第三章细胞破碎讲课讲稿

主要内容
3.1 细胞壁的组成与结构 3.2 细胞破碎技术的分类 3.3 常用破碎技术 3.4 破碎技术的发展方向 3.5 破碎率的测定
3.1 细胞壁的组成与结构
微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞
免受机械损伤的功能； 细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控
制胞内外一些物质的交换渗透作用。 细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。
细菌的细胞壁
几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固骨架肽聚糖组 成。
G+细胞壁结构与G-有很大不同。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，
其网结构的致密程度和强度取决于肽聚糖上所存 在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度 大，则网结构就致密。
3.3 常用破碎技术
珠磨法(bead mill)——实验常用 高压匀浆法(High-pressure homogenization)---
大规模细胞破碎的常用方法 超声破碎（Ultrasonication）---主要用于实验室 x-press法 酶溶法——研究较广的一种方法
化学渗透法 其它方法
影响超声波破碎效率的参数:
(1)、振幅 振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的Байду номын сангаас速度
k。 (2)、细胞悬浮液的粘度 粘度影响能耗并会抑制空穴现象。
(3)、表面张力 添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质
(如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。 因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性
此法称为X—Press法或Hughes press法，主要 用于实验室中。
影响因素： 高浓度的细胞、低温、高的平均压力能促进破碎。
优缺点： 适用范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低、 活性保留率高，但是，该法对冷冻—融解敏感的 生化物质不适用。
和空穴清除，特别是应用高的功率时。 (4)、被处理悬浮液的体积 大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。
(5)、珠粒的体积和直径 添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴
的形成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，从 而提高破碎效率。 在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，k 存在最大值。
浓度及菌种类型等因素有关。
超声破碎的适用性：
细胞种类：杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细 胞比革兰氏阳性细胞较易破碎，对酵母菌的效果 较差。
超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常在 冷却条件下进行。小规模实验常采用间歇操作， 大规模生产受限制。
超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性 物质失活，因而有一定的局限性。
（inclusion body）。
大、中、小型高压匀浆器
超声破碎
（Ultrasonication）---主要用于实验室 破碎机理：可能与空化现象（Cavitation
phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。 通常采用的超声破碎机在15～25KHz的频率下操
作。 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞
西德生产的容量20L的LM-20型珠磨机
胶体磨
德国进口珠磨机
除磨室以夹套冷却外，搅拌轴和圆盘也可以冷却， 圆盘交错地装在轴上，一种处于径向，另一种和 轴倾斜，径向圆盘使磨料沿径向运动，而倾斜圆 盘使产生铀内运动。这种交错的运动，提高了破 碎效率。
细胞破碎率可用一级反应动力学表示： 间歇操作： ln[1/(1-R)]=Kt 连续操作： ln[1/(1-R)]=Kτ 其中τ=V/F
酵母菌的细胞壁
主要成分：葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比 革兰氏阳性菌稍厚，面包酵母的细胞壁厚度约为 70 nm，而且其厚度随菌龄增加而增加。有可能 仅有一部分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重 要作用。
结构：最里层是由葡聚糖的 细纤维组成，它构成了细胞 壁的刚性骨架，使细胞具有 一定的形状，中间是一层糖 蛋白，再外面是网状结构的 甘露聚糖。
珠磨法
bead mill——实验常用 工作原理：细胞悬浮液与极细的珠子(玻璃、石英砂、
氧化铝等研磨剂，直径＜1mm)一起快速搅拌或研磨， 研磨剂珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破 碎，释放出内含物。
实验室规模：Mickle高速组织捣碎机、Braun匀 浆器；
中试规模：胶质磨； 工业规模：高速珠磨机(High-speed bead mill)
高压匀浆 法
超声破碎
法
固体剪切作用
液体剪切作用 液体剪切作用
可达较高破碎率，可较大规模操作， 大分子目的产物易失活，浆液分离困
难 可达较高破碎率，可大规模操作，不
适合丝状菌和革兰氏阳性菌 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧
烈，不适合大规模操作
X-press 法
酶溶法
固体剪切作用 酶分解作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏 感目的产物不适合
破碎的动力学方程：
式中： KT—与温度等有关的破碎常数 N—悬浮液通过匀浆器的次数 P—操作压力 a—微生物种类常数
破碎压力的选择：
增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，但 当压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损较大， 此外当压力超过一定值后，破碎率的增加很慢。
在工业生产中，通常采用的压力为55～70 MPa。
活
几种细胞破碎方式的比较
机械破碎 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。 珠磨法、挤压法、匀浆法、超声法。 物理破碎 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层
结构破坏，而使细胞破碎。 温度差破碎法、压力差破碎法。
化学破碎 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破
碎。 有机溶剂、表面活性剂、酸碱。 酶促破碎 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，
(7)、细胞悬浮液的流速 在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停
留时间，并影响破碎的总收率。
超声波破碎在实验室广泛应用，但在工业范围中 还未采用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中 通入足够的能量是很困难的。
X-press法
将浓缩的菌体悬浮液冷却至－25℃至－30℃形成 冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细 胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体 的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。
它可能对某些需要的分子带来破坏性影响，但对 破碎细胞毫无影响。 可通过添加游离基清除剂如胱氨酸或谷胱甘肽， 或者用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。
连续超声波破碎的实验室装置
由一个带夹套的烧杯组成，其形状和尺寸会影响 悬浮液的流体动力学。对于刚性细胞可以添加细 小的珠粒，产生辅助的研磨效应。超声波反应器 内，有四根内环管，由于声波振荡能量会泵送悬 浮液循环，用插入进出口管到内部烧杯去的方法， 就可以实现连续操作。
细胞壁的组成与结构
细胞壁的结构和细胞破碎
破碎时必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。 细胞的大小和形状以及聚合物的交联程度都是影
响破碎难易程度的重要因素。 壁结构不仅取决于遗传信息也取决于生长环境，
真菌的壁结构还随发酵罐中混合的机械作用而变 化。
虽然通过改变遗传密码或环境因素能够改变细胞 壁的结构，但还没有实验证明，该法能提高对机 械破碎的敏感性，也不能够预测各种微生物对机 械破碎的相对阻力。
阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米， 高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改 变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化， 从而造成细胞破碎。
出口
进口
阀座
阀杆 撞击环 阀杆
压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构简图
具有高度专一性，条件温和，浆液易 分离，溶酶价格高，通用性差
非 机 械
化学渗透 法
渗透压法
法 冻结融化
法
干燥法
改变细胞膜的渗 透性
渗透压剧烈改变 反复冻结-融化
改变细胞膜渗透 性
具一定选择性，浆液易分离，但释放 率较低，通用性差
破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的
产物 条件变化剧烈，易引起大分子物质失
使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。 外加酶制剂法、自溶法
影响破碎难易程度的重要因素
机械法—细胞的大小和形状、细胞壁厚度、聚合 物交联程度。显然，细胞个体小、球形、壁厚、 聚合物交联程度高是最难破碎的。（破碎细胞）
非机械法—细胞壁、膜的组成和结构。了解细胞 壁的组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化学 试剂，以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确 定其使用的顺序。 （溶解壁膜上的某些组成—打洞）
工业规模：高速珠 磨机。 圆盘高速旋转，使 细胞悬液和玻璃珠 相互搅动，细胞破 碎是由剪切力层之 间的碰撞和磨料的 滚动而引起。
典型的珠磨机的构造
瑞士：Dyno Mill。 磨室具夹套，可冷
却。在料液的出口 处有一旋转的圆盘 和出口平板（出口 位于平板的中部） 很靠近，可防止珠 体随料液带出。
破碎一般规律： （1）酵母较细菌难破碎； （2）处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的
细胞难破碎； （3）在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培
养基上培养的细胞较难破碎。
不宜采用高压匀浆法破碎的有： （1）易造成堵塞的团状或丝状真菌， （2）较小的革兰氏阳性菌， （3）某些质地坚硬的亚细胞如包含体
破碎阻力主要决定于壁结构 交联的紧密度和壁厚度
其他真菌的细胞壁
大多数真菌的细胞壁主要由多糖组成，其次还含 有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁 的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁 是由几丁质和葡聚糖构成。
真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不 仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构， 所以强度有所提高。
(6)、探头的形状和材料
对于一个能级恒定的功率，探头的振幅与其面积 成反比，然而对于小直径的探头，声能限制在较 小的区域并且效率低。特别是当悬浮液的体积小 的时候，能量在探头嘴附近被悬浮液吸收，强烈 的涡流会变小。对于大的探头，声能消耗在大范 围上，结果则使振幅更小。