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酵母双杂交实验步骤

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LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。

质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。

在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。

分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。

二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株4. 对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

三、酵母双杂交实验的基本流程1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。

2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。

3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。

4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。

转化质粒选择培养基克隆生长情况说明(含有Gal/Raf)pLexA-Pos SD/-His，-Ura 蓝阳性对照pLexA SD/-His，-Ura 白阴性对照PlexA-X SD/-His，-Ura 白没有直接激活活性PlexA-X SD/-His，-Ura 蓝具有直接激活活性PlexA-X SD/-His，-Ura 菌落不能生长酵母细胞毒性4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。

β能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。

5. 如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。

转化质粒 SD固体培养基 LacZ表型对照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝对照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝＋pB42AD-T实验 pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测＋pB42AD-文库5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。

-半乳糖苷酶无表达。

β5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。

白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。

由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。

5-4. 将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。

6. 阳性克隆的筛选6-1. 随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coli KC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。

6-2. 如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。

最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。

7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆7-1. 将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10％-20％左右的频率随机丢失。

C孵育2-3天。

︒7-2. 将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，307-3. 再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。

7-4. 将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。

8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。

质粒1(in YM4271) 质粒2(in EGY48) LacZ表型 Leu表型pLexA pB42AD 白不能生长pLexA-靶DNA pB42AD 白不能生长pLexA pB42AD-文库白不能生长pLexA-靶DNA pB42AD-文库蓝真阳性pLexA-Lam pB42AD-文库白不能生长9. 阳性克隆的进一步筛选和确证9-1. 扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。

该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。

9-2. 将上述DNA电转化E.coli KC8宿主菌。

由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选。

因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA，酶切鉴定。

9-3. 用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。

9-4. 扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。

10. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究10-1. 用不同的双杂交系统验证10-1-1. 将载体pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。

10-1-2. 选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。

10-1-3. 将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。

-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化。

β10-1-4. 去除或突变特定结合位点，定量检测10-2. 用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。

10-3. 用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。

10-4. 进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系构建于AD载体的cDNA文库的扩增1. 自-80℃冰箱取出含有cDNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻。

2. 用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释。

lμl加入90μ3. 取稀释菌液各10 90mm)；37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr，计数平板上单克隆菌落数。

φLB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板(4. 确定待扩增的cDNA文库滴度(cfu/ml)=克隆数×108(1:106稀释)或克隆数×1010(1:108稀释)。

5. 按照>150mm)，共100块；37℃倒置培养过夜。

φ2-4×104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp 平板(6. 在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000ml LB/Amp培养液中，37℃振荡培养2-4hr。

7. 留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-80℃。

8. 其余培养菌液离心8000xg×10min，4℃收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。

LB液体培养基，121℃，15lb/in2灭菌15minA. bacto-Tryptone 10.0gB. bacto-Yeast Extract 5.0gC. NaCl 10.0gD. ddH2O → 1000 ml* LB固体培养平板为含有1.5%琼脂(Agar)LB培养基。

** LB/Amp培养基为含有Amp g/ml的LB培养基。

μ50-100构建于AD载体的cDNA文库的纯化1. 质粒DNA提取缓冲液名称缓冲液配方g/ml RNaseμP1 悬浮缓冲液 50mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA；100 AP2 裂解缓冲液 200mM NaOH；1% SDSP3 中和缓冲液 3.0M Kac(pH5.5)QBT 平衡缓冲液 750mM NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%异丙醇；0.15% Triton X-100QC 洗涤缓冲液 1.0 M NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%异丙醇QF 洗脱缓冲液 1.25 M NaCl；50mM Tris-HCl(pH8.5)；15%异丙醇2. 培养菌液离心6000xg×10min，4℃，每500ml培养物(下同)的沉淀重悬于50ml P1缓冲液。

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酵母双杂交实验流程(精)

酵母双杂交实验流程(精)

模块七蛋白质之间的相互作用1. 实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。

主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。

2. 实验原理1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。

该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。

相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。

(2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

(3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。

(4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。

(5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。

同时,酵母表型、 X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。

酵母双杂交系统也具有一定的局限性。

首先, 经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。

酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性” 。

在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。

由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使 DNA 结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。

另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域, 能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”结果。

酵母双杂交试验流程

酵母双杂交试验流程

酵母双杂交试验流程4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。

需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。

4月6号星期三（1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。

需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。

4月7号星期四（2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。

下午4点开始 8号 8点结束Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。

4月8号星期五（3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。

（4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。

（5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。

8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。

（6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。

（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。

（8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。

（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。

（10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。

酵母双杂实验操作手册和注意事项

酵母双杂实验操作手册和注意事项

酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。

很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。

这两个结构域各具功能，互不影响。

但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。

不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。

基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。

如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。

通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。

(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。

(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。

常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。

而菌株则具有相应的缺陷型。

双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。

这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。

后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。

酵母双杂交技术流程

酵母双杂交技术流程

酵母双杂交技术流程
酵母双杂交技术是一种用于鉴定蛋白质相互作用的实验方法，它可以识别某个蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用关系。

以下是酵母双杂交技术的流程：
1. 构建酵母菌株：将感兴趣的两个蛋白质编码序列分别克隆至酵母表达载体中，并插入适当的启动子和终止子后，将其转化至酵母细胞中，并筛选出正确的菌株。

2. 转化酵母菌株：将构建好的酵母菌株分别转化至两个含有互补杂交部位的酵母菌株中，使其产生可杂交的菌株。

3. 筛选正面杂交菌株：通过选择菌株在适当培养基中的生长情况或染色体特征，筛选出正面杂交的菌株。

4. 验证杂交结果：通过进一步实验验证杂交结果的准确性，例如，利用质粒转染或重组DNA重组实验等方法。

5. 鉴定蛋白质相互作用：最终确定两个蛋白质之间的相互作用关系，并进一步研究其生物学意义。

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