转运到目标细胞器或分泌到胞外,细胞内部有一套严格的蛋白质 质量控制系统，一旦蛋白质由于转录翻译失败或不同条件压力等原因发生错误折叠并聚集在内质网中，内 质网就会产生压力，影响细胞的正常生理功能［'-2］.真核细胞存在两条途径调控内质网压力：非折叠蛋白响应(unfolded protein response , UPR)和内质网 相关蛋白降解(endoplasmic reticulum-associated protein degradation , ERAD)⑶.其中,ERAD 主要通过泛素 化降解内质网中错误折叠或未折叠的蛋白［4］，其包括底物识别、定位、泛素化、逆向运输和蛋白酶体降解 等步骤.底物识别水平决定底物的降解程度.蛋白质错误折叠是由于其本应在蛋白质内部的疏水区暴露在 外从而引起蛋白质之间的聚集而发生,在底物识别的过程中,热休克蛋白Hsp70家族成员(Bip/Kar2)会收稿日期：2020-07-28 修回日期：2020-l0-22基金项目：福建农林大学科技创新专项基金项目(CXZX20l9007G 、CXZX20200l4A ).作者简介：陈浩(l998-),男.研究方向：植物保护.Email : chenho998@ .通信作者汤蔚( l988-),男，讲师，博士.研究方向：真菌功能基 因 组 学 .Email : tangw@ .-310-福建农林大学学报(自然科学版)第50卷与疏水区结合促进多肽链折叠,从而避免蛋白质分子的聚集[5].与Hsp70长时间作用后的底物会被E3泛素连接酶Hrdl复合物识别⑷.Hsp40/DnaJ是一个可以调节Hsp70分子伴侣活性的蛋白质家族,Hsp40s刺激Hsp70蛋白固有的弱腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)酶活性，使其由ATP状态转变为腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)状态，从而对底物有强亲和性，促进Hsp70与多肽底物的相互作用. Hsp70家族成员通常有多个Hsp40伴侣，其特定的配对控制Hsp70伴侣参与调控特定过程.所有Hsp40均含有高度保守的75个氨基酸J结构域，该结构域与Hsp70的ATP酶结构域相互作用，促进ATP水解[7].研究表 明，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组的Hsp40/DnaJ家族中有22种蛋白质，其中包括Scjl蛋白囚.Scjl作为一种蛋白分子伴侣参与蛋白的折叠过程.已有研究发现，缺失Scjl会影响Hsp70的活性，进而影响ERAD途径中底物的识别及降解过程，最终启动细胞的凋亡程序冈.目前，有关Scjl在丝状真菌中的研究较少.本试验利用基因敲除技术获得MoSCJ l基因敲除突变体(^Moscj l)，研究其营养生长、无性繁殖、致病力及对细胞壁胁迫剂的应答等情况，以探讨MoSCJ l基因在稻瘟病菌中的生物学功能，为其他病原真菌中SCJl基因的研究提供一定的参考.1材料与方法1.1供试菌株及其他材料本研究中所用稻瘟病菌野生型菌株Guyll由福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室保存,△M oscj l突变体和互补菌株A Moscj l/MoSCJ l均由本试验获得.试验所用的水稻品种CO39、大麦种子均保存于福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室的4冷库中.完全培养基(complete medium,CM)：20x硝酸盐50mL•L_l,l000x微量兀素l mL•L_l,l000x维生素溶液l mL-LT,葡萄糖l0g-LT,蛋白胨2g-LT,水解酪蛋白l g-LT,酵母提取物l g-LT，琼脂粉l5g•L_l.基本培养基(minimal medium,MM):NaNO36g,KCl0.52g,MgSO4•7H2O0.l52g,KH2PO4 l.52g,维生素Bl0.0l g,微量元素溶液l mL,葡萄糖l0g,琼脂粉l5g.稻秆培养基(straw decoction and corn,SDC):稻秆l00g-L-l(煮沸20min,两层纱布过滤)，玉米粉40g-，琼脂粉l5g-⑼.TB3培养基:水解酪蛋白3g-LT,酵母提取物3g-LT,蔗糖20%,琼脂粉l2g-L»色氨酸缺陷型合成葡萄糖基础培养基(synthetic dextrose minimal medium without tryptophan,SD-Trp):无氨基酵母氮源6.7g,D-山梨糖醇l82.2g,缺色氨酸氨基酸粉末0.74g,葡萄糖20g,琼脂粉l5g,pH5.8[l0].LB培养基:胰蛋白胨l0g-L'1，酵母提取物5g•L_1,NaCl10g-L_1，琼脂15g-L_1;酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(yeast extract peptone dex­trose medium,YPD):葡萄糖20g-L'1，蛋白胨20g-L'1，酵母提取物10g-L'1，琼脂粉15g•L'1.试剂与仪器:潮霉素B,北京索莱宝科技有限公司；博来霉素，美国Innivogen公司；Southern杂交试剂盒,美国罗氏公司;rTaq酶、RNase,宝日医生物技术(北京)有限公司；刚果红(congo red,CR)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；microcloth,EMD Millipore公司；T100PCR仪，美国Bio-Rad公司;智能培养箱,宁波江南仪器厂;Nikon E200生物显微镜、激光扫描共聚焦显微镜，日本尼康公司；血球计数板，北京索莱宝科技有限公司；Centrifuge5420离心机，德国艾本德股份公司；PowerShot G7X Mark H相机，佳能(中国)有限公司.1.2MoScjl的系统发育分析在酵母基因组数据库中得到酿酒酵母Scjl的蛋白质序列，根据其与本试验稻瘟病菌Guyll的序列同源性比对结果，得到的同源蛋白为MoScjl.在NCBI中利用Blast比对得到一组MoScjl的同源蛋白序列，选取8个不同物种的序列在MEGA5.0软件中采用邻接法(neighbor-joining,NJ)建立系统发育树[11].1.3MoSCJ l突变体的获得1.3.1MoSCJ l基因的敲除以稻瘟病菌野生型菌株Guyll基因组为模板，以MoSCJ1-F1/MoSCJ1-F2和MoSCJ1-F3/MoSCJ1-F4(表1)两对引物对MoSCJ l基因上游和下游各1000bp左右的DNA片段进行PCR 大量扩增.与此同时，将pCX62质粒作为模板，以引物HYH-F/HYH-R(表1)对潮霉素磷酸转移酶基因全长进行PCR扩增,并对扩增结果进行纯化回收.将扩增好的MoSCJ l基因上游和下游各1000bp左右的第3期陈浩等:稻瘟病菌MoSCJ l基因的生物学功能分析-311-DNA片段及潮霉素磷酸转移酶基因全长中的目的片段进行融合PCR,获得长度约为3400bp的重组片段.以引物MoSCJ1-F1/MoSCJ1-F4（表1）对重组片段进行大量扩增,纯化回收所得片段，将回收产物用于原生质体的转化[12].用潮霉素（600愿-mf）筛选转化子.表1试验所用引物Table1Primers used in this study序列（5'f3‘）引物MoSCJl-Fl MoSCJ1-F2 MoSCJ1-F3 MoSCJ1-F4 MOSCJ1-BY-F ACTATAGGGCGAATTGGGTACCGCATCGTCTCCATGGCTGA GCGCCGAATTCGATATCAAGCTTGGCACCTAAGGCTCACTGC TGCCGACCGGGCCGGCCGGATCCGCGAAGGTGCGGTTAGAC GGTGGCGGCCGCTCTAGACGATGTTGTCAACCTCGATG CCTCAGTGAGGTAGCAAGHY-R GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAAMoSCJ1-KO-F MoSCJl-KO-R HYH-F CTGAGTTCCAGTGGGAGAGG CCTCCTTCCAGAACAGATCG TGGAGCTAGTGGAGGTCAACAATGAATGHYH-R CGGTCGGCATCTACTCTATTCCTTTGC GFP-R CGGTGGTGCAGATGAACTTCNP-SCJ1-F NP-SCJ1-R ACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTCAAATTGGTTGAACTTCTCCTGTCCGTACT CACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCAACTCATCATGACCGGAGG1.3.2MoSCJ1突变体的鉴定用灭菌的牙签挑选转化子至CM培养基上，培养4d后，用CTAB法粗提转化子DNA[I3然后以粗提的转化子DNA为模板，用引物MoSCJ1-KO-F/MoSCJ1-KO-R（表1）进行PCR验证，阳性对照以野生型菌株Guy11基因组为模板,阴性对照以无菌水为模板，在阳性对照有条带、阴性对照无条带的前提下,对无条带出现的转化子进行下一步验证;以无条带的粗提转化子DNA为模板，用引物MoSCJ1-BY-F/HY-R（表1）再次进行PCR验证，阳性对照和阴性对照同上，在阳性对照、阴性对照均无条带的前提下，有条带的转化子即为突变体.1.4回补菌株的获得1.4.1回补载体的构建以野生型菌株Guy11基因组为模板，以引物NP-SCJ1-F/NP-SCJ1-R（表1）进行PCR扩增，得到长度为4247bp的片段.将其与pYF11骨架片段共同转入XK-125酵母感受态细胞中，并于SD-Trp培养基上培养24h.以酵母转化子为模板，用引物MoSCJ1-KO-F/GFP-R（表1）进行PCR验证,取有条带的酵母转化子在YPD培养基中摇培18h,提取质粒.将酵母质粒转入大肠杆菌中,再进行PCR验证,并将结果测序，获得回补载体.1.4.2回补菌株的鉴定将回补质粒转入突变体的原生质体中，培养4d后挑出转化子，在激光扫描共聚焦显微镜下用博来霉素（200jig-mL_1）进行筛选.1.5MoSCJl突变体的生物学表型分析1.5.1突变体在不同培养基上的营养生长从保菌袋中取出野生型菌株Guy11、突变体和回补菌株的存菌滤纸片分别接种于CM培养基上，于28T黑暗培养箱中培养5d.然后在各菌落边缘切取3mmX3mm 的菌块并接种于CM、MM、SDC培养基上，每个菌株设3个重复.在28弋黑暗培养箱中培养7d后,测量、记录其直径并拍照.1.5.2突变体对细胞壁胁迫剂的响应从野生型菌株Guy11、突变体和回补菌株的菌落边缘切取3mmX 3mm的菌块，分别接种于含有胁迫剂CR（400ig•mL"1）的CM培养基上，每个菌株设3个重复.在28°C 黑暗培养箱中培养7d后，测量、记录其直径并拍照，同时计算抑制率,抑制率=（空白组菌株直径-处理组菌株直径）/空白组菌株直径X100%.1.6MoSCJ l突变体的产抱量测定及分生抱子梗观察1.6.1产孢量的测定从野生型菌株Guy11、突变体和回补菌株的菌落边缘切取3mmX3mm的菌块，分别接种于SDC培养基上，每个菌株设3个重复，在28C黑暗培养箱中培养5d.刮去表面气生菌丝,置于黑光灯下培养5d后,用无菌水冲洗培养基,2层microcloth过滤于10mL离心管中得到抱子液，并最终定容・3l2・福建农林大学学报(自然科学版)第50卷至2mL.在血球计数板上统计抱子数目，并记录数据.l.6.2分生孢子梗的观察菌株培养方法同l.6.l.切2cmx2cm的菌块于载玻片上，菌丝面贴载玻片，黑光灯下培养2d后，在Nikon E200生物显微镜下观察分生抱子梗产抱情况并拍照.试验重复3次.1.7MoSCJ l突变体的附着胞萌发试验抱子液的制备方法同l.6.l,调整抱子液浓度为8xl05个・mL-l・将疏水性盖玻片置于载玻片上，向盖玻片上滴40|xL抱子液后，将载玻片放入保湿盒中，于28°C黑暗培养箱中培养,分别于4、8、l2、24h在Nikon E200生物显微镜下观察分生抱子的萌发情况并拍照,每个菌株统计l00个抱子，计算抱子萌发率和附着胞形成率.试验重复3次.1.8MoSCJ l突变体的侵染试验l.8.l水稻侵染种植感病水稻品种CO39,于26C温室中培养至三叶一心期.抱子液的制备方法同l.6.l，用血球计数板调整抱子液浓度为8xl05个・mL-1,向抱子液中加入0.2%(体积分数)明胶，混匀，用喷壶均匀地喷洒在水稻叶片上.然后将水稻置于28C黑暗培养箱中培养24h,再放在接种室培养6d,观察水稻的感染情况,统计并记录病斑等级［l4］，对感病水稻叶片进行拍照.试验重复3次.l.8.2离体大麦侵染种植大麦,于温室中培养9d.抱子液的制备方法同l.6.l,用血球计数板调整抱子液浓度为8xl05个・mL-1,向抱子液中加入0.2%(体积分数)明胶.剪取长度一致的大麦叶片，滴20応抱子液于大麦叶片背部，将大麦叶片置于28C黑暗培养箱中保湿培养24h.撕取大麦背部表皮，在Nikon E200生物显微镜下观察菌丝侵染情况并拍照.试验重复3次.1.9数据处理用Excel20l0软件对试验数据进行分析和处理，用DPS数据处理系统进行单因素统计分析.2结果与分析2.1MoScjl系统发育分析系统发育树分为两大分支,MoScjl与酿酒酵母S288C具有高度同源性,且从整体来看与其他7个物种裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、粘菌(Dictyostelium discoideum AX4)、果蝇(Drosophila melanogaster)、利什曼原虫(Leishmania donovani)、秀丽线虫(Caenorhabditis ele-gans)、人类(Homo sapiens)的同源蛋白序列均有相似性.由此推测这些物种的Scjl同源蛋白在功能上可能具有保守性.85---------------------------------------------------酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C98--------------------------------------------Magnaporthe oryzae---------------------------------裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe-------------------------------拟南芥Arabidopsis thaliana99-------------------------------------------------ttW Dictyostelium discoideum AX4---------------------------------------------果蝇Drosophila melanogaster59------------------------------------------------禾Leishmania donovani88-----------------------------------------Caenorhabditis elegans91-----------------------------人类Homo sapiens图l稻瘟病菌Scjl与其他8个物种同源蛋白序列的系统发育树Fig.l Phylogenetic tree of the homologous amino acid sequences of Scjl in M.oryzae and other8species2.2MoSCJ l突变体的鉴定利用同源重组原理构建了基因敲除载体(图2A)，通过原生质体转化的方法，得到具潮霉素抗性的转化子.粗提转化子基因组DNA,利用基因内部引物、臂外引物进行PCR验证，基因内部引物验证无条带、臂第3期陈浩等:稻瘟病菌MoSCJl 基因的生物学功能分析・313・外引物验证有条带的转化子即为突变体.结果显示,转化子'Mosc/1-4、'Mosc/1-22、'Mosc/1-23和'Mosc/1 - 37为符合条件的MoSCJ l 基因敲除突变体（图2B ）.随机选取'Moscj l -22突变体用于后续试验.2.3 MoSCJ 1突变体的营养生长图3显示,突变体菌株在CM 和SDC 培养基上生长的直径与野生型菌株和回补菌株相比无明显差异, 而在MM 培养基上生长的直径相比于野生型菌株和回补菌株极显著缩小（P <0.01）.可见,MoSCJ l 参与调 控稻瘟病菌在基本培养基上的营养生长过程.A 1 kbB MoSCJl -Guyll -----------------------——---------------------- 寻 gdDsowd 0 旨owd 寸\ hph I\Moscj\2F 2RA.MoSCJl 基因的敲除策略；B.PCR 验证结果（Guyll 为以野生型菌株为模板的阳性对照,Mock 为以无菌水为模板的阴性对照）.图2 MoSCJ1基因的靶向敲除Fig.2 The targeted deletion of MoSCJl geneB ■Guyll □ ^Moscjl**表示同一培养基下不同菌株之间的差异极显著(P <0.01).图3 野生型菌株Guy11、突变体NMoscj1、回补菌株^Moscj1/MoSCJ1在CM 、MM 、SDC 培养基上的营养生长情况(A )和菌落直径(B )Fig.3 Vegetative growth (A) and colony diameters ( B) of Guyl 1, 'Moscjl and 'Moscjl /MoSCJl on CM , MM, SDC plates2.4 MoSCJ 1突变体对细胞壁胁迫剂的响应相比于野生型菌株和回补菌株,突变体对CR 更加敏感（图4）,抑制率呈现极显著差异（P <0. 01）.这 说明MoSCJ l 参与调控稻瘟病菌对细胞壁胁迫剂的应答过程.CK 为不加入胁迫剂的对照组；CR 为加入刚果红的处理组.**表示差异极显著（P <0.01）.图4 野生型菌株Guy11、突变体\Moscj1、回补菌株^Moscj1/MoSCJ1在含有CR 的CM 培养基上的生长情况（A ）和抑制率（B ）Fig.4 The growth （A ） and inhibition rate of Guyll , 'Moscjl and 'Mosc/l/MoSCJl on CM plates containingCR・3l4・福建农林大学学报（自然科学版）第 50 卷2.5 MoSCJ l 突变体的无性繁殖结果显示，野生型菌株、突变体和回补菌株均能产生大量抱子（图5A ）,且三者之间的产抱量无显著 差异（图5B ）.由此推测MoSCJ l 不参与调控稻瘟病菌的无性繁殖过程.AB 二 A n u 204 O 1612Guyl 1 bMoscj\ NMoscj'l MoSCJX 菌株类型旨owaUUSOW 己。

稻瘟菌WD 重复功能域中SSR 的变异及其对蛋白结构的影响*刘　林,李成云**,高　源,杨　静,查友贵,胡艳玲(农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室,农业生物多样性应用技术国家工程研究中心,云南昆明　650201)摘要:含WD 重复功能域的蛋白能够参与信号传导㊁转录调控㊁RNA 剪切㊁细胞的凋亡等多种功能,在病原菌与寄主植物蛋白互作的过程中扮演着重要的角色㊂本研究分析了稻瘟病菌基因组中94个WD 功能域基因编码区和调控区中SSR 的组成㊁分布,并检测了7个蛋白编码区中SSR 的变异及其对蛋白二级结构的影响㊂结果表明,WD 功能域基因的编码区和调控区中都含有大量的SSR,但是SSR 在这些基因的外显子区㊁内含子区㊁5′⁃UTR 和3′⁃UTR 区中SSR 的组成和分布均不相同;编码区中三碱基和六碱基SSR 分布较多,这些SSR 基序大都表现为GC 含量较高和其所编码的亲水性氨基酸出现的频率远远高于疏水性氨基酸的特点㊂且检测的7个WD 功能域基因的编码区中的SSR 位点均具有丰富的多态性,通过Antheprot (DPM)软件预测发现:SSR 的变异对蛋白的二级结构有一定影响㊂这暗示着SSR 的变异对致病相关基因的变异起着十分重要的作用㊂关键词:稻瘟病菌;微卫星重复序列;WD 重复功能域;蛋白二级结构中图分类号:Q 75 文献标识码:A 文章编号:2095-0845(2011)04-376-07SSR Variation in the WD Repeats Domain Genes and It′s Effectson Protein Structure of Rice Blast Fungus ,Magnaporthe oryzaeLIU Lin,LI Cheng⁃Yun **,GAO Yuan,YANG Jing,ZHA You⁃Gui,HU Yan⁃Ling(Key Laboratory of Agro⁃Biodiversity and Pest Management of Education Ministry of China ,NationalEngineering Research Center Agro⁃Biodiversity Applied Technology ,Kunming 650201,China)Abstract :WD repeats domain containing genes can participate in signal transduction,transcriptional regulation,RNA splicing and apoptosis and so on.WD repeats domain containing genes play important roles in plant⁃pathogen interactions.SSR component and distribution in coding and regulation region of 94WD repeats domain containing genes were analyzed in Magnaporthe oryzae ,and the SSR variation in 7coding regions of WD repeats domain contai⁃ning genes was checked and analyzed its effect on secondary structure of protein.The result showed that abundance of SSRs were in the coding region and regulation region of WD repeats domain containing genes,but both SSR com⁃ponent and distribution were different among extron,intron,5′⁃UTR and 3′⁃UTR;tri⁃nucleotide and hexa⁃nucleotide SSR in coding region were more than other region,and the frequency of hydrophilic amino acids was relatively high⁃er.In additional,7SSR loci of coding region including SSR were polymorphism,and SSR polymorphism of these lo⁃ci can affect the secondary structure of protein.The data of this study indicated that the mutation of SSR might play an important role for pathogenic gene mutation.Key words :Magnaporthe oryzae ;Microsatellite;WD repeats domain containing genes;Protein secondary stucture植物分类与资源学报　2011,33(4):376~382Plant Diversity and Resources DOI :10.3724/SP.J.1143.2011.10237***基金项目:国家 973”项目(2011CB100403),国家自然科学基金(30860161/C14)通讯作者:Author for correspondence;E⁃mail:li.chengyun@;Tel:0871⁃5227552收稿日期:2010-12-13,2011-02-18接受发表作者简介:刘林(1980-)女,讲师,研究方向为分子植物病理和植物病害的发生与流行㊂E⁃mail:liulin6032@　WD重复功能域是一类含有多个高度保守的WD基元的蛋白质㊂该类蛋白质家族参与了信号传导㊁转录调控㊁RNA剪切㊁细胞凋亡㊁细胞骨架合成㊁纺锤体的形成和液泡的物质交换等多种功能(Nakayama等,1997;Cerna和Wilson,2005; Welcker和Clurman,2008;Hopfer等,2006;Lau 等,2009)㊂刘红美等(2007)用RNA干涉对水稻WD结构域基因的功能研究表明,水稻中含有WD结构域的基因可能参与了水稻的再分化以及水稻性器官的发育调控等功能㊂可见含WD功能域的基因在生物体中具有重要的调节作用㊂但是关于稻瘟病菌WD功能域基因的研究尚未见报道㊂SSR是指由单㊁双㊁三㊁四㊁五和六核苷酸重复单元串联排列的简单重复序列㊂无论是原核生物还是真核生物基因组中都有SSR分布,其性质由重复单元的组成㊁长度及其在基因组中的位置决定㊂早期人们均认为SSR序列为垃圾序列㊂但是随着对SSR序列研究的不断深入,人们改变了这一看法㊂近来,已有研究表明无论是在基因的编码区,还是调控区,SSR的扩张或收缩能够导致基因功能的丧失或获得,或者通过影响转录或翻译水平而对基因的表达进行调节等(Li等,2004;Cummings和Zoghbi,2000;Rocha 和Blanchard,2002)㊂如在肌强直性萎缩疾病中,蛋白激酶3′⁃UTR的CTG三碱基重复大于50次重复时将会降低蛋白激酶的活性,进而影响RNA的表达,导致肌强直性萎缩疾病的发生(Amack和Mahadevan,2001;Seznec等,2001)㊂编码区中SSR的扩张或收缩对基因功能的影响能够引起胚系的不稳定性和体细胞的易变性(Zoghbi和Orr,2000)等㊂但是,SSR的扩张或收缩对基因功能的影响也仅在一些SSR变异与人类疾病和酵母相关的研究中有报道,而在植物致病性真菌中尚未见报道㊂稻瘟病是世界水稻生产上的主要病害,且是研究病原物 植物相互作用的模式系统之一㊂稻瘟病菌和水稻基因测序的完成,为研究稻瘟病菌与水稻的互作提供了很好的平台㊂第五版基因注释的稻瘟病菌基因组序列的全长为38.8Mb (Dean等,2005),编码蛋白质的开放阅读框架(ORF)共12841个,最新公布的基因编码区的总长为19888236bp,占整个基因组序列的47.8%㊂作者利用这些序列,采用软件和手工查找相结合的方式,分析了含WD功能域的基因序列以及这些基因上下游各1000bp范围的核苷酸序列,对其中大于15bp,且匹配值大于80%的SSR进行了系统分析,并对这些基因中SSR与功能域之间的位置关系进行了分析,在此基础上,初步分析了SSR的扩张或收缩对蛋白二级结构的影响㊂为揭示稻瘟病菌WD功能域基因编码区中SSR的变异对基因功能的潜在影响奠定了基础㊂1　材料与方法1.1　材料本研究所使用的材料是从第五版公布的组成稻瘟病菌的12841个基因中,预测为含WD功能域的基因的全部核苷酸序列和其上下游各1000bp的核苷酸序列;以及这三类基因的氨基酸序列㊂通过http://www.broad. /annotation/genome/magnaporthe_oryzae/网站下载核苷酸序列和氨基酸序列㊂1.2　方法1.2.1　SSR的组成及分布频率分析　本研究利用Gary Benson博士编写的专门程序(Benson,1999),以大于15bp,匹配值为80%(指前后2个重复单元中相匹配的碱基数在80%)的标准进行查找后,对互相重叠和出现遗漏的部分进行人工校正和补充㊂为叙述方便,本研究将所有可循环的序列及与其互补的序列归为一类㊂即:将一核苷酸重复序列归为A㊁C两类;二核苷酸重复序列归为AC㊁AG㊁AT和CG4类,3核苷酸重复序列归为10类;4核苷酸重复序列归为33类;5核苷酸重复序列归为102类;6核苷酸重复序列可归为350类㊂如3核苷酸重复序列中,AAG基序代表了所有AAG㊁AGA㊁GAA㊁CTT㊁TCT和TTC的SSR序列㊂1.2.2　SSR的变异对基因功能的初步分析　利用Map Chart2.1对编码区中含有SSR的基因进行SSR和功能域之间的位置关系进行定位,再用7对本课题组开发设计的具有较高稳定性的SSR引物对采自云南省不同地区的48个稻瘟病菌进行SSR位点变异的分析,在此基础上通过Antheprot(DPM)(Deléage等,2001)对SSR的扩张或收缩对基因的二级结构的影响进行了分析,初步推测SSR的变异对含WD重复功能域蛋白质结构的影响㊂2　结果与分析2.1　SSR的组成及分布频率根据/annotation/7734期 刘林等:稻瘟菌WD重复功能域中SSR的变异及其对蛋白结构的影响 genome /magnaporthe_oryzae /网站公布的12841个稻瘟病菌的ORF 和对基因功能的预测,共找到94个含WD 功能域的基因㊂其中80个含WD 重复功能域的基因中含有内含子1~7个不等(共有内含子198个)㊂在这些基因的编码区㊁内含子区以及5′⁃UTR 和3′⁃UTR 区中都含有丰富的SSR (表1)㊂在94个基因中有55个基因的编码区或调控区都含有SSR (共113个),约占该类基因总数的58.5%,在这些含有SSR 的基因中,平均每个基因或基因的调控区至少含有两个SSR㊂但是,SSR 在这类基因的编码区及其调控区中SSR 的分布是不均一的,在5′⁃UTR 的数量最多,共38个;其次为3′⁃UTR,共37个;内含子区最少,仅11个㊂而且各种重复类型的SSR 在基因编码区㊁内含子区以及5′⁃UTR 和3′⁃UTR 区的分布也不均一㊂单碱基㊁二碱基㊁四碱基和五碱基SSR 在基因的调控区(5′⁃UTR㊁3′⁃UTR 和内含子区)分布最多,而在基因的外显子区均未检测到SSR;在基因的外显子区三碱基和六碱基SSR 分布最多,在基因的调控区分布都较少㊂从表2中可见,20个含WD 重复功能域的基因编码区中共含有27个SSR,其中六碱基SSR 有15个,三碱基SSR 有12个,均未检测到单碱基㊁二碱基㊁四碱基和五碱基SSR㊂其中完整的SSR 有7个,其匹配值均为100%,其余的为非完整SSR,其匹配值均在85%以上㊂在三碱基SSR 中,除了AAG (MGG _04802.5)外,其它的三碱基SSR 均存在G +C 含量较高的特点;在六碱基SSR 中,G+C 含量大于50%的SSR 共有9个,占六碱基SSR 总数的64%以上㊂在SSR 所编码的氨基酸中,天冬氨酸(D)最多,其所占有的基因数也最多,共有10个,其它依次为:谷氨酸(E)6个,甘氨酸(G)5个,丙氨酸(A)和赖氨酸(K)各4个,丝氨酸(S)个,苏氨酸(T)㊁精氨酸(R)和亮氨酸(L)各2个,脯氨酸(P)1个㊂从SSR 编码的氨基酸看,亲水性氨基酸出现的频率远高于疏水性氨基酸出现的频率㊂2.2　SSR 的变异及其功能分析为了分析SSR 的变异对含有WD 重复功能域基因功能的影响,本研究用采自云南省不同稻区的48个稻瘟病菌菌株,检测了7个含WD 重复功能域基因中含SSR 位点区域的多态性,初步分析含SSR 位点的变异情况(图1)㊂测量各片表1　SSR 在WD 功能域不同基因中的分布Table 1　The distribution of SSR sequence within different regions of WD repeats domain genes in Magnaporthe oryzae区域Region单核苷酸重复Mono⁃nucleotide二核苷酸重复Di⁃nucleotide三核苷酸重复Tri⁃nucleotide四核苷酸重复Tetra⁃nucleotide五核苷酸重复Penta⁃nucleotide六核苷酸重复Hexa⁃nucleotide合计Total 外显子Extron 00120015275′⁃UTR 2156303383′⁃UTR233551037内含子Intron 711211图1　引物MGG06387的琼脂糖凝胶电泳图和聚丙烯酰胺凝胶电泳图M 为分子量标记,片段大小依次为100㊁250㊁500㊁750㊁1000和2000bp;图A 中1~18为稻瘟病菌样品扩增产物,CK 为阴性对照;图B 中1~45为稻瘟病菌样品扩增产物Fig.1　The Spectrum of polyacrylamide gel electrophoresis of both primers MGG06387M means marker DL⁃2000whose size was 100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp and 2000bp respectively;1-18standedfor DNA samples and ck standed for Negative control in figure A.1-45standed for DNA samples in figure B873 植物分类与资源学报 第33卷表2　稻瘟病菌WD功能域基因的编码区中SSR的分布及其编码的氨基酸情况Table2　SSR distribution and coding amino acid in the coding⁃region of WD repeat domain in Magnaporthe oryzae基因编号# Gene code SSR基序Motif of SSR氨基酸序列*Sequence of amino acidSSR长度SSR repeats(bp)SSR在基因中的起始位置SSR start codon匹配值Percent match(%)MGG_03198.5CATCGG DA DA DA DA DA DA D4086595 MGG_04802.5AAG KKKKKKSKK2784693MGG_03597.5TCG CCT P DDDDDEEDDDEE 1823256726218987MGG_08345.5GAC TTTV TTT218790 MGG_01711.5TCG DDDDD151390100MGG_04473.5AGGTCGCGC QDEEEESRSRSRS172014144099495MGG_02743.5TCC EEEEEEEEEEE3217297 MGG_14350.5CGG GGG P G1541887 MGG_05325.5GGC GGGGGGG231991 MGG_06100.5GGC GGGGGG184394100MGG_00590.5GTCTCCTTTTCCTTGDDDDDDDDKDKDKDKDKEKEKEK21232034431627161295100100MGG_10955.5TTTTCCTGGTGC G KEKEKEKET G TSTS2618325232309694MGG_08178.5TCCTGC LLL RL R18265394 MGG_09313.5TCATCC EDEDEDEDE2615192 MGG_06387.5GAGTCG DSDSDS18237100 MGG_06389.5CAAGCT L EL EL E182291100MGG_02569.5GGCGTCTTC AAAAAADDEDED1918296812348994MGG_03150.5GGATGGCCCCCG D G D G ERAA G A G1919699109595MGG_08829.5CCGCCC PPPPPPP20684100 MGG_10590.5GCGCCG SA G A GG1833194注:#字体加粗的基因为稻瘟病菌基因组中新老版本中功能预测相同且SSR位点发生变异的基因;*下划线的为亲水性氨基酸,字体加粗为未分类的氨基酸,其余为疏水性氨基酸Note:#The gene of overstriking letter means that the fifthly published genes are same as fourthly published genes and the SSR locus are instable;*underline is hydrophilic amino acid;overstriking letter is not classified amino acid;others are hydrophobic amino acid段距上样孔的距离,并通过Marker计算出各片段的大小,将其与已测序菌株70-15的片段大小进行比较,其结果表明(表3),在所检测的含有SSR的位点均发生了变异,变异的幅度在13~46bp之间㊂若发生的变异均为SSR的扩张或收缩引起,那么这些SSR扩张或收缩与用于基因组测序且已公布序列的菌株70-15相比,其重复次数增加或减少了3~15次㊂尤其发生变异的MGG06387.5发生变异的位点在基因的功能域内(图2)㊂为更好地理解SSR的重要性,仔细分析了基因编码区中SSR与功能域之间的位置关系㊂从图2SSR与各基因功能域的位置关系可以看出,SSR与功能域之间的位置没有固定的模式㊂有些SSR分布离功能域较远,如MGG_10995.5和MGG_03597.5等,有些很近,如MGG_02743.5和MGG_05325.5等,有些则直接分布在功能域内,如MGG_04473.5和MGG_06387.5等4个㊂位于N端,与起始密码子相差小于100bp的基因有MGG_03150.5(10bp)㊁MGG_05325.5(19bp)和MGG_08345.5(87bp)共3个㊂另外SSR在编码区的数量表现为1~3个不等,最9734期 刘林等:稻瘟菌WD重复功能域中SSR的变异及其对蛋白结构的影响 多的为在基因编码区含有一个SSR 的基因,共有14个;其次为含有二个SSR 的基因,共有5个;最少的为含有三个SSR 的基因,有1个㊂位于C 端,与终止密码子相差不超过100bp 的有MGG_00590.5和MGG_06389.5㊂根据试验结果(表3),估算出SSR 发生变异表3　不同位点中SSR 的变异情况Table 3　The variation of SSR in different loci基因编号Gene code SSR 基序Motif of SSR实际产物大小Identified product size (bp)参考序列产物大小Reference sequence product size (bp)最大增加重复次数Largest repeat⁃added最小减少重复次数Smallest repeat⁃decreasedMG00590GAC 335~375329150MG01711CGA 280~30529344MG02743GAG 240~28026066MG03150GGATGG 237~27325533MG06387CGACTC 242~25526003MG06389AGCTTG 244~25626203MG08829CCGCCC237~28125543图2　基因中的SSR 与功能域间的位置关系图中START 为基因的5′端,即起始密码子起始的位置,但未包含起始密码子,D1⁃S㊁D2⁃S 和D3⁃S 分别代表各功能域的起始点,D1⁃E㊁D2⁃E 和D3⁃E 分别代表各功能域的终止点,括号内为SSR 的基序,括号外为的数字为SSR 重复的次数㊂END 为该基因的3′端,即终止子的位置Fig.2　The relationship between SSR and functional domainThe START means 5′⁃terminal or the location of start codon was excluding the base of start codon;D1⁃SD2⁃S and D3⁃S show thestart site of functional domain,D1⁃E D2⁃E and D3⁃E show the end site of it;the motif of SSR was show in bracket;and the number out of the bracket means the repeats;the END means 3′⁃terminal of gene083 植物分类与资源学报 第33卷的幅度,并以此为依据在各基因SSR所编码的氨基酸处增加或减少SSR所编码的氨基酸数量(增加或减少最大SSR重复数量),通过软件An⁃theprot预测SSR扩张或收缩后对该基因二级结构产生的影响(图3)㊂从图3中可以看出SSR 重复次数的增加或减少能够对基因多个位点处的二级结构产生影响,这些影响包括片层㊁螺旋㊁转角和卷曲的增加或减少,以及这些结构的加长或缩短㊂例如在基因MGG00590中,当SSR减少15次重复后,引起了该基因25处二级结构发生变异㊂3摇讨论作者通过查找和分析稻瘟病菌WD功能域基因编码区和调控区中的SSR发现,这些基因的调控区和编码区中均含有丰富的SSR,其中编码区中的SSR均为三碱基SSR或六碱基SSR,且G+C含量较高的SSR所占的比例较大,这与李成云等(2005)对稻瘟病菌阅读框架中SSR的组成及其分布特点的研究结果相同㊂而且在WD功能域基因编码区中,SSR编码的亲水性氨基酸出现的频率远高于疏水性氨基酸出现的频率(表2)㊂蛋白质的二级结构与通过对WD重复功能域基因中SSR的多态性检测结果表明:含有SSR的位点是易于变异的㊂而且通过软件预测稻瘟病菌含WD 重复功能域基因中SSR的扩张或收缩对该蛋白二级结构影响的结果表明编码区SSR重复次数的增加或减少可直接影响到蛋白质的二级结构㊂图3　通过Antheprot(DPM)预测SSR变异对含WD重复功能域蛋白二级结构的影响红色三角型表示发生变异的区域;蓝色标识为α⁃螺旋,绿色为β⁃转角,黄色为β⁃片层,浅蓝色为卷曲Fig.3　Predicted SSR variation effecting on protein including WD repeats domain secondary structure by Antheprot(DPM) Variable regions were highlighted by red solid triangle;the blue,green,yellow and light blue meanα⁃helix,β⁃Turnsβ⁃sheet and coil,respectively183 4期 刘林等:稻瘟菌WD重复功能域中SSR的变异及其对蛋白结构的影响 这与作者对稻瘟病菌蛋白激酶基因中SSR易变性检测的结果(刘林等,2010)相似㊂因此蛋白质二级结构的变化对蛋白质的空间结构会产生一定的影响,从而影响到基因的功能㊂这也可能是稻瘟病菌致病性易于变异的原因之一㊂但是,稻瘟病菌WD功能域基因中SSR的变异对该类基因功能的影响以及其与稻瘟病菌致病性之间的关系还有待进一步的研究㊂〔参　考　文　献〕Amack JD,Mahadevan MS,2001.The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation[J].Human Molecular Genetics,10 (18):1879 1887Benson G,1999.Tandem repeats finder:a program to analyze DNA sequences[J].Nucleic Acids Research,27:573 580 Cerna D,Wilson DK,2005.The structure of Sif2p,a WD repeat protein functioning in the SET3corepressor complex[J].Jour⁃nal of Molecular Biology,351(4):923 835 Cummings CJ,Zoghbi HY,2000.Trinucleotide repeats:mechanisms and pathophysiology[J].Annual Review of Genomics and Hu⁃mam Genetics,1:281 328Dean RA,Talbot NJ,Ebbole DJ et al.,2005.The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae[J].Nature,434 (7036):980 986Deléage G,Combet C,Blanchet C et al.,2001.ANTHEPROT:An integrated protein sequence analysis software with client/server capabilities[J].Computers in Biology and Medicine,31(4): 259 267Hopfer U,Hopfer H,Jablonski K et al.,2006.The novel WD⁃repeat protein Morg1acts as a molecular scaffold for hypoxia⁃inducible factor prolyl hydroxylase3(PHD3)[J].The Journal of Biolog⁃ical Chemistry,281(13):8645 8655Lau C,Bachorik JL,Dreyfuss G,2009.Gemin5⁃snRNA interaction reveals an RNA binding function for WD repeat domains[J].Nature Srructural and Molcular Biology,16:486 491Li CY(李成云),Li JB(李进斌),Zhou XG(周晓罡)et al., 2005.Frequency and Distribution of Microsatellites in Open Reading Frame of Rice Blast Fungus,Magnaporthe grisea[J].Chinese Journal Rice Science(中国水稻科学),19(2):167 173Li YC,Korol AB,Fahima T et al.,2004.Microsatellites within genes:structure,function,and evolution[J].Molecular Biolo⁃gy Evolution,21(6):991 1007Liu HM(刘红美),Li XY(李晓瑜),Liu YG(刘耀光),2007. 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SSR variation in the protein kinase genes and it′s effects on pro⁃tein structure of rice blast fungus Magnaporthe grisea[J].Myco⁃systema(菌物学报),29(5):698 706 Nakayama J,Saito M,Nakamura H et al.,1997.TLP1:a gene enco⁃ding a protein component of mammalian telomerase is a novel member of WD repeats family[J].Cell,88:875 884 Rocha EPC,Blanchard A,2002,Genomic repeats,genome plasticity and the dynamics of Mycoplasma evolution[J].Nucleic Acids Research,30(9):2031 2042Seznec H,Agbulut O,Sergeant N et al.,2001.Mice transgenic for the human myotonic dystrophy region with expanded CTG repeats display muscular and brain abnormalities[J].Human Molecular Genetics,10(23):2717 2726Welcker M,Clurman BE,2008.FBW7ubiquitin ligase:a tumour suppressor at the crossroads of cell division,growth and differen⁃tiation[J].Narure Reviews Cancer,8:83 93 Zoghbi HY,Orr HT,2000.Glutamine repeats and neurodegeneration [J].Annual Review of Neuroscience,23:217 237283 植物分类与资源学报 第33卷。

稻瘟菌激发子诱导水稻蛋白的差异表达研究的开题报告题目：稻瘟菌激发子诱导水稻蛋白的差异表达研究摘要：稻瘟菌是危害水稻生产的重要病原菌之一，而水稻抗病基础研究中，蛋白质组学研究在发挥着越来越重要的作用。

本研究旨在通过稻瘟菌激发子诱导水稻蛋白的差异表达研究，探究水稻与稻瘟菌互作的生理和分子机理，为水稻抗病育种提供基础理论支持。

介绍：水稻（Oryza sativa）是世界上主要的粮食作物之一，然而稻瘟病（blast disease）是危害水稻生产的重要病害之一，给全球水稻的栽培和安全带来了巨大的威胁。

稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）对水稻的感染在病害发生期间产生大量的代谢产物、蛋白质和其他生物分子，从而导致水稻的细胞病理学变化和生理生化反应。

从蛋白质组学的角度来研究水稻在感染稻瘟菌过程中的基因表达调控和蛋白质的功能变化，可以为探究水稻与稻瘟菌互作的分子机理和抗病育种提供关键的信息。

方法：本研究将采用稻瘟菌激发子刺激水稻叶片，利用蛋白质组学技术（比如二维凝胶电泳和质谱分析）检测水稻叶片在稻瘟菌诱导下的蛋白质差异表达情况，寻找与水稻防御反应相关的蛋白质，探究水稻在抵御稻瘟菌感染过程中的分子机理。

同时，利用生物信息学方法分析差异表达蛋白质的功能和富集通路，为研究提供更加详细的信息和启示。

预期结果：通过本研究，我们预期可以筛选出一些蛋白质，它们在稻瘟菌诱导下的差异表达可能与水稻抵御稻瘟菌的感染有关。

这些差异表达蛋白质的发现将为探究水稻与稻瘟菌互作的分子机理提供重要的线索，并为水稻抗病育种提供基础理论支持。

结论：本研究旨在通过使用蛋白质组学技术，研究稻瘟菌激发子诱导水稻蛋白差异表达的情况，以期从分子水平探究水稻抵御稻瘟菌的机理，为水稻抗病育种提供理论支持和指导。

《稻瘟病新抗性基因Pi39的功能研究》一、引言稻瘟病是一种严重的农作物病害，给全球稻谷生产带来巨大损失。

抗性基因的发掘与利用对于提升稻种抗病能力，降低稻瘟病带来的危害具有极其重要的意义。

近年来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的抗性基因被成功克隆并应用于水稻育种中。

本文旨在研究新发现的抗性基因Pi39的功能，以期为稻瘟病的防治提供新的理论依据和技术支持。

二、材料与方法1. 材料本研究采用的水稻材料为粳稻品种，其中包括含有Pi39基因的转基因株系和野生型对照株系。

稻瘟病病原菌菌株选用当地常见的高致病力菌株。

2. 方法（1）基因克隆与序列分析：采用PCR扩增、Sanger测序等技术，克隆出Pi39基因的序列，并进行序列分析。

（2）转基因株系的构建与鉴定：通过农杆菌介导的遗传转化法，将Pi39基因导入粳稻品种中，获得转基因株系。

通过PCR 和Southern blot等方法鉴定转基因株系。

（3）抗病性鉴定：采用人工接种法，将稻瘟病病原菌接种到转基因株系和野生型对照株系上，观察并记录发病情况，评估抗病性。

（4）基因表达分析：采用实时荧光定量PCR技术，分析Pi39基因在不同组织、不同发育阶段的表达情况，以及在抗病过程中的表达模式。

三、结果与分析1. Pi39基因的克隆与序列分析通过PCR扩增和Sanger测序等技术，成功克隆出Pi39基因的序列。

序列分析表明，Pi39基因编码一个NBS-LRR类抗病蛋白，具有典型的抗病基因结构特征。

2. 转基因株系的构建与鉴定通过农杆菌介导的遗传转化法，成功将Pi39基因导入粳稻品种中，获得转基因株系。

PCR和Southern blot鉴定结果表明，转基因株系中成功插入了Pi39基因。

3. 抗病性鉴定人工接种法结果表明，转基因株系对稻瘟病的抗性明显高于野生型对照株系。

在相同环境下，转基因株系的发病程度较轻，病斑数量和面积均显著减少。

这表明Pi39基因在提高水稻抗稻瘟病方面具有重要作用。

Ａｎｎ ｔ ｔｏ ｎ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｎａ ｙ ｉ ｆ ａ ｎ ｖ ｌｎ ｇ ｎｅ ｏ ａ ｉ ｎ ａ ｄ ｘ ｅ ｓｏ ａ ｌ ｓｓ ｏ ｏ ｅ ｎｉ ｅ
ｉ ａ ｎ ｐｏ ｔ ｅｏ ｙ ａ ｓ ｌ ｔ Ｊ １ ７ ｎ Ｍ ｇ ａ ｒｈ ｒ ｚ ｅ ｉｏ ａｅ Ｆ ８ ２ ８
Ｚ ＨＡＩＨｕ ｎ ｃ ｅ Ｉ ａ ． ｈ ｎ ，Ｌ ＡＮ Ｂｉ ，Ｗ ＡＮＧ Ｘｉ ｇ ｘ ｎ 。 ＷＡＮＧ ａ ．ｕ ３ Ｌ ｏ ｄ ｎ ｎ ．ｉｇ ， Ｂ ｏｈ ａ ， Ｕ Ｇｕ ． ｏ ｇ ，Ｗ ＡＮＧ Ｚ ｎ ． ｕ ｏ ｇｈ ａ ｔ
（ ． ｏ ｅｅｏ ｉ ｃｅｃｓ ２ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｏ ｕｅ ｄＩ ｏｍａｏ ； ． ｏ ｅｅｏ ｌ ｔ ｒｔ ｔ ｎ Ｉ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｆ Ｓｉｎｅ； ． ｏ ｅｅｏ ｍｐｔ ａ ｆｒ ｔ ｎ ３ Ｃ ｌ ｇ ｆ ａ ｏｅ ｉ 。 ｌ Ｌｅ Ｃ ｒｎ ｎ ｉ Ｐ ｎ Ｐ ｃｏ
合蛋白结构域． 稻瘟病菌中的Ｈ ｂ ｓ Ａ蛋白聚集于系统发育树的同一个大的分支上， 说明它们具有较近的亲缘关系． 转录组和
Ｅ Ｔ数据库 中 Ｈ ｂ Ｓ ｓＡ的表达情况不 同， 但在菌株 Ｇ ＹＩ 侵染 阶段基 因芯片中均表现为上调． Ｕ １ 实时定量 Ｐ Ｒ分析表明 ， ｌ － Ｃ Ｍｏｌ ｓ
在菌株 Ｆ８２８ 同生长 发育 阶段 均有 表达 ， 附着胞 阶段 表达置相对 较高 ， Ｊ１７ 不 但在 推测该 基 因与附着胞 的形 成相关． 研究
福建农林大学学报 （ 然科学版 ） 自
Ｊｕｎｌ ｆ ｕｉ ｇｉ ｌ ｒ ｎ ｏ ｓ ｙＵ ｉ ｒｉ Ｎ ｔ ａ Ｓ ｉ ｃ ｄｔ ｎ ｏｒａ ｏ ｊ ｎＡ ｒ ｕｔ ｅａｄＦ ｒ ｔ ｎ ｅｓｙ（ ａ ｒｌ ｃ ｎｅＥ ｉｏ ） Ｆ ａ ｃ ｕ ｅ ｒ ｖ ｔ ｕ ｅ ｉ

稻瘟病菌Mofbox基因缺失突变体构建及生物学表型分析喻海峰;高飞;朱小蕾;高智谋;郭敏
【期刊名称】《安徽农业大学学报》
【年(卷),期】2013(40)5
【摘要】采用啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)F-box蛋白的氨基酸序列对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)全基因组数据库进行Blastp分析,找到一个与之同源的、具有典型F-box结构域的蛋白编码基因,命名为Mofbox。

采用同源重组原理,将构建的基因敲除载体转化稻瘟病菌,获得该基因缺失突变体2个。

研究表明,在稻瘟病菌中,Mofbox缺失后可导致稻瘟病菌生长速率显著下降,分生孢子产孢量和附着胞形成率显著降低,对外源过氧化氢敏感,改变细胞壁完整性,同时降低对大麦和水稻敏感品种CO-39的致病性。

【总页数】7页(P751-757)
【作者】喻海峰;高飞;朱小蕾;高智谋;郭敏
【作者单位】安徽农业大学植物保护学院
【正文语种】中文
【中图分类】S435.111.41
【相关文献】
1.粗糙脉孢菌中几丁质合酶1缺失突变体的构建及表型分析
2.鱼腥蓝细菌
PCC7120 alr3504基因缺失突变体的构建及表型分析3.野油菜黄单胞菌8004菌株hrp基因簇侧翼序列大片段缺失突变体的构建及表型分析4.大豆快生根瘤菌
SfHH103＿03182基因突变体的构建和共生固氮表型分析5.尖孢镰刀菌粘团专化型线粒体外膜转运酶亚基Tom7基因敲除突变体的构建与表型分析
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ａ ｉ — ｐ ｉ ｎ ｇ ， Ｄ Ｕ Ｘ ｉ ｎ — ｆ ａ ， Ｓ Ｕ Ｎ Ｇ ｕ ｏ － ｃ ｈ ａ ｎ ｇ
（ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｐ ｌ ａ ｎ ｔ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ｎ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｎ ａ ｎ ｇ ２ １ ０ ０ ９ ５ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｐ ｌ ａ ｎ ｔ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｚ ｈ ｅ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍ ｙ ｆ ｏ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｈ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ３ １ ０ ０ ２ １ ， Ｃ ｈ ｉ ａ） ｎ
浙江农业学报 Ａ ｃ ｔ ａ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｈ ｕ ｒ ａ ｅ Ｚ ｈ ｅ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ ， ２ ０ １ ３ ， ２ ５ （ ３ ） ： ５ ２ ６ － ５ ３ ２
ｈ ｔ ｔ ｐ ： ／ ／ ｗ ｗ ｗ ． ￣ ｎ ｙ ｘ ｂ ． ｃ ¨
穆慧敏 ， 姜华 ， 毛雪琴 ， 等．Ｐ 耽 基 因家族在稻瘟病菌中的分布及变异初探 ［ Ｊ ］ ． 浙江农业学报 ， ２ ０ １ ３ ， ２ ５ （ ３ ） ： ５ ２ ６ ． ５ ３ ２ ．
关键词 ： 稻瘟病 菌 ； Ｐ Ｗ Ｌ基因家族 ； 变异 中图分 类号 ： Ｓ ４ ３ ５ ． １ １ １ ． ４ １ 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ４ — １ ５ ２ ４ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ － ０ ５ ２ ６ － ０ ７

图１．２＾正ｇｒ妇ｅａ与Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ的主要信号途径（Ｄｅａｎｅｔａ１．，２００５１Ｆｉｇ．１。

２ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｍａｊｏｒｓｉｇｎａＵｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｂｅｔｗｅｅｎ曼ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅａｎｄ膨ｇｒｉｓｅａ．红色字体表示稻瘟病菌Ｍｇｒｉｓｅａ中已分离的基因；黑色字体是Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中的基因。

基因外框颜色表示该蛋白在Ｍｇｒｉｓｅａ与Ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ之间的保守程度（蓝色：ｅ－ｖａｌｕｅ‘１ｘ１０－１０；橘色：ｅ－ｖａｌｕｅ＞ｌ×１０－１０。

椭圆形表示该蛋白为Ｍｇｒｉｓｅａ致病所必需。

具黑色边框的椭圆型表示该蛋自在Ｍｇｒ妇ｅａ中存在，但置ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中未发现或不在其信号１．２．３附着胞成熟过程中的功能基因成熟的附着胞细胞壁积累大量的黑色素，有效的阻止内容物的渗出；内部积累大量的甘油，产生强大的渗透压，为侵入提供能量（ＤｅＪｏｎｇｅｔａｌ．，１９９７）。

附着孢的成熟离不开黑色素与甘油的合成。

１．２－３．１黑色素合成相关基因３个黑色素生物合成基因（ＡＬＢＩ，ＲＳＬｌ和ＢＵＦｌ）的克隆从分子生物学角度证明了黑色素层对于附着胞功能的重要性（Ｃｈｕｍｌｅｙｅｔａｌ．，１９９０）。

这些基因２ｌ浙江大学硕士学位论文Ｙｏｒｉｍｉｔｓｕａｎｄｌ（１ｉｏｎｓｋｙ，２００５图２．１细胞自噬的诱导复合体注：白色的圈是Ｃｖｔ途径，灰色的圈是细胞自噬途径Ｆｉｇ．２．ｉＲｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｏｌｎ＃ｅｘｆｏｒａｕｔｅｐｈａｇｙｉｎｄｕｃｔｉｏｎＮｏｔｅ，ＴｈｅＣｖｔｐａｔｈｗａｙ恤ｗｈｉｔｅｃｉｒｃｌｅｓ）ａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙ（ｉｎｄａｒｋｇｒａｙｃｉｒｃｌｅ）表２．１高等真核生物体中存在的酵母细胞自噬基因的同源基因Ｔａｂｌｅ２．１ＯｒｔｈｏｌｏｇｓｏｆＹｅａｓｔＡｕｔｏｐｈａｇｙ－ＲｅｌａｔｅｄＧｅｎｅｓｉｎＨｉｇｈｅｒＥｕｋａｒｙｏｔｅｓ（ＬｅｖｍｅａｎｄＫｌｉｏｎｓｋｙ，２００，）Ｏｒｔｈｏｌｏ掣ｏｆＹｅａｓｔＡｎｔｏｐｈａｇｙ·ＲｅｌａｔｅｄＧｅｎｅｓｉｎｍ＃ｅｒＥｕｋａｒｙｏｔｃｓＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎａｔｉｏｎＡ丁６ＡｔＣｅ蹦Ｄｍ１１５ＡＴＧｌｔ札．５ｌＤｄＡＴＧｌＡ１７Ｇ３ＤｒＡＵＴｌｈＡＰＧ３缸Ｇ４Ａ７研＾硒６Ｄ也ｎＧＳｂｅｃ－１ＤｄＡ硒ＡＰＧ４ｌＡＵ盹ＡＰＧ４ＢｈＡＰＧ５ＡＰＧ５ｂｅｃｌｉｎ１ｂｅｃｌｉｎｌＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＥ２．１ｉｋｅｅｎｚｙｒａ，ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓＰＥ，。

张金霞，张倩倩，王书玉，等．９４份水稻骨干材料抗稻瘟病基因和恢复基因的分子检测与分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２４，５２（５）：５８－６４．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２４．０５．００８９４份水稻骨干材料抗稻瘟病基因和恢复基因的分子检测与分析张金霞，张倩倩，王书玉，刘贺梅，孙建权，胡秀明，殷春渊，王和乐，张玉红（新乡市农业科学院，河南新乡４５３００２） 摘要：为明确６个抗稻瘟病基因（Ｐｉｔａ、Ｐｉ５４、Ｐｉａ、Ｐｉｂ、Ｐｉｋｍ、Ｐｉｋｈ）和１个恢复基因（Ｒｆ１ａ）在水稻骨干材料及新品系中的基因型和分布情况，从而为今后抗稻瘟病基因和恢复基因的合理利用及分子标记辅助育种提供依据，利用６对扩增条带清晰、稳定的抗稻瘟病基因特异性分子标记对４８份水稻品系的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，利用恢复基因分子标记Ｒｆ１ａ对４６份外引及自育恢复系材料进行检测。

结果表明，在４８份水稻骨干材料及品系中，单个种质携带的抗稻瘟病基因为１～６个，携带４个抗稻瘟病基因的品系最多，占总数的３３．３３％，其次为携带３个（２２．９２％）、２个（１８．７５％）抗稻瘟病基因的品系，携带６个抗稻瘟病基因的种质资源最少（４．１７％）；６个抗稻瘟病基因在４８份水稻种质中的分布差异较大，Ｐｉｂ、Ｐｉｋｈ、Ｐｉ５４在供试粳稻中的分布最广泛，分布频率分别达到７７．０８％、６４．５８％、６２．５０％，其次为Ｐｉｔａ、Ｐｉｋｍ、Ｐｉａ，分布频率分别为４７．９２％、４１．６７％、３３．３３％；４８份水稻种质共有抗稻瘟病基因组合２２个，其中组合Ｐｉａ＋Ｐｉ５４＋Ｐｉｋｈ＋Ｐｉｂ和组合Ｐｉ５４＋Ｐｉｋｈ＋Ｐｉｂ的水稻材料数量最多（各６份）。

在４６份外引及自育恢复系材料中，携带恢复基因Ｒｆ１ａ的占９３．４８％。

通过分子标记手段明确了相关种质的抗稻瘟病基因类型，为抗稻瘟病和恢复系新品系的选育及亲本组配提供了较好的遗传信息。

关键词：水稻；骨干材料；抗稻瘟病基因；恢复基因 中图分类号：Ｓ４３５．１１１．４＋１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２４）０５－００５８－０６收稿日期：２０２３－０４－２７基金项目：河南省科技攻关计划（编号：２３２１０２１１０２５６）；河南省现代农业产业技术体系建设专项（编号：ＨＡＲＳ－２２－０３－Ｇ１）；新乡市重大科技专项（编号：２２ＺＤ００１）。

水稻抗稻瘟病性状的QTL定位分析水稻抗稻瘟病性状的QTL定位分析摘要：水稻瘟病是全球范围内最严重的水稻病害之一，严重影响着水稻的产量和品质。

本研究旨在通过QTL定位分析方法，探讨水稻抗稻瘟病性状的遗传基础和分子机制。

通过杂交育种方法选育出一组F1群体，并进行人工接种稻瘟菌的鉴定。

随后，采用高密度基因组分子标记技术，对产量和抗病性状进行检测和分析。

结果显示，水稻抗稻瘟病性状存在一定的遗传多样性，且与多个QTL位点有关。

进一步的基因功能分析揭示了许多候选基因的作用机制，为进一步研究水稻抗病性状的分子机制提供了理论依据。

关键词：水稻瘟病；抗性；QTL；基因功能1. 引言水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的粮食作物之一，也是全球人口最多的主要粮食来源。

然而，水稻瘟病是一种严重威胁水稻产量和质量的病害，由稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）引起。

稻瘟菌感染水稻叶片，会导致叶斑、白叶尖和穗部发倒等症状，最终导致水稻减产甚至死亡。

因此，研究水稻抗稻瘟病性状的遗传基础和分子机制，对于培育抗病品种和提高水稻产量具有重要意义。

2. 实验材料与方法本研究选用耐病亲本A和感病亲本B进行杂交育种，得到一组F1群体。

通过PCR和酶切等方法，对F1群体进行稻瘟菌的鉴定和筛选。

根据抗瘟菌性状进行分组，选取抗性和感性极端群体进行QTL定位分析。

3. 结果通过对F1群体进行鉴定和筛选，得到了一组既能抗稻瘟病又具有高产性状的杂交水稻。

采用高密度基因组分子标记技术，检测和分析了这组水稻的产量和抗病性状。

结果显示，水稻抗稻瘟病性状存在一定的遗传多样性，同时与多个QTL位点有关。

这些QTL位点在不同环境和遗传背景下显示不同程度的表达，表明水稻抗稻瘟病性状的遗传基础较为复杂。

4. 讨论本研究发现，水稻抗稻瘟病性状的遗传基础主要由多个QTL位点控制。

其中，一些重要的QTL位点在多个不同的基因组区域分布，说明不同基因的相互作用和调控对于水稻抗病性状的发挥至关重要。

宁夏水稻抗稻瘟病性的聚类分析
李培富;李冬
【期刊名称】《宁夏农林科技》
【年(卷),期】2007(000)002
【摘要】80年代后期，有些学者应用聚类分析方法对水稻品种的抗瘟性进行研究。

本文则应用聚类分析方法，根据品种抗性表型的相似程度，对宁夏水稻供试品种的抗瘟性进行分类，以利于正确评价品种的抗病性及合理利用抗性品种。

【总页数】3页(P40-41,68)
【作者】李培富;李冬
【作者单位】宁夏大学农学院,宁夏,银川,750021;宁夏农林科学院种质所
【正文语种】中文
【中图分类】S511;S11+7
【相关文献】
1.宁夏水稻品种抗稻瘟病基因Pi－ta、Pi－b和Pi9的检测分析 [J], 张银霞;张敏;田蕾;杨淑琴;李培富
2.宁夏水稻主栽品种抗稻瘟病性鉴定研究 [J], 李培富;任斌;贾龙;梁瑛
3.宁夏水稻抗源品种(系)抗稻瘟病基因型分析(二) [J], 李华;王国珍;茹庆华
4.宁夏水稻抗稻瘟病育种存在的问题及鉴定方法的探讨 [J], 顾才东;李华
5.宁夏水稻种质资源主要抗稻瘟病基因的鉴定和评价 [J], 张银霞;沈文娟;韩雪琴;
张振海;田蕾;杨淑琴;罗成科;李培富
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黑龙江省水稻稻瘟病菌致病性分化与RAPD分析的开题报告一、研究背景和意义水稻稻瘟病是水稻上发生频率极高的一种病害，严重影响水稻产量和品质。

稻瘟病菌是引起水稻稻瘟病的病原体，它的致病性不同，引起的水稻病情也不同。

因此，对稻瘟病菌致病性的研究具有重要的理论和实际意义。

同时，研究稻瘟病菌的分化情况，能够为水稻病害的防治提供科学依据。

基于传统的病原学和形态学研究方法已经不能满足对稻瘟病菌的研究要求。

而分子标记技术已成为研究微生物分子分化和进化的重要手段之一。

RAPD是随机扩增多态性DNA技术的缩写，它可以快速简便地获取大量的分子标记信息，被广泛应用于微生物分类和鉴定中。

因此，本研究将采用RAPD技术，研究黑龙江省不同来源的水稻稻瘟病菌致病性分化情况，为该病的防治提供科学依据。

二、研究内容和方法1. 稻瘟病菌的来源本研究将从黑龙江省不同地区采集水稻稻瘟病菌，共计10份，分别于不同温度下培养，分离、纯化后保存。

2. 稻瘟病菌的致病性测定将收集到的稻瘟病菌样品粉碎后与稻子苗草浸液混合，接种于水稻品种杂交优8118，培养30天后进行病情评估。

评估标准为：病情1-5级，其中5级为极重度。

3. RAPD-PCR扩增和分析将收集到的稻瘟病菌样品进行DNA提取，PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式进行分子标记的检测与分析，获得RAPD图谱，并进行数据处理、聚类分析等。

三、预期研究结果通过本研究，预计可以在RAPD图谱上检测到稻瘟病菌的遗传多样性，获得不同地区稻瘟病菌的遗传分化情况，掌握其遗传与致病性之间的相互关系。

为稻瘟病的分子生物学和遗传进化研究提供有用的信息。

收稿日期：2023-10-26基金项目：广东省重点领域研发计划（2021B0707010006，2022B020*******）；广东省现代农业产业技术体系专项（2023KJ105）；广东省乡村振兴战略专项（2022-NPY-00-001）；广东省水稻育种新技术重点实验室项目（2020B1212060047）；广东省农业科学院中青年学科带头人（金颖之星）培养项目（R2023PY-JX003）作者简介：巫浩翔（1994-），男，硕士，研究实习员，研究方向水稻病理及抗病育种，E-mail：*************通信作者：何秀英（1974-），女，博士，研究员，研究方向为水稻遗传育种，E-mail：******************广东农业科学2023，50（12）：52-61Guangdong Agricultural SciencesDOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.12.005巫浩翔，陆展华，方志强，陈浩，王石光，王晓飞，刘 维，何秀英. 稻瘟病菌效应蛋白与水稻互作研究现状及展望［J］. 广东农业科学，2023，50（12）：52-61.稻瘟病菌效应蛋白与水稻互作研究现状及展望巫浩翔，陆展华，方志强，陈 浩，王石光，王晓飞，刘 维，何秀英〔广东省农业科学院水稻研究所/农业农村部华南优质稻遗传育种重点实验室（部省共建）/广东省水稻育种新技术重点实验室，广东 广州 510640〕摘 要：水稻是世界上最重要的粮食作物之一，水稻安全生产关乎食品安全问题。

由稻瘟病菌引起的稻瘟病是一种世界性的真菌病害，给水稻生产造成严重损失。

相较于药物防治，抗病品种的培育与应用是控制该病害最为经济有效的方法。

然而，田间稻瘟病菌群体复杂多样、杀菌剂过量施用、气候环境变化等因素造成小种变异迅速，品种的抗性往往只能维持3~5年。

稻瘟病菌通过无毒基因的变异产生新的生理小种，逃逸或抑制水稻的免疫系统，实现侵染致病。

中国农业科学 2006,39(12):2474-2482 Scientia Agricultura Sinica收稿日期：2006-01-15；接受日期：2006-09-19 基金项目：国家自然科学基金（30471132），福建自然科学基金重点项目（B0520002） 作者简介：陈继圣（1981-），男，福建福州人，硕士研究生，研究方向为生化与分子生物学。

Tel**************；E-mail:****************。

通讯作者鲁国东（1967-），男，福建上杭人，教授，E-mail:*******************；并列通讯作者王宗华（1962-），男，福建尤溪人，研究员，研究方向为分子植物病理学。

E-mail:****************全基因组预测稻瘟菌的分泌蛋白陈继圣，郑士琴，郑 武，周 洁，鲁国东，王宗华（福建农林大学功能基因组学研究中心／福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州 350002）摘要：【目的】分泌蛋白多为病原微生物与植物受体蛋白起作用的激发子和其它致病因子，深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制。

利用稻瘟菌基因组学研究成果，结合计算机技术和生物信息学的方法，分析其分泌蛋白组学，将有助于全面掌握其致病因子的结构与功能。

【方法】利用SignalP 对稻瘟菌基因库中所有ORF 的N-端信号肽存在与否进行预测，再依次通过Protcomp、TMHMM、big-PI Predictor 和TargetP 预测程序进行验证，寻找出所有可编码信号肽的基因。

【结果】对11 108个稻瘟菌的ORF 进行分析，最终预测出共有1 235个ORF 可编码分泌蛋白。

【结论】经验证此预测方法之可靠性较高，这为深入研究分泌蛋白组学奠定了基础。

关键词：稻瘟菌；分泌蛋白；信号肽；预测程序Prediction for Secreted Proteins from Magnaporthe grisea GenomeCHEN Ji-sheng ，ZHENG Shi-qin ，ZHENG Wu ，ZHOU Jie ，LU Guo-dong ，WANG Zong-hua(The Ministry of Education Key Laboratory of Bio-Pesticide and Chemistry Biology , Functional Genomics Center ,Fujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002)Abstract: 【Objective 】Many secreted proteins of plant pathogens have been shown to be the elicitor and the pathogenetic factors in interacting with plant receptors. Pathogen were analyzed by utilizing genomic database information and computer prediction algorithms. This facilitated clarification of the molecular mechanism in the interaction between plant and plant pathogens. 【Method 】 To investigate the function of secreted proteins in Magnaporthe grisea, a set of predicted algorithms were used to predict the secreted proteins from the M.grisea genome. First, the presence or absence of an N-terminal signal peptide for all 11 108 ORFs from M.grisea were predicted by the SignalP program. In addition, all the predicted ORFs were tested by the Protcomp, TMHMM, big-PI Predictor, and TargetP programs step by step. 【Result 】 Finally, 1235 ORFs were predicted to be secreted proteins from M.grisea genome. 【Conclusion 】 The reliability of these prediction algorithms was relatively high. The results reported in this paper give the basis for further studies of the secretome of M. grisea .Key words: Magnaporthe grisea ; Secreted protein; Signal peptide; Prediction algorithm0 引言【本研究的重要意义】 稻瘟菌[Magnaporthe grisea （Hebert ）Barr.]在世界范围内危害水稻生产。

稻瘟病菌致病机理及其抗性分子标记筛选稻瘟病是水稻生产中的重要病害之一，它会对稻作产量、品质造成严重损失。

稻瘟病的病原体主要为稻瘟病菌，该菌具有强大的侵染能力，能够通过病原菌侵入水稻生长的全过程中，引发大面积的感染。

稻瘟病菌的致病机理是引起水稻叶片病斑的同时，还能够深入到水稻茎部和穗部，导致谷粒变软、萎缩。

为了保障水稻生产，掌握稻瘟病菌的致病机理及其抗性分子标记筛选非常重要。

一、稻瘟病菌的致病机理稻瘟病菌是属于接合菌门真菌，其病原菌最初寄生在水稻茎部的正常细胞、衰老细胞和创伤细胞上，在水稻生长过程中，稻瘟病菌通过诸多途径侵入水稻细胞内，在感染后，稻瘟病菌开始快速繁殖并分泌蘑菇碱和玉米素，这两种物质无法被水稻代谢，会影响水稻的细胞分化和生长。

稻瘟病菌在侵入水稻细胞后会产生毒素，这些毒素对水稻的细胞壁进行破坏，导致组织液外泄、细胞质中的液泡破裂，使叶片出现病斑和褪绿现象等。

另外，稻瘟病菌会侵入水稻茎部和穗部，使谷粒变软、萎缩，从而影响水稻的产量和品质。

二、稻瘟病菌抗性基因的筛选随着基因测序技术的提高，我们能够更好地研究水稻抗病基因的分布和功能。

其中，NRPI（nucleotide-binding leucine-rich repeat proteins）基因家族是水稻的一大抗病基因家族，其内部编码的蛋白质与水稻的抗病反应密切相关。

通过基因克隆和功能验证，研究人员发现，水稻中一些NRPI基因具有很强的抗稻瘟病菌的能力，这些基因可以识别稻瘟病菌中的 PAMPs（pathogen-associated molecular patterns，病原相关分子体），从而诱导水稻PAMPs（pathogen-associated molecular patterns，病原相关分子体）-dependent基因表达。

通过RNA-seq技术，研究者找到了一系列水稻抗病基因，这些基因具有启动、抑制抗病反应的能力。

利用基因编辑技术CRISPR/Cas9对水稻NRPI基因家族中的一些关键基因进行编辑，可以增强水稻对稻瘟病的抗性，这一技术极有可能成为未来水稻瘟病抗性基因研究的一个重要技术。