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SiRNA序列的设计

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SiRNA序列的设计

SiRNA 序列的设计

RNAi 最后要经过 siRNA 片段与靶基因结归并使之降解，所以，保证高度同源于靶基因此绝无与

其余基因同源的 siRNA 序列，是决定 RNAi 特异性的要点所在，也是 siRNA 设计的基根源则。从拥有不一样缄默效率的 siRNA 序列中挑选出高效的 siRNA 序列，需要经过严实的设计和不停的实

验查验 [1] 。

1.1 siRNA 序列在靶基因中的地点

从靶基因开端密码子 AUG 下游 50 ～ 100 个核苷酸开始找寻理想的 siRNA 序列，越凑近靶基因的

3′端，其基因缄默成效可能越好 [2] 。从前的研究表示：不要以 5 ′非翻译区（ 5′ UTR）和 3′非翻

译区（ 3′UTR）及开端密码子邻近序列作为设计 siRNA 的模板，这些地区含有调理蛋白联合位点

(如翻译开端复合物 ) ，调理蛋白可与 RISC 竞争联合 siRNA 序列，降低 RNAi 效应 [3] ；也要避开

外显子与外显子的交界地区和单核苷酸多形性 (SNP) 地区。近来， Yokota 等发此刻 HCV( 丙型肝

炎病毒 )基因组中， 5′UTR是一个高度守旧区， 使之成为 siRNA 理想的靶点。 运用 RNAi 技术作用于

5′UTR或 3′UTR序列，相同可惹起靶基因缄默 [4,5] ，这些发现使基因功能剖析领域扩展到

5′ UTR和 3′ UTR内。

1.2 siRNA 序列的开端碱基与长度

SiRNA 序列最好为 AA(N n)UU(N 代表随意碱基； n 为碱基数量，在 19 ～ 29 nt 之间 )， NA(N n)

UU 和 NA(N n) NN 序列也能够。从前的研究表示，典型 siRNA 的三大构造特点是：长度为 21 ～

23 nt ；siRNA 双链的 3′端各有两个突出碱基； siRNA 双链的 5′端有磷酸基团。以 AA N19 标准

设计的 siRNA ，在哺乳动物细胞中 70% ～ 80% 可产生 RNAi 作用。可是一些拥有较小脱靶效应

的 siRNA 序列不是以 AA 为开端的，所以此刻不介绍以 “AA为开端 ”作为选择标准之一 [6] 。最新

研究表示 [7,8] ，27 nt 或 29 nt 的 siRNA 与 21 nt siRNA 对比：（ 1）其克制活性可提升数倍以上；

（2 ）不易于引诱扰乱素反响和激活 PKR；（ 3 ）一些基因对 21 nt siRNA 不敏感，可是能够被 27

nt siRNA 有效的克制； （ 4）与 21 nt SiRNA 对比， 27 nt SiRNA 对靶基因的最大克制率可在相对

低的浓度下获得。此外，在选择 siRNA 序列时，要考虑到所用启动子的种类。 U6 启动子要求转

录产物的第一个碱基是 G，正反义链均这样； H1 启动子转录产物的第一位碱基为 U、G、C 均不

影响基因的缄默成效 [9] 。

1.3 siRNA 3 端突′出碱基的选择

当 siRNA 的 3′端突出碱基为 UU 时，其基因克制效率最高；可是 3′端的突出碱基不可以为 G，因

为 RNase 会降解以 G 为末端的 RNA 单链。 Elbashir 等［ 2］建议用 dTdT 代替 3′端的 2 个碱基

突出，加强 siRNA 双链复合体的稳固性。需要注意的是，因为双链 siRNA 中的正义链不参加对

靶 mRNA 的辨别，所以正义链的 3′端突出碱基能够用 dTdT 代替，可是反义链 3′端突出碱基必

需与靶 mRNA 序列相同的。

1.4 siRNA 序列中 G/ C 含量的选择

在 siRNA 序列中， G/C 含量的选择比确立以 AA 为开端的序列更重要。拥有平衡碱基含量 ( 即

G/C 含量在 30% ～ 70% ) 的序列能够作为 siRNA 候选序列； 而拥有较低 G/C 含量（ 30% ～ 52% ）

1 SiRNA序列的设计

的 siRNA 序列，其缄默基因成效较好 [10] 。

1.5 siRNA 中应防止连续的单调碱基和反向重复序列 [10,11]

因为连续 2 个以上的 G 和 C 能够降低双链 RNA 的内在稳固性，进而克制 RNAi 作用 [12] ；连续

3 个以上的 U 和 A 可能停止由 RNA Polymerase III 介导的转录 [13] 。siRNA 序列中的重复序列或

回文构造可能形成发夹状构造，这类构造的存在能够降低 siRNA 的有效浓度和缄默效率。

1.6 siRNA 双链的内在稳固性

siRNA 反义链 5’端拥有较低的热稳固性，即反义链 5’端的第一个碱基为 A 或 U；siRNA 正义链的

5’端第一个碱基为 G 或 C。因为 siRNA 解旋可能从富含 A/U 的反义链 5’端有效的开端， 有益于反

义链与 RISC 的联合，而克制正义链与 RISC 的联合 [14] 。

1.7 siRNA 正义链的碱基独爱性

以 3’端拥有 2 个碱基突出的 19 nt siRNA 为例，正义链的第一位和第十九位碱基为 A；正义链的

第十位碱基为 U；正义链的第十三位碱基不为 G；正义链的第十九位碱基不为 G 或 C 时， siRNA

序列拥有较高的基因缄默效率 [10] 。

1.8 siRNA 序列的特异性

为了保证侯选 siRNA 序列只缄默单调的靶基因 , 侯选 siRNA 序列应在美国 NCBI (National

Center for Biotechnology Information) 的 EST 或 Unigene 数据库进行 BLAST 同源性比对。当

siRNA 序列只同源于靶基因时，才能够用于下一步的基因功能研究。

1.9 可能影响 siRNA 效能的其余要素

RNA 联合蛋白的联合状况； mRNA 的二、三级构造； mRNA 的丰度、半衰期；以及所表达蛋白质的半衰期等等 [15] 也可能影响 siRNA 的效能。有研究表示，与反义技术或核酶技术不一样，在

RNAi 过程中， 靶 mRNA 的二级构造对基因缄默的成效没有太大影响 [16] 。为了使 siRNA 拥有最

大的靶向特异性，在条件同意的状况下应当尽可能的全面考虑。

1.10 设计的 siRNA 序列数量

当前没有发现 siRNA 的扰乱效率与 mRNA 中详细地点的关系，为保证对靶 mRNA 的有效克制，

针对每一个靶基因应当设计 4 条以上 siRNA 序列，进行化学合成后，经过实验挑选出缄默效率

最高的 siRNA 序列进行下一步的基因功能研究。

需要注意的是，有的 siRNA 序列在设计时没有恪守这些指导目标，实考证明也拥有很高的扰乱

效应，这表示，我们只好依据上述指导目标设计出理论上拥有较高缄默效应的 siRNA 序列，siRNA

的最后活性需要用实验来考证 [17] 。

2 shRNA 序列的设计

2 SiRNA序列的设计

短发夹 RNA (small hairpin RNA， shRNA) 可在细胞中被加工成 siRNA。设计 shRNA 时， shRNA

中两个反向重复序列的设计原则与 siRNA 序列的设计相同， 需要要点考虑的是 shRNA 环序列的

长度及构成，并且环序列不可以与靶基因内的其余序列拥有同源性。

2.1 shRNA 环序列的长度

一般来讲， 设计 shRNA 时选择 3～ 10 nt 长度的发夹环均可。 Brummelkamp 等 [18] 建立了拥有 5

nt 、7 nt 、9 nt 环的 shRNA ，比较它们在 MCF 7 细胞中克制 CHD1 基因的成效： 9 nt 环的 shRNA

克制率达 90 ％；7 nt 环的 shRNA 只有中等的克制率； 5 nt 环的 shRNA 则无克制活性。 可是 Siolas

等[8] 报导，环序列的长度对 RNAi 效率无显然影响。

2.2 shRNA 环序列的构成

研究表示，当 shRNA 发夹环的构成为 “UUGAUAUCCG”和 “UUCAAGAGA”时拥有较高的克制效率。

当发夹环前面的序列是以 “UU”停止时，应当采用 “CCACACC”环序列 [12] 。环序列中有 2个U对

产生有效的基因克制很重要 [18] ；但环序列中不可以有连续3 个以上的 U[12] ，因为这可能致使

shRNA 转录的提早停止。

3 siRNA 阴性比较序列的设计

全部的 RNAi 试验均应建立阴性比较， siRNA 阴性比较序列的合理设计与 siRNA 序列的设计同

样重要。因为有效的比较能够充足证明 siRNA 只对靶基因产生特异性基因缄默，进而加强实验

的可信度。 阴性比较 siRNA 包含碱基错配或杂乱序列的 siRNA 。在实验中最好设计两条 siRNA 对

照序列。

3.1 碱基错配的阴性比较 siRNA

最先的研究证明，在 siRNA 双链内，一个碱基的突变就足以阻断 RNAi 过程。反义链内拥有 1～

2 个碱基错配的阴性比较 siRNA 可用于鉴识 RNAi 通路和 micro RNA 通路，因为后者是由碱基

的非精准配对惹起。近来的研究表示： siRNA 同意其分子中心部位存在单个碱基突变， siRNA 完

全失活需要大于 3 个碱基的突变 [19] ，在 Mangeot [20] 的研究中，比较 siRNA 序列中含有 6 个

精准定位的突变碱基，也证了然这点。 Kim 等 [7] 的研究表示，在 27 nt 的 siRNA 中，有 3 个碱

基错配的比较 siRNA 序列能够在不一样的浓度下阻断针对靶基因的 RNAi 过程，而单个碱基错配的

siRNA 仅在相对高的浓度下才可阻断 RNAi 过程，所以多碱基错配比单碱基错配的 siRNA 阴性对

照序列拥有更高的实质应用价值。别的，关于 RNAi 效应而言，位于 siRNA 序列中部的碱基错配

比位于 siRNA 序列尾部的碱基错配更有效。

3.2 杂乱序列的阴性比较 siRNA

根源于 siRNA 序列的杂乱序列 siRNA ，在 siRNA 实验中是一个阴性比较， 作为一个信息控制可反

映 RNAi 的特异性。杂乱序列 siRNA 与 siRNA 序列对比拥有相同的核苷酸构成，可是核苷酸次序

被打乱，相同要保证它和靶mRNA 没有同源性。

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siRNA设计原则

siRNA设计原则

8条与siRNA功能相关的原则：

1.GC含量30%-52%

2.sense链的15-19碱基中至少含有3个A/U

3.不含有反向重复序列

4.sense链的第19碱基为A

5.sense链的第3碱基为A

6.sense链的第10碱基为U

7.sense链的第19碱基不是G/C

8.sense链的第13碱基不是G

同时满足以下四点的siRNA能够达到较高的基因沉默效果：

1.antisense的5’端为A/U

2.sense的5’端为G/C

3.antisense的5’端的7个碱基中至少有5个A/U

4.siRNA序列中没有连续9个以上的GC片段

分析得到六个与基因沉默功能相关的siRNA序列特点：

1.sense链’5’与3’端的3个碱基中A/U含量不对称。

2.sense链的第1个碱基为G/C

3.sense链的第6个碱基为A

4.sense链的第19个碱基为A/U

5.sense链的第1个碱基不是U

6.sense链的第19个碱基不是G

另外，GC含量在31.6%-57.9%

文中指出，明显有效的siRNA序列需要满足3’端的3个碱基中A/U数量比5’端的3个碱基中A/U数量至少多1个，而且至少满足第2，3，4点中的两点

siRNA 使用说明

siRNA 使用说明

siRNA 使用说明

siRNA 使用说明

一、简介

siRNA（small interfering RNA，小干扰RNA）是一种短双链RNA分子，能够特异性地靶向靶标基因的mRNA，从而抑制基因的表达。本文档旨在提供有关siRNA的使用说明，包括实验准备、转染方法、验证转染效果等内容。

二、实验准备

1、设计siRNA序列：根据目标基因序列，使用专业软件设计siRNA序列，确保合适的靶向位点和抑制效果。

2、合成siRNA：选取可靠的siRNA合成公司，按照其提供的合成方案进行合成，并确保纯度和浓度的准确性。

3、存储siRNA：将合成好的siRNA按照要求进行冻干或溶解保存，避免反复冻融对siRNA的影响。

三、细胞培养

1、细胞系选择：选择适合的细胞系进行实验，一般常用的细胞系有HEK-293、HeLa、CHO等。 2、培养条件：按照细胞系的要求，配置好适合的培养基，并添加适当的血清和抗生素。

3、培养状态：维持细胞在良好的状态下生长，保持培养皿内细胞的完整和无菌。

四、siRNA转染

1、转染试剂选择：根据不同细胞系的特点，选择适合的转染试剂，如RNMAX、Lipofectamine等。

2、转染条件优化：通过实验室预实验，优化转染试剂的用量、培养时间和上清液收集时间等参数。

3、转染操作步骤：

a： 将siRNA转染试剂溶解于无血清的培养基中，按照转染试剂说明书的推荐比例进行稀释。

b： 将稀释后的转染试剂静置15-30分钟，直至形成转染试剂- siRNA复合物。

c： 将复合物滴加到细胞培养皿中，保持培养皿在37°C的培养箱中进行适当的培养时间。

d： 收集转染后的上清液，进行进一步的实验。

五、转染效果验证 1、Real-time PCR：使用逆转录酶和合适的引物进行实时荧光定量PCR，检测目标基因表达水平的变化。

2、Western blot：通过Western blot实验检测目标蛋白的表达水平是否下调。

siRNA

siRNA

Small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase

Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。

原理

siRNA原理:

RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶，具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合，形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA（与dsRNA具有同源序列）与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex

（RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。

rnai实验步骤

rnai实验步骤

rnai实验步骤

RNAi实验步骤

RNA干扰（RNAi）是一种基因沉默技术，通过RNA分子的介导，抑制特定基因的表达。RNAi技术已经成为生命科学研究中的重要工具，可以用于研究基因功能、疾病治疗等方面。本文将介绍RNAi实验的步骤。

1.设计siRNA

siRNA是RNAi技术中的重要组成部分，是一种双链RNA分子，可以介导RNAi反应。在设计siRNA时，需要选择目标基因的靶点序列，并设计合适的siRNA序列。siRNA序列应该具有一定的长度和GC含量，同时需要避免与非目标基因的序列发生杂交。目前，有许多在线工具可以帮助设计siRNA序列，如siRNA Wizard、siRNA Target Finder等。

2.合成siRNA

合成siRNA是RNAi实验的关键步骤之一。siRNA可以通过化学合成或体外转录的方式进行合成。化学合成是一种常用的方法，可以在短时间内合成大量的siRNA。体外转录则是一种更加自然的方法，可以通过RNA聚合酶在体外合成siRNA。无论采用哪种方法，合成的siRNA需要经过纯化和质量检测，确保其纯度和活性。

3.转染siRNA

转染siRNA是RNAi实验的另一个重要步骤。转染siRNA可以通过多种方式进行，如化学转染、电穿孔、病毒载体等。其中，化学转染是最常用的方法之一，可以使用多种转染试剂，如Lipofectamine、RNAiMAX等。在转染siRNA之前，需要确定最佳的转染条件，包括转染试剂的浓度、转染时间、细胞密度等。

4.检测RNAi效果

检测RNAi效果是RNAi实验的关键步骤之一。常用的检测方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光染色等。实时荧光定量PCR可以检测目标基因的mRNA水平，Western blot可以检测目标蛋白的表达水平，免疫荧光染色可以直接观察目标蛋白的表达情况。在检测RNAi效果时，需要注意对照组的设置，以确保实验结果的可靠性。