当前位置：文档之家 › PCR难题详细解析

PCR难题详细解析

  • 格式：docx
  • 大小：135.89 KB
  • 文档页数：3

1 / 3
PCR难题详细解析
1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需

在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种
不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个( )

图1

图2
A．2 B．4
C．6 D．8
解析：选D PCR技术扩增时，由两种引物决定所扩增的片段的特定序列，上一次循环的产物为下一
次循环的模板。第一次循环形成①和②，第二次循环形成①②③④四个DNA，以此类推4次循环后共形成
16个DNA，其中①②各一个，③④各三个，⑤共8个。方法：可画出前2次循环的产物的示意图，再找规
律。
2、为研究基因A与四膜虫的耐药性是否有关，科研人员提取耐药个体的DNA，用图2所示的引物组
合，分别扩增A基因的A1片段、A3片段。

①据图分析，用引物Ⅰ、Ⅱ组合扩增后，得到的绝大部分DNA片段是下图中的_________。
②将大量N基因片段与扩增得到的A1片段、 A3片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数
扩增产物是____________。
③回收的PCR扩增产物通过基因工程方法转入耐药四膜虫细胞中，并用加入____________的培养液筛
选，获得A基因____________的四膜虫，这种四膜虫在高浓度DDT处理下生长速率明显下降，表明A基因
2 / 3

是耐药基因。
2、答案①d（解析：引物会成为子代DNA的一部分）
②A1-N-A3 (解析：引物Ⅱ可同时和A1片段、N基因片段结合双向扩增。引物III可同时和A3片
段、N基因片段结合双向扩增。

③巴龙霉素 被敲除
3．(2016·天津高考)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。如图是以基因工

程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。

(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，使用
PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出
另一条引物的位置及扩增方向。

(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启
动子是________(填写字母，单选)。
A．人血细胞启动子 B．水稻胚乳细胞启动子
C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子
3答案：(1)总RNA(或mRNA)

(2)B
解析：(1)要想合成总cDNA，需要采集人的血液获得总RNA。由于DNA的复制只能从脱氧核苷酸单链的
5′端向3′端延伸，因而引物均应结合在DNA单链的3′端，而DNA的两条链反向平行，由此可以确定
引物在另一条脱氧核苷酸单链的位置和方向。(2)若要从水稻胚乳细胞内获得目的产物，需要控制该目的基
因只在水稻胚乳细胞内表达。由题干中的信息“启动子通常具有物种及组织特异性”可知，此处需要选择
水稻胚乳细胞启动子。
4、请回答PCR技术方面的有关问题：利用 PCR 技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似

(如下图所示)。图中引物为单链 DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物 A 的 DNA 片段所占的比例为________。
②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的 DNA 片段。
3 / 3

答案：①1516 ②三
解析：①依据图解特点，第四轮循环产物中可以得到16个DNA分子，其中有15个含引物A的单链，
以及一个不含引物A的模板链。方法：可画出前2次循环的产物的示意图，再找规律。②从图解原DNA与
引物A、B的比例关系分析，经三次复制后开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。方法：可画出前
2次循环的产物的示意图，再找规律。

合集下载

PCR常见问题及解决方案

PCR常见问题及解决方案

染的潜在风险。
AceTaq
图1. 模板适应性评价。以10 ng人胎盘总RNA进 行逆转录。将所得cDNA的1/10作为模板，分别 用Taq和AceTaqTM扩增EGFR,IFN8R,IL-8, ILGF-1, p53基因。35个循环后，取1/4 PCR产物 进行电泳。可以看出，对于中等拷贝数的IFN8R, IL-8和p53基因，热启动的AceTaqTM可极大提高 特异性和产量；对于低拷贝的EGFR和ILGF-1基 因，只有用AceTaqTM才能实现扩增。M:DNA Marker.
InnoVation in enzyme technology
September 2013 , Nan Jing
PCR技术原理及产品简介
Xu Xiaoyu, © 2013 Vazyme Biotech Co., Ltd
➢PCR原理 ➢PCR酶分类 ➢PCR酶性能 ➢反应体系与条件的优化 ➢特殊要求的PCR ➢常见问题与对策
➢离子强度（KCl , (NH4)2SO4等） 中和DNA所带电荷
➢ NH4+和K+阳离子存在于PCR缓冲液中，加强了引物的特异 性退火。
关键组分：Mg2+
➢Mg2+ 酶工作所必需的离子 与dNTPS和模板螯合在一起，成为DNA聚合酶识别的底物
➢Mg2+升高：提升扩增量，产生非特异性扩增，突变几率增加 Mg2+降低：降低扩增量，特异性增强，突变少
➢一定比例A型聚合酶与B型聚合酶的混合物 （或用具有更高核酸外切酶活性的蛋白取代B型聚合酶） ➢高扩增产量 ➢高合成长度 ➢保真性介于二者之间（ 3’5’ 外切酶活性）
A型酶
B型酶
扩增效率
高
低
合成长度
较短（<5kb） ？
PCR问题总汇及详细解决方案

PCR问题总汇及详细解决方案

PCR问题总汇及详细解决方案
PCR的影响因素很多的，尤其试剂的保存，人为的因素都很重要: 看看试剂是否有过期或保存不当，可能出现部分变质所以P不出来，换新的试剂看看
人为也很重要，冰上操作的时间，步骤等对P的效果很有影响，可找实验经验好点的人再试一试.
如果是怀疑仪器方面的问题，我觉得也有可能，可以去别的试验室借PCR仪看看是否能行.
别用自己的胶检测，用别人的胶检测试试，以前我P的很好，但是胶有问题老是扩散，后来用别人的胶试了试，非常赞.
本文针对PCR产物序列中引入了错误怎么办？PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带？如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带？对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
PCR体系是10ul的，每次PCR完了以后，管壁上有一层水气，需不需要覆盖矿务油？加多少，具体步骤应怎样？
PCR加样孔上有很亮的条带，但没有产物条带？
PCR的产量有许多因素决定他们的主次关系是什么,各因素又是怎么调节的？
PCR产物大约有900bP，哪种测序方法比较好？直接用纯化的PCR产物测序还是克隆到T载体上再测序？纯化PCR产物的方法哪种比较好？
引物间形成了比较多的二聚体，使产物很少。

这种情况该怎么处理?
为什么会产生弥散（smear）条带？如何解决？。

PCR常见问题分析(无、非特异、拖尾)之欧阳法创编

PCR常见问题分析(无、非特异、拖尾)之欧阳法创编

问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA 或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4.
降低退火温度、延长延伸时间
时间：2021.03.09 创作：欧阳法
问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低 6.循环次数过多对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP 和镁离子的浓度 6.减少循环次数问题4：假阳
性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

普通PCR常见问题及解决对策

普通PCR常见问题及解决对策

普通PCR常见问题及解决对策普通PCR常见问题及解决对策⼀、普通PCR常见问题及解决对策PCR产物的电泳检测时间⼀般为48h以内，有些最好于当⽇电泳检测，⼤于48h 后带型不规则甚致消失。

1. 假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进⾏分析研究。

1.1 模板①模板中含有杂蛋⽩质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋⽩质没有消化除净，特别是染⾊体中的组蛋⽩，④在提取制备模板时丢失过多，或吸⼊酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了⽑病，因⽽要配制有效⽽稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

1.2 酶失活需更换新酶，或新旧两种酶同时使⽤，以分析是否因酶的活性丧失或不够⽽导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴⼄锭。

1.3 引物引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物⼀条浓度⾼，⼀条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定⼀个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，⼀定要有引物条带出现，⽽且两引物带的亮度应⼤体⼀致，如⼀条引物有条带，⼀条引物⽆条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如⼀条引物亮度⾼，⼀条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应⾼浓度⼩量分装保存，防⽌多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成⼆聚体等。

1.4 Mg2+浓度Mg2+离⼦浓度对PCR扩增效率影响很⼤，浓度过⾼可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚⾄使PCR扩增失败⽽不出扩增条带。

1.5 反应体积的改变通常进⾏PCR扩增采⽤的体积为20ul、30ul、50ul。